青稞HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究

应用RT-PCR结合RACE技术, 从青稞总RNA中扩增得长度为1 512 bp的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对, 发现该序列的推定表达产物与大麦BADH同工酶BBD2的同源性为98.4%, 而与小麦、玉米和水稻等禾本科作物的BADH同源性分别为97.0%、84.7%和85.1%。将克隆到的青稞cDNA序列命名为HvBADH1, 投递到GenBank, 获得收录号EF492983。HvBADH1可以在原核表达系统TB1-pMAL c2x中正常表达出分子量为54.2 kD的多肽链。将HvBADH1的编码ORF, 插入到添加了植物表达CaMV 35S启动子和Nos polyA终止子调控元件的植物表达载体pCAMBIA1301质粒相应的克隆位点中, 构建了HvBADH1基因的农杆菌植物转化系统LBA4404(pCAM-ba)。进而采用农杆菌介导法, 将HvBADH1基因导入烟草中, 对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR、Southern blot和RT-PCR等分子生物学检测, 结果表明, 在得到的2个转基因株系中, HvBADH1基因已整合到受体植物基因组中, 并且可以在mRNA水平上进行转录。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草抗旱及耐盐性

将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因与组成型启动子CaMV 35S启动子融合,构建了植物表达质粒pBIBB。通过根癌农杆菌介导将BADH基因导入烟草,经PCR、Southern杂交、Northern杂交证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性,结果显示对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1~1.0 U mg-1间。转BADH基因的烟草在盐胁迫和聚乙二醇（PEG）胁迫条件下生长状态良好,生长势强于未转基因植株,说明BADH基因能在异源植物中正常翻译、表达和用于植物抗旱、耐盐基因工程的研究。     

新疆哈密瓜AT2基因的克隆及初步功能验证

本研究利用RT-PCR技术从抗霜霉病哈密瓜(Cucumis melo L.)品种MR-1中克隆到AT2基因,其整编码区为1 229 bp,编码401个氨基酸,同源比对结果为99%,将其编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶蛋白序列与多种物种进行系统进化树分析,结果显示,甜瓜与黄瓜SGT蛋白同源性较高,遗传距离最近,推测在同属中该蛋白进化相对保守。在线分析表明SGT蛋白不含信号肽及跨膜区,即该蛋白为非跨膜蛋白。RT-PCR分析表明AT2基因随着植株生长时期不同表达量不同,开花期表达量最高,幼苗期至开花期表达量呈上升趋势;且不同组织中,叶片表达量显著高于茎、根。构建了p CAMBIA2300-AT2植物表达载体,运用农杆菌介导法转化烟草,抗性筛选获得7株阳性转基因烟草;经q RT-PCR检测,AT2基因在不同株系转基因烟草T0代中表达量均高于野生型。通过对转基因烟草进行抗病性鉴定,转基因烟草对靶斑病、赤星病的抗性高于野生型烟草。本研究表明,过表达AT2基因能够提高烟草对部分真菌性病害的抗性。     

一个棉花类受体蛋白激酶基因的克隆与表达分析

 利用简并引物扩增、染色体步移以及RT-PCR的方法,分离了棉花的一个类受体蛋白激酶基因的全长序列。序列分析表明,该基因没有内含子,开放读码框的长度为2964 bp,编码的多肽序列含有988个氨基酸并与拟南芥控制花器官脱落的基因HAESA-like2具有60%左右的相似性,将该基因命名为GRLK5。半定量RT-PCR分析发现GRLK5在种子、茎皮、根和纤维中的表达量较高,并且受ABA的诱导表达。将GRLK5整合到植物表达载体pCAMBIA2301中,构建植物过量表达载体,通过农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR检测证明目的基因已经整合到烟草基因组中。     

棉花arf1启动子驱动Cry1A基因在烟草中特异性表达研究

在新一代Bt作物以及Bt作物安全性研究方面, Bt毒蛋白在植物特定发育阶段的表达特性渐受关注。本研究构建了植物表达载体pGBI121.A1Bt, 其携带棉花arf1启动子驱动Cry1A基因的表达盒, 启动子后面有一个Ω序列; 对照载体pGBI121.4AB携带P2E35S启动子(增强子加倍的修饰CaMV 35S启动子)驱动Cry1A基因的表达盒, 在启动子后面也有一个Ω序列。利用根癌农杆菌介导法, 将植物表达载体pGBI121.4AB和pGBI121.A1Bt转化烟草, 分别获得44株和42株转基因烟草再生植株。ELISA检测表明, 在pGBI121.A1Bt转基因烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣和叶中Cry1A基因的平均表达水平分别为pGBI121.4AB的1.5、1.5、1.4和0.3倍。棉花arf1启动子在烟草中表达, 证明了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性, 为arf1启动子应用于转基因抗虫棉, 在棉花蕾铃中优势表达Bt毒蛋白, 提高转基因棉花蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究提供了依据。     

