甜瓜细菌性叶枯病菌胶体金ICA检测试纸条的研发与应用

甜瓜(Cucumis melo)作物上会存在甜瓜细菌性叶枯病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymas)和瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)两种细菌病害,二者混合发生,症状极其相似,不易区分.为了快速、准确地在田间检测区分出两种病害,本研究利用甜瓜细菌性叶枯病菌单克隆抗体制备了免疫层析试纸条,并建立一种快速、简便地现场检测甜瓜细菌性叶枯病菌的胶体金免疫层析分析方法(immunochromatography assay, ICA).在定性检测中,本方法对甜瓜细菌性叶枯病菌的定性检测限为2.5×103cfu/mL,与细菌性果斑病菌不存在交叉反应,具有很强的特异性.在半定量检测中,甜瓜细菌性叶枯病菌在2.5× 103～1×105 cfu/mL浓度范围内,T线和C线读数的比值与甜瓜细菌性叶枯病菌浓度的对数值呈显著的线性关系,线性方程=0.392 2x-1.263 8,相关系数R2达到0.988 1.因此,本研究制备的快速、简便、经济的高特异性甜瓜细菌性叶枯病菌ICA是一种非常实用的检测方法,不仅可以在田间实时原地快速检测甜瓜细菌性叶枯病菌,同时还能与瓜类细菌性果斑病菌进行有效区分,为甜瓜等瓜类种植业的发展带来很大帮助.     

瓜类细菌性果斑病菌群体感应信号分子的检测及其对致病性的影响

瓜类细菌性果斑病是国内外西瓜和甜瓜上危害最为严重的病害之一,目前除了严格的检疫措施之外,尚无十分有效的控制措施。随着细菌群体感应（Quorum sensing,QS）系统的发现和研究进展,利用“信号干扰技术”控制植物细菌病害已经成为研究热点并取得了成功应用。本文利用生物测定技术首次从瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）检测到群体感应信号分子（AHL）,并将能够降解细菌信号分子的aiiA基因转化到瓜类细菌性果斑病菌NJF10菌株中,室内接种试验表明该转化菌株的致病性明显的减弱,证明其对果斑病菌的致病性具有调控作用。研究结果为利用信号干扰技术控制瓜类细菌性果斑病奠定了基础。     

杨桃细菌性斑点病菌的ITS序列分析及PCR检测

由丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.averrhoi)引起的杨桃(Averrhoa carambola)细菌性斑点病是杨桃生产上的重要病害.本研究利用细菌16S～23S rDNA间的内源转录间隔区(internal transcribed spacer ITS)序列通用引物Ll(5'-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3')和L2(5’-GTGCCAAGGCATCCACC-3’)扩增参试菌株的基因组DNA;并对其PCR产物进行克隆测序,经多重比对分析后设计出杨桃细菌性斑点病菌的特异性引物PsaveF(5'-CTTATCGACGACTCAGCTGCG-3’)和PsaveR(5’-TCATGCGTTGATCGTCAGGATC-3').此引物可以从杨桃细菌性斑点病菌基因组DNA中扩增出373bp的特异性片段,而其余参试的细菌无扩增条带,该引物检测的灵敏度可达10 pg,且可从自然发病的杨桃组织中扩增出特异性条带.表明该方法可以应用于杨桃细菌性斑点病的快速、灵敏、可靠的检测.此外,本研究对多种病原细菌的ITS序列进行比对分析,发现该病菌与核果树细菌性溃疡病菌Pseudomonas syringae pv.morsprunorum是近源种.该检测技术对杨桃细菌性斑点病害的控制有一定的实用意义.     

瓜类细菌性果斑病菌hpaP基因的功能分析

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,BFB)是近年来发生在西瓜、甜瓜等葫芦科(Cucurbitaceae)植物上的重要细菌病害,由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起.本研究以xjL12菌株为背景构建了转座子(Tn5)插入文库.通过注射接种哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)子叶和烟草叶片进行突变体的筛选,得到l株致病性完全丧失并失去激发烟草(Nicotiana tabacum)过敏反应的突变体△xj48.对△xj48中转座子插入基因的克隆和测序表明,其突变基因为西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的保守基因hpaP.利用基因重组技术构建了hpaP基因的突变体,发现hpaP突变后影响了xjL12菌株的游动性、生物膜的形成能力及hrcV基因的表达.hpaP基因的互补菌株部分恢复其致病力.本研究证实了果斑病菌中的hpaP基因与该细菌的致病力相关,在侵染瓜类作物的过程中起着不可缺失的作用.     

免疫捕捉PCR法检测西瓜细菌性果斑病研究

利用免疫吸附富集结合经典PCR技术建立了免疫捕捉PCR检测西瓜果斑病菌的检测法，并与直接PCR和生长检测法作了比较。结果表明，所测果斑病菌Acidovorax avenae subsp. citrulli都产生360bp左右的特异性片段，而10个不同属的对照菌株无特异性片段产生。免疫捕捉PCR检测果斑病菌的灵敏度为50-102cfu/ml，而直接PCR则在104cfu/ml，两者的灵敏度相差100倍左右。免疫捕捉PCR法对市售7种瓜种的检测发现，其中1种哈密瓜种子、2种甜瓜种子和2种西瓜种子检出果斑病菌，与人工气候箱内生长检测的发病结果基本吻合。显示了该法准确、灵敏、快速、低成本等优点。     

洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系的建立

唐菖蒲伯克霍尔德菌洋葱致病型(Burkholderia gladioli pv.alliicola),是重要的植物病原细菌检疫性有害生物.本研究的目的是建立特异、灵敏、快速的TaqMan探针荧光定量PCR方法用于检测洋葱腐烂病菌(B.gladioli pv.alliicola).利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计和筛选特异性引物和TaqMan探针,优化PCR反应体系和反应条件.荧光定量PCR菌液检测灵敏度达到1.02×102 CFU/mL,DNA检测灵敏度达到1.73×10-4 ng/μL,反应时间仅需1h左右,对14种伯克氏菌属Burkholderia)参比菌种的特异性检测结果显示,洋葱腐烂病菌具有明显的扩增曲线生长,表明建立的荧光定量PCR体系具有非常高的特异性.同时对洋葱(Allium cepa)种子进行了模拟带菌检测,结果表明,建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够检出模拟样品中的洋葱腐烂病菌,验证了检测体系的实用性.本研究建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够有效用于洋葱腐烂病菌的鉴定,为进出口口岸和基层检验检疫部门提供了一种简便、快速、准确的洋葱腐烂病菌分子检测手段.     

西瓜噬酸菌吡哆醛磷酸(VB6)营养缺陷型与致病性相关

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起的一种病害,严重为害西瓜、甜瓜的叶片和果实,造成大量减产.迄今,对该病害的研究主要集中在病原菌鉴定、病原菌检测技术、病害防治方法、品种抗病性鉴定等方面,而对病原菌的致病机理仍然知之甚少.本实验以西瓜噬酸菌xjl12菌株为背景构建转座子(mini-Tn5)插入的突变体文库,以哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)为实验材料,通过对哈密瓜种子浸种处理和子叶注射接种的方法筛选突变体,而后利用同源重组的方法获得插入突变体,并对所得的突变株及野生型、互补等各个菌株进行致病性、游动性等相关表型进行测定.研究结果表明,通过文库筛选得到的1株致病力明显下降的突变体,亚克隆鉴定可知该突变体△xj-25的Mini-Tn5插入位点为吡哆醛磷酸生物合成蛋白基因(pdxJ基因),其功能主要与吡哆醛磷酸(俗称VB6)生物合成蛋白相关.突变菌株△Pdx.J致病性显著下降,生长能力、游动性明显降低,无法正常形成鞭毛和产生生物膜.通过外源添加VB6可恢复其致病性和生长能力等主要表型.本研究证明VB6生物合成在致病性、生长能力以及鞭毛的合成等方面发挥着重要作用,为降低病原菌侵害提供了一个新的思路.     

西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛相关基因pilO及pilQ的功能分析

瓜类细菌性果斑病是发生在葫芦科植物上的一种病害,其病原为噬酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli),自报道以来已给美国、澳大利亚、巴西、中国等众多国家的瓜类作物种植业造成了严重的损失。要从根本上防治瓜类细菌性果斑病,我们应弄清其致病机制。本实验对西瓜噬酸菌(A.citrulli)中部分Ⅳ型菌毛(pili)相关基因构建插入突变体,用浸种测定法筛选出两株致病力和发病率明显减弱的突变体,鉴定为pilO及pilQ基因突变体,并对这两株突变体的相关表型进行测定。在透射电子显微镜下观测发现,野生型及pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛,而pilQ基因突变体丧失形成Ⅳ型菌毛的能力;光学显微镜下观测野生型、突变体及互补菌株的颤动能力发现,pilO及pilQ基因突变体与野生型相比,完全丧失颤动能力;同时pilO及pilQ基因突变体游动能力、生物膜形成能力也明显减弱。互补菌株中,颤动能力得到恢复,致病力、游动能力以及生物膜形成能力部分恢复。在MMX基本培养基中测定野生型与突变体的生长曲线发现,突变体菌株生长能力无明显改变;同时突变体也能激发非寄主植物烟草(Nicotiana tabacum)的过敏性反应。pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛但丧失部分Ⅳ型菌毛介导的功能,由此表明,pilO基因并不直接参与西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛的合成,而是Ⅳ型菌毛的功能基因;pilQ基因突变体不能形成Ⅳ型菌毛且丧失其介导的部分功能表明,pilQ基因在西瓜噬酸菌中直接参与Ⅳ型菌毛的合成,是Ⅳ型菌毛的合成及功能基因。同时也进一步证明西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛与其颤动性、致病性、游动性及生物膜形成能力相关。     

瓜类细菌性果斑病菌luxR基因的功能分析

luxR基因作为信号分子受体蛋白的编码基因,在革兰氏阴性菌群体感应(quorum sensing,QS)LuxI/LuxR环路中起重要作用.本研究采用PCR技术从瓜类细菌性果斑病菌(Acidovgorax avenae subsp.citrulli)xjL12中扩增出luxR同源基因,应用同源重组的方法构建了突变株(△luxR),并对其功能进行初步研究.实验结果表明,△luxR与野生型菌株相比产生的群体感应信号分子浓度降低,抗生素耐受水平有所提高,对哈密瓜(Cucuumis melo var.cantalupensis))幼苗的致病能力下降;RT-PCR实验表明,luxR基因的缺失对luxI基因的表达有抑制作用.本研究为今后对以luxR基因为靶标,利用信号干扰技术综合防治瓜类细菌性果斑病提供基础资料.     

乙烯合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)ICMP2189中克隆到了乙烯形成酶基因efe,并且在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中利用T7强启动子进行了高效表达,表达蛋白占总蛋白的45%。气相色谱分析表明,含有efe基因的大肠杆菌可以高效地产生乙烯。