水稻金属硫蛋白基因(MT2bL)启动子的克隆与表达分析

金属硫蛋白(metallothionein,MT)富含半胱氨酸,而且能够结合多种金属离子,调控细胞内金属代谢的平衡。本研究根据水稻在减数分裂期、开花期和开花后5 d的基因芯片数据结果,从水稻品种黎榆B(O.sativa L.ssp.japonica C.V.Liyu B)基因组中克隆得到了一个植物MT-2类基因Metallothionein2b-Like(Os MT2b L)的启动子序列,序列全长2 063 bp。利用植物启动子区域顺式作用元件数据库(PLACE)分析表明该启动子序列含有5个CURE(copper-response element)元件(GTAC)以及多个其它顺式作用元件。构建了多个启动子融合表达载体(p Ca MV35S::GUS,p MT2b L::GUS,p Ubi1::GUS,p CYC::GUS和p ACT1::GUS),并通过根癌农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得了转基因植株。GUS组织染色结果分析表明,Os MT2b L基因启动子在水稻幼苗期的胚根、胚芽和胚芽鞘中具有高水平的GUS表达活性,特别是在胚根根尖和胚芽顶端的GUS表达活性较高;在减数分裂期的植株叶片、颖壳和开花10 d后的未成熟种子中GUS表达活性也较高;GUS蛋白荧光定量分析结果表明,Os MT2b L基因启动子在水稻叶片中驱动GUS基因表达的活性比Ca MV35S基因启动子高出3倍以上。     

玫瑰RdGASA4-like基因启动子的分离及其在甘蓝中的瞬时表达分析

在前期的研究中,一个玫瑰RdGASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长利用同源克隆结合RACE的方法首次得到克隆。为深入了解该基因在赤霉素调控植物发育过程中的作用,通过TAIL-PCR的方法首次克隆该基因起始密码子ATG上游685bp的5’-UTR和部分启动子序列,在启动子序列分析的基础上,构建其与GUS基因融合表达载体,命名为pBI-GP685。通过农杆菌介导的方法对甘蓝外植体子叶-子叶柄进行启动子瞬时表达研究,结果表明分离得到的启动子具有启动报告基因GUS表达的活性。     

玉米PLATZ基因GRMZM2G006585启动子的克隆及表达分析

高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子，以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点，筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2 000 bp的DNA序列，命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析，发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件，初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能，构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明，该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达；转基因拟南芥单拷贝株系T₃种子中GUS活性检测结果显示，PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。     

棉花种子特异表达α球蛋白A基因启动子的功能分析

研究植物种子特异启动子具有重要的理论和实际意义。本文研究了棉花α球蛋白A基因启动子,该启动子序列全长为1640 bp,作用元件分析表明该区域除了具有核心调控序列外,还含有多个与组织特异性相关的顺式作用元件。设计其5'端构建4个不同长度的缺失、融合GUS基因的表达载体,并通过蘸花法分别转化拟南芥。转基因拟南芥GUS表达分析结果表明,该启动子能驱动GUS基因在胚、露白的种子、子叶期的幼苗中表达,而二叶期的幼苗、根、茎、莲座叶、茎生叶和花苞组织则没有表达,说明棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子。208 bp长度的启动子足以维持其种子特异表达功能,而且在启动子的-684和-208区域之间可能存在负调控元件或负调控区域。分析棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子,其基本启动子区域不长于208 bp。     

棉花种子特异表达的LEA启动子克隆及功能验证

以棉花品种新陆早33号为材料,克隆获得其胚胎发育晚期丰富蛋白LEA基因的种子特异性启动子。启动子序列全长为1228bp;作用元件分析表明该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如E-box、ABRE元件、A-box等。与已报道的棉花品种Coker 201的LEA基因D34的5'端上游调控序列1212bp相比,两者具有97%的一致性。拟南芥遗传转化的功能分析结果表明,所克隆的序列能驱动GUS基因在种子中特异表达,且GUS主要在转基因植物的种子发育后期表达;其表达强度要弱于组成型的CaMV35S启动子。研究结果不仅有助于进一步深入认识棉花LEA基因功能及其表达调控规律,也为植物遗传转化提供组织特异性的启动子。     