青稞hblt4.2基因的克隆及功能分析

根­据大麦blt14.2基因序列设计引物, 用青稞的DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列, 命名为hblt14.2, 在GenBank登录号为EF514912。该基因含470 bp, 包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5''非翻译区和152 bp的3''非翻译区, 编码82个氨基酸残基, 富含Gly、Ala、Leu和Val氨基酸, 与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性。与大麦blt14.2基因具98.9%同源性, 所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别。将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中, 构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt, 通过农杆菌介导转化烟草, 并对转基因烟草进行抗寒性检测。结果表明, 青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系。     

玉米类LFY基因的克隆及其在不同光周期条件下的表达

采用每天9 h和15 h两种光照条件对热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系黄早四进行处理。以玉米茎尖为材料，采用RT-PCR方法，分离到1个1 265 bp的全长cDNA克隆，序列比较表明其为拟南芥LFY基因的同源基因，命名为类LFY（基因登录号为DQ343237）。类LFY与同源基因zfl2、RFL、LFY和FLO的同源性依次为93%、84%、57%和57%。它的DNA序列和推论的蛋白质序列与zfl1同源性最高，其编码的蛋白质与zfl1相比在第28、29和160位分别少1个丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸，在188位置多1个甲硫氨酸。该基因在2个供试自交系茎尖中长日照条件下不同生长时期持续表达，短日照条件下生长早期和后期不表达，其功能有待进一步研究。     

MADS-box基因GmAGL15在大豆种子发育过程中的表达

以同源序列法克隆了大豆MADS-box基因GmAGL15, 序列分析表明, 该基因编码的氨基酸与拟南芥AGL15蛋白的同源性为61%, 其中在MADS区的同源性为84.3%, K区的同源性为63.2%。半定量RT-PCR分析表明, GmAGL15在幼胚中高度表达, 而没有检测到在根、茎、叶和花中的表达。荧光定量RT-PCR分析发现, GmAGL15在大豆种子发育的不同时期均有不同程度的表达, 其中在开花后15 d的幼胚中表达量较高, 而在开花后30 d的幼胚中表达量最高。以上结果显示, 基因GmAGL15对于大豆种子发育的调控可能有重要作用。     

菜豆几丁质酶基因Bchi的克隆及其在转基因烟草中的表达

本文根据GenBank中公布的菜豆几丁质酶基因cDNA序列设计引物,通过RT-PCR得到一个菜豆几丁质酶基因家族基因Bchi.该基因编码一个327个氨基酸的多肽,其结构包括信号肽、几丁质结合区、铰链区、催化区和液泡定位多肽,属于Class Ia类内切几丁质酶.构建该基因的植物表达载体pMHL7133-Bchi,并通过发根农杆菌R1000介导转化烟草,经PCR和Southern blot鉴定获得了4株转基因烟草株系.几丁质酶活性分析表明,转基因烟草几丁质酶活力明显高于对照.抗真菌实验结果显示,转基因烟草的叶片基本无病斑产生,表明Bchi基因在烟草中高水平的表达显著提高了烟草对真菌病害的抗性.     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因同源片段的克隆与序列分析

在盐和干旱等渗透胁迫条件下,一些植物会积累甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)作为渗透调节物质,甜菜碱在植物体内由胆碱经两步氧化形成,催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(cholinemonooxyge-nase,CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH)。由于甜菜碱的合成途径简单,进行遗传操作方便,在诸多抗逆性基因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因。其中,BADH基因的全长cDNA序列首先被从藜科植物菠菜(Spinaciaoleracea)中克隆到,此后人们相继以该基因为参照,研究其它植物中的BADH基因。本文作者在以菠菜BADH基因为对照研究菊科植物的BADH基因时,根据已发表BADH基因的保守区序列设计了一对PCR兼并引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR法扩增出长分别为825bp(seq1)和822bp(seq2)的两个DNA片段,经测序和序列分析,seq1与GenBank中登录的菠菜BADH基因的基因组序列(U69142)一致,其外显子区与已发表的该基因的cDNA序列(M31480)一致,seq2与U69142序列的同源性为68%,其外显子区与M31480序列的同源性为83.93%。而且,在由该核苷酸序列推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP,说明该基因为菠菜BADH基因的同源基因。根据现有文献分析,菠菜中可能存在两个BADH的同工酶,作者所克隆基因片段所属的基因可能编码菠菜BADH的另一个同工酶。该序列已在GenBank中登录,登录号:DQ070842。     

