棉花GhTGA1与GhTGA9.2基因克隆及表达特征分析

为了揭示棉花GhTGA1与GhTGA9. 2基因的生物学功能,利用RT-PCR技术,从抗枯萎病棉花品种中棉所12号中克隆了TGA转录因子基因GhTGA1与GhTGA9. 2。生物信息学分析表明,2个基因开放阅读框(ORF)长分别为1 281,1461 bp,分别编码405,486个氨基酸。序列分析表明,2个基因均含有b ZIP和DOG1结构域,属于b ZIP亚家族TGA转录因子基因。利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术进行表达特征分析表明,GhTGA1基因能被枯萎病菌、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)诱导上调表达,水杨酸(SA)诱导后,在各处理时间点,该基因表达量均低于Mock,以上结果表明,GhTGA1基因可能通过参与乙烯(ET)和茉莉酸(JA)信号通路调控棉花对枯萎病的抗性;枯萎病处理后,GhTGA9. 2基因在各时间点表达量均低于Mock,呈下调表达,但能被激素(ET、JA、SA)诱导上调表达。结果表明,GhTGA9. 2基因可能通过激素(ET、JA、SA)途径参与胁迫应答,通过对GhTGA1与GhTGA9. 2基因表达特征分析为后续研究提供基础。     

苹果轮纹病抗性候选基因的表达分析

轮纹病菌侵染苹果植株,使树体减弱,严重影响苹果产量和品质。研究苹果轮纹病抗性候选基因的表达分析,以期为揭示苹果轮纹病的抗病机制提供参考。本研究以河北农业大学苹果课题组筛选出的抗病株系‘1-1-46’和感病株系‘1-1-40’为试材,对枝条接种轮纹病菌(B.berengeriana f.sp.piricola)和空白培养基,观察0~40 d内枝皮中的轮纹病抗性候选基因的表达量。结果表明:接种轮纹病菌后感病株系‘1-1-40’可以观察到明显的病变现象,皮孔凸起呈瘤状,抗病株系‘1-1-46’无明显的变化。对枝皮进行抗病候选基因Mdcf3、MdMBP2(苹果甘露糖结合蛋白)和MdACBP2(苹果酰基辅酶A结合蛋白)的表达分析,结果表明,接种轮纹病菌后,Mdcf3基因的相对表达量感病株系‘1-1-40’低于抗病株系‘1-1-46’,MdACBP2基因和MdMBP2基因相对表达量抗病株系‘1-1-46’低于感病株系‘1-1-40’。由此认为,对一些试材测定基因的相对表达量可以作为植株抗、感性鉴定的参考评价指标。     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析

菌核病是油菜主要病害, 至今尚未在油菜及相关植物中找到抗性基因。本研究利用qRT-PCR法比较了抗病品种宁RS-1和感病品种APL01在接种核盘菌后0~48 h内11个防御相关基因的表达差异, 以揭示抗病品种宁RS-1的抗病机制。结果表明, 4个基因(PGIP、Cu/ZnSOD、OXO和GLP)在核盘菌诱导前后抗、感品种内表达量均较高, 且抗病品种的表达量显著高于感病品种, 尤其是PGIP基因, 抗病品种宁RS-1在24 h的表达量为诱导前的170.4倍, 而感病品种仅为诱导前的3.5倍, 该时期抗病品种PGIP的表达量为感病品种的1299.4倍;2个基因(LOX2和PDF1.2)在诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 但抗、感品种间表达量差异显著;5个基因(FeSOD、PAL、EDS1、PR1和EIN3)诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 且抗、感品种间的表达量差异不显著。推测抗病品种宁RS-1对菌核病的抗性可能是由于PGIP的上调表达, 抑制了核盘菌PG蛋白对侵染部位油菜组织细胞壁的降解, 从而抑制了油菜菌核病的发生与蔓延。     

霜疫霉诱导的荔枝果皮几丁质酶活性及其基因表达分析

为探究荔枝果皮几丁质酶对霜疫霉病抗性中的功能,本研究以抗病品种‘黑叶’和感病品种‘桂味’为试验材料,分析荔枝果皮中的几丁质酶活性和基因表达情况。结果表明,果皮中几丁质酶活性不同,其与品种的抗病性正相关,霜疫霉菌侵染提高了果皮中酶活性。基于转录组数据,共检测到75条几丁质酶基因,在系统进化树上分为3枝。接种霜疫霉的抗病和感病品种果皮中差异表达基因有58条,表明几丁质酶基因响应霜疫霉入侵表达。不同进化分枝上的3个基因的表达水平因抗病性和接种时间的差异表达模式不同。LcChi3-1基因在抗病品种‘黑叶’中的表达水平远远高于感病品种‘桂味’,‘黑叶’果皮中LcChi3-1基因的表达水平与酶活性具有显著的相关性,表明其参与了对霜疫霉菌的抗病过程,并发挥主要作用。     

大薯PR1基因在炭疽菌、激素处理下的表达分析

炭疽病是大薯种植过程中所遭受的最严重病害。为了探究PR1基因家族对炭疽菌的响应情况,本研究在前期转录组的基础上筛选了6个PR1基因,设置5组处理;炭疽菌处理、MeJA处理、SA处理、MeJA+炭疽菌处理、SA+炭疽菌处理,分别在处理1 d、2 d、3 d、4 d、5 d采用荧光定量PCR进行6个基因表达量差异分析。结果显示6个不同PR1基因在炭疽菌处理下都会使得其表达量增高,炭疽菌诱导下PR1-1基因5 d时表达量为6个基因中最高,达到峰值。炭疽菌+MeJA诱导下PR1-6表达量较高,4 d时达到峰值。炭疽菌+SA诱导下PR1-9在4 d表达量达到峰值。Me JA诱下PR1-6基因表达量较高,2 d时达到峰值。SA诱导下PR1-1基因2 d时表达量达到峰值,于6个基因中最高。由此可见,不同PR1基因对炭疽菌以及不同激素处理响应不同。     

不同抗性花生品种接种疮痂病菌后其生理特性及产量的变化

为了研究不同抗性花生品种对疮痂病的抗性差异,在田间试验条件下,采用喷雾法研究抗病品种‘贺油13’、感病品种‘泉花10号’接种疮痂病菌后其叶片生理特性及产量的变化。结果表明：可溶性糖含量在接种后呈先升高后降低的趋势,抗病品种其可溶性糖含量均高于其对照,而感病品种与其对照相比均有所下降,说明花生叶片中可溶性糖含量与植株抗病性有一定的相关性。抗感花生品种接菌后叶片可溶性蛋白质含量均高于其对照,但感病品种比抗病品种的峰值出现的要早,表明感病品种对病菌的侵染较敏感,品种的抗病性与对病菌侵染的反应呈负相关。接菌后抗感品种叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性均呈先升高后降低的变化趋势,与其相应的对照相比,抗病品种比感病品种降低的幅度相对较小;花生叶片过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性随生育进程的推进整体呈现先下降后升高再降低的变化趋势,其相应的对照相比,接种后抗病品种的CAT和POD活性表现相对较高,由此说明保护酶在花生对疮痂病的抗性机制中起了重要作用。接种后2个品种叶片丙二醛(MDA)含量有所增加,表明其质膜受到不同程度的伤害。产量结果研究表明,接菌后抗、感品种均有所减产,但感病品种‘泉花10号’减产幅度较大。     

白粉病病菌对不同抗性瓠瓜生理生化指标的影响

为探究瓠瓜对白粉病菌的响应机制,本研究以两个不同抗性瓠瓜品系为试材,采用基质栽培的方式,研究了接种白粉病病菌