水稻B3转录因子OsL1的生信分析及表达模式

B3转录因子是植物特有的转录因子,与植物花形态建成、激素信号转导、种子生长发育及植物逆境胁迫响应密切相关。前期研究中,利用穗发育芯片筛选到一个OsL1基因。生物信息学分析发现,OsL1基因位于水稻4号染色体,基因全长4 262 bp,编码433个氨基酸,蛋白分子量为48.7 kD,序列比对和系统发育分析表明Os L1属于B3家族转录因子,不含信号肽剪切位点和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞核。启动子序列分析发现,该基因启动子中含有8个光响应元件及部分激素响应元件。实时PCR分析发现OsL1在水稻根、茎、叶、和穗中均有表达,其中在根和穗发育7期表达量较高,进一步克隆Os L1启动子区域,构建pCAMBIA1301-OsL1-GUS表达载体,遗传转化并鉴定获得转基因植株,The previous study在水稻根、茎、叶、和穗中均检测到了GUS信号,表明OsL1属于组成型表达。以上结果为深入研究OsL1基因在水稻生长发育过程的生物学功能提供了科学依据。     

水稻OsGLYI11.2基因启动子的克隆及表达分析

启动子对基因时空表达的调控具有关键作用。本研究利用PCR克隆了一个水稻乙二醛酶(Glyoxalase)基因Os GLYI11.2的启动子区域片段(GenBank:AB017042.1),利用PlantCARE对该片段进行了顺式作用元件分析;构建了pOsGLYI11.2∷GUS表达载体并通过农杆菌介导转入水稻中,通过检测转基因植株中GUS基因在不同器官中的表达,分析了启动子的表达调控模式。结果显示：该启动子含有调控基因表达的7类调控顺式元件,能驱动GUS基因在水稻不同组织中(胚,胚芽鞘,花)表达。说明本研究所克隆的OsGLYI11.2基因上游2 120 bp的DNA片段具有启动子活性,能够驱动报告基因的表达。本研究结果可为进一步研究OsGLYI11.2基因在水稻中的功能及其相关调控机制提供基础。     

中棉(Gossypium arboreum)光诱导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var.jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能.为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus(uid A)基因融合,构建植物表达载体.用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草.GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,GacabP驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达.GUS定量分析表明,-504～-1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍.上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且-504～-1 bp的启动子缺失体启动活性最高.     

花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子的克隆及功能分析

Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是决定植物体内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值的关键酶。以花生品种豫花9326基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,克隆到花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(Ah SAD)起始密码子ATG上游720 bp片段,利用5'RACE方法获得了该基因的5'UTR序列,通过序列比对确定720 bp片段为Ah SAD启动子区域。PLACE在线启动子预测分析表明,该序列具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,含有多个与光诱导和激素响应相关顺式序列元件。将Ah SAD启动子片段替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达,构建植物表达载体pBI-PAh SAD。通过农杆菌介导法转化拟南芥和在花生不同组织中瞬时表达,利用GUS组织化学染色研究其表达特性。表明在拟南芥和花生受体中,AhSAD启动子主要调控下游基因在根、茎、叶片和子叶中表达,在花生的果针中也检测到GUS活性;拟南芥的茎生叶只有叶脉中具有GUS活性,而花生整个叶片中都具有GUS活性。     

大豆CHI1基因启动子的克隆及功能初探

为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。     

水稻稻瘟病菌诱导表达启动子OsQ16p的克隆与功能分析

qRT-PCR分析表明,日本晴OsQ16基因受稻瘟病菌诱导表达。利用PCR技术从日本晴基因组中克隆了该基因编码区5′端上游1 229 bp的启动子序列,命名为OsQ16p。用其取代pBI121中gus基因上游的CaMV35S启动子,构建重组表达载体pBIQ16p,经农杆菌介导转化日本晴,获得转基因植株。GUS组织化学染色和qRT-PCR分析表明: (1) gus基因在抗性愈伤组织和阳性转基因植株中均能表达; (2)转基因植株在接种稻瘟病菌后12 h,GUS表达量是处理前的2.7倍; (3)抗病相关信号分子水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)喷施转基因植株叶面后12 h,GUS表达量分别为处理前的3.1倍和3.5倍。以上结果表明,OsQ16p启动子具有启动活性,并明显受稻瘟病菌、MeJA和SA诱导表达。     