Bph15在非洲栽培稻、药用野生稻和宽叶野生稻中的BAC-FISH比较物理定位

用覆盖抗褐飞虱基因Bph15的两个BAC克隆，即20M14 (27 kb)和64O9 (36 kb)作为探针，对非洲栽培稻、药用野生稻和宽叶野生稻体细胞染色体进行荧光原位杂交(FISH)。两个BAC克隆均被定位于非洲栽培稻和药用野生稻第4染色体的短臂上，杂交信号的百分距离分别为37.03±4.11和81.22±3.62，相应的信号检出率为41.18%和38.22%。在宽叶野生稻中，有两对同源染色体同时检出信号，分别定位于染色体的短臂和着丝粒区，信号距着丝粒平均百分距离分别为87.78±5.23和0，信号检出率为52.58%。由此推知，这两个BAC克隆在非洲栽培稻和药用野生稻的第4染色体分布同线且同区，并且在宽叶野生稻的DD基因组也存在Bph15基因的同源序列。在未封阻的情况下，BAC克隆在非洲栽培稻的多条染色体上有杂交信号，表明它和栽培稻C_0t-1 DNA在一定程度上具有同源性。上述结果初步显示Bph15在3个稻种染色体中的相对位置。文章讨论了Bph15在3个种间的关系，为有效分离和利用Bph15基因提供了有益的依据，对不同基因组及二倍体和四倍体中功能基因可能进化机制的分析提供了线索。     

水稻抗白叶枯病基因Xa23的RFLP标记定位及其STS标记的转化

用水稻抗白叶枯病基因Xa23的近等基因系CBB23与其感病轮回亲本金刚30（JG30）杂交，构建了包含2562个单株的F₂作图群体。用水稻白叶枯病广致病菌系P6进行抗性鉴定表明，F₂植株抗感分离比严格符合3：1。根据日本水稻基因组计划RGP水稻高密度图谱上的RFLP探针对F₂群体中的145个感病单株进行RFLP检测和连锁分析，获得了6个与Xa23紧密连锁的RFLP分子标记。其中RFLP标记C1003A靠着丝粒一侧，与Xa23的遗传图距为0.4cM，为Xa23的图位克隆奠定了重要基础。并将标记C1003A成功地转化为STS标记，为分子标记辅助选择育种（MAS）提供了方便有效的分子标记。     

水稻(Oryza sativa)新型液泡Na+/H+逆向转运蛋白基因的特征分析和表达

以拟南芥AtNHX1 cDNA 片段作为探针，筛查水稻盐胁迫植株叶片cDNA 文库，获得与AtNHX1同源的水稻新型液泡Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（OsANT1）。序列分析表明，OsANT1 全长cDNA为2 178 bp，包括一个长度为1 608 bp的完整开放阅读框，编码535个氨基酸残基。在DNA水平上，OsANT1基因含有15个外显子和14个内含子，长度为4 835 bp。OsANT1含有12个跨膜域，系统进化树分析结果表明，与来自拟南芥、水稻、小麦、玉米、大麦、马蔺和芦苇等的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白高度同源。盐胁迫条件下，OsANT1的表达具有盐分诱导特征，且随着胁迫的增大而增加。表明该基因可能在水稻抵御盐分胁迫的过程中具有一定作用。     