中棉(Gossypium arboreum)光锈导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var. jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus (uid A)基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草。GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,Gacab P驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS定量分析表明,–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍。上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高。     

巨胚稻OsGAD_3基因启动子的序列及活性分析

本研究以富含γ-氨基丁酸的巨胚稻"Tge B"基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到GABA合成关键酶基因Os GAD3的上游959 bp启动子序列。序列分析表明:Os GAD3启动子不仅含有转录必备的TATA box、CAAT box元件,还含有分生组织特异性表达调控元件CAT-box、CCGTCC-box以及一些非生物胁迫和激素响应元件等。将该启动子序列与GUS基因融合构建表达载体,转化水稻后进行GUS组织化学染色分析,结果显示,Os GAD3启动子驱动的GUS基因在转基因植株的根、茎中具有较高的表达活性,且在根尖和茎初生韧皮部区域的表达更为明显,在种胚及叶片切口处也能检测到GUS表达。浸水后种胚中的GUS活性显著提高,且随着浸水时间的延长呈逐渐增加趋势。研究结果为了解巨胚稻Os GAD3的表达调控机制提供了依据。     

水稻rTGA4转录因子的启动子特征分析

TGA转录因子通过与NPR1基因协同作用参与植物对病害的防御作用。从水稻突变体HX-3基因组中分离到一个TGA转录因子rTGA4的5’非翻译区1 995 bp的序列(pTGA),该序列与日本晴基因组序列仅有94%的相似性。经PLACE和PlantCARE序列分析表明:该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box等基本转录元件,以及脱落酸、乙烯、茉莉酸甲酯、赤霉素以及病原菌响应元件等。将得到的pTGA利用T/A克隆法连接到植物表达载体pCXGUS-T/A上,通过花序浸染法转化拟南芥,并对转基因拟南芥进行分子检测及GUS组织化学染色。结果表明,在苗期时GUS主要在幼苗根尖表达,在其他部位均没有表达;而在成熟期GUS在多处均有表达,特异性并不明显,表明该启动子是受生长发育阶段调控的组织特异性启动子。通过对rTGA4启动子的特征研究,为进一步克隆HX-3中的抗性基因以及利用奠定基础。     

杨树ProWOX11启动子克隆及组织特异表达分析

作为拟南芥At WOX11的同源基因,杨树Pe WOX11a和Pe WOX11b基因在不定根发生及形态建成过程中发挥重要重要。过表达的Pe WOX11a和Pe WOX11b转基因杨树不仅不定根数量显著增加,而且在茎和叶上产生大量异位根;同时,两者的过表达也影响转基因杨树腋芽和叶片的发育。为了深入探究两者之间的时空表达调控模式及其生物学功能,本研究克隆和鉴定了Pe WOX11a和Pe WO11b基因的启动子序列,1 953 bp长度的Pro WOX11a和1 772 bp长度的Pro WOX11b。两个基因的启动子序列均含有多个植物激素的应答元件或结合位点。启动子GUS表达载体构建及遗传转化分析表明,Pro WOX11a启动子驱动GUS基因在根原基启动及随后发育早期的分生组织中特异表达,而Pro WOX11b启动子驱动GUS基因在不定根发生的重要区域下胚轴特异表达。     

耐盐小麦中TaSC基因启动子的克隆及调控功能分析

高盐是小麦的主要非生物胁迫因子之一, 发掘小麦耐盐品种中的相关基因, 分析其调控机理, 有助于解析小麦耐盐性机制。本文利用TAIL-PCR和电子克隆的方法, 从耐盐小麦RH8706-49中克隆了耐盐基因TaSC的启动子序列, 命名为ProTaSC。该DNA序列中存在多个顺式作用元件, 包含与非生物胁迫响应有关的ABA响应元件(ABRE)和MYB蛋白结合位点(MBS)各1个。以GUS为报告基因, 对克隆的启动子序列及不同长度的5′端缺失片段的表达活性分析表明, 克隆的全长片段及2个5′端缺失的片段(681 bp和1096 bp)均能启动GUS表达, 而小于等于343 bp的片段不具备启动功能, 说明ProTaSC中从-681位到-343位核苷酸之间的区域为核心启动子区。在ProTaSC:GUS转基因拟南芥的根、叶片、花药、萼片及成熟角果的果荚壳中均检测到GUS蛋白, 而在主茎、花瓣、幼果和种子中没有检测到GUS, 表明ProTaSC是组织表达特异性启动子。对ProTaSC:GUS转基因拟南芥在NaCl (200 mmol L^-1)和ABA (10 μmol L^-1)胁迫处理后的GUS定量分析表明, ProTaSC是受NaCl和ABA显著诱导表达的功能序列。     

种子特异表达启动子的克隆分析及其植物表达载体的构建

根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。     

水稻碳酸酐酶基因5'端启动子不同区域对基因表达调控的研究

根据水稻碳酸酐酶基因5’端序列,从4处不同位置设计上游引物,在碳酸酐酶基因ATG前0位点处设计下游引物。通过PCR扩增基因5’端l600bp、964bp、585bp、313bp片段,将以上目的片段克隆到以GUS为报告基因的植物表达载体pBI121上,通过农杆菌介导法转化烟草。转化植株GUS活性检测结果,发现-1600-0bp片段启动GUS在烟草的叶、茎中有GUS活性,而其余3段区域(-964-0bp,-585-0bp,-313-0bp)未检测出GUS活性,这些暗示了-1600-0bp启动子区域在控制基因表达时,具有在叶、茎中表达,在根中不表达的组织特异性。     

大豆低温诱导启动子GmERF9P的克隆及活性鉴定

为获得低温诱导基因GmERF9启动子,并分析该启动子的功能,利用PCR技术从大豆叶片基因组DNA中克隆1885bp的GmERF9启动子序列GmERF9P。序列分析表明,GmERF9P序列中含有多种与逆境相关的顺式作用元件。将GmERF9P构建到植物表达载体pCAMBIA1301上并转化烟草。通过PCR检测共获得6株T_1阳性转基因烟草株系。对野生型烟草和转基因烟草进行低温处理2h,通过GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达量。结果显示GmERF9P在低温处理下能够提高GUS基因的表达量,具有低温诱导启动活性。     

柽柳GRAS转录因子基因启动子克隆和表达分析

克隆获得柽柳GRAS 转录因子基因启动子序列,并对其表达模式进行分析,从而初步探究GRAS转录因子基因的表达特征和功能。CTAB法提取刚毛柽柳基因组DNA,按照Genome Walking Kit 说明克隆GRAS 转录因子基因启动子序列,将克隆获得的GRAS 转录因子基因启动子序列定向替换pCAMB1301 载体上的35S启动子序列,构建融合表达载体,以驱动GUS 基因表达,瞬时侵染拟南芥后进行GUS 基因的染色。成功克隆获得刚毛柽柳936 bp 的GRAS 转录因子基因启动子序列。PLACE 和PlantCARE 数据库分析结果表明该启动子不仅包含启动子区的核心元件CAAT-box 和TATA-box,还含有多个与逆境应答有关的顺式调控元件。成功将GRAS 基因启动子序列定向置换pCAMBIA1301 的35S 启动子,构建重组载体PGRAS::GUS。瞬时转化拟南芥后GUS 染色,结果显示转基因拟南芥叶片被染色而根部着色较浅。初步表明克隆获得的GRAS 基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了柽柳的抗逆应答,为进一步分析该基因的抗逆功能和抗逆机制奠定了基础。