根癌农杆菌介导获得稗草Ecppc转基因小麦的研究

采用携带pUbi-Ecppc质粒的3个根癌农杆菌菌株（LBA4404、EHA105和C58c1），对经过预培养10~12 d的春小麦品种扬麦158、Bobwhite和扬麦12的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。对筛选中的抗生素浓度、菌液浓度、共培养温度和时间、受体基因型、菌株-质粒组合等影响转化的重要因素进行了研究。首次将单子叶野生C₄植物稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Ecppc）导入小麦受体基因型，并得到具有潮霉素（Hyg）抗性的转化植株。从816块共培养愈伤组织中转化得到34株抗性植株，其中14株PCR检测为阳性。扬麦158的转化效率达3.03%。Southern和RT-PCR分析表明外源基因已整合到小麦基因组并得到正确的转录。生理学检测显示，转基因小麦植株的光合速率和PEPC活性都有所提高。说明Ubiqintin基因启动子控制的稗草PEPC cDNA基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。这些工作为进一步探讨PEPC对小麦光合作用及其他生理过程的影响奠定了基础。     

玉米非生物逆境响应基因ZmASK1的克隆及表达特性分析

类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因在植物发育和逆境应答中起着十分重要的作用。通过RT-PCR方法从玉米中克隆了一个与Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因同源的全长cDNA, 命名为ZmASK1(abiotic stress-induced kinase)(GenBank accession No., AY722707)。推测ZmASK1蛋白含有426个氨基酸, 分子量为48.5 kD, 等电点为8.7。半定量RT-PCR分析表明, ZmASK1可以被甘露醇、高盐和脱落酸(ABA)诱导。另外, 在不同的组织中, ZmASK1的表达模式也不一样, 在子房中的表达量最高。这些结果表明, ZmASK1可能在植物逆境反应及生殖生育过程中起多重作用。本文是玉米类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因参与胁迫和发育过程的首次报道。     

甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料, 随机挑选56个来自基因组的fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA克隆和9个授粉27 d后种子中fad2 cDNA克隆进行双向测序。基因组中56个fad2序列的碱基同源性为91.0%~99.9%, 从中得到11个差异序列, 即11个不同的fad2基因拷贝。将其翻译成氨基酸序列发现, 6个拷贝在编码区中出现多个终止密码子, 另外5个的同源性为90.60%~99.74%, 与47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA序列进行比较, 发现fad2基因没有内含子。从种子中的9个fad2 cDNA克隆序列中找到2个有差异的cDNA, 它们的编码区中没有终止密码子, 说明在种子中有多个fad2基因表达。基因组中的11个拷贝根据同源性可分成两组, 命名为fad2I和fad2II。RT-PCR分析发现在授粉27 d的种子中fad2I有较强表达, fad2II没有表达; 但在叶片中两者都有表达。     

紫花苜蓿Na+/H+ 逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料, 利用反转录PCR方法分离了NHX1全长cDNA(命名为MsNHX1)。Southern杂交结果表明, 在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明, 该基因所编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达MsNHX1-GFP融合基因的结果表明, MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度NaCl诱导。MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性, 说明MsNHX1具有转运Na⁺的功能。在拟南芥中表达MsNHX1能显著提高植株耐受盐胁迫的能力; 而且在受到盐胁迫时, 转基因植株比野生型的渗透调节能力更强, 生物膜受破坏程度降低, 光合能力增强。以上研究结果表明MsNHX1是一个液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白, 在植物耐受盐胁迫过程中起重要作用。     

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究

选用鲁花14与花育23花生品种, 通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究, 从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行npt II基因的PCR检测, 结果有22株能扩增出620 bp左右的npt II基因条带, 阳性率约为84.62%。提取npt II基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板, 用VP4基因特异引物进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳分析, 所有npt II基因阳性的植株均扩增出了约2 350 bp的特异性条带, 而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析, 发现转基因植株中出现了阳性杂交信号, 表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中, 并且是1~2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株, 证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录, 利用Western blot方法检测筛选到的4株转基因花生, 分别提取其蛋白, 在30 kD处出现特异性蛋白条带, 这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。     

棉花4个GL2同源基因的序列比较及表达分析

拟南芥GLABRA2(AtGL2)在决定拟南芥叶毛和根毛细胞的分化中起重要作用。通过同源序列查询从棉花的EST库中找到4个与AtGL2高度同源的全长编码序列(GhHOX1、GhHOX2、GhHOX3和GhHOX4)。序列分析表明4个棉花HOX基因与AtGL2基因Homeobox结构域相同氨基酸分别达到95%、71%、72%和63%。实时RT-PCR分析结果显示, GhHOX1、GhHOX3和GhHOX4均在伸长期的纤维中优势表达; 而GhHOX3在开花当天野生型胚珠中的表达量明显高于无绒无絮突变体。说明棉花GL2同源基因在棉花纤维的起始和伸长中具有重要的调控作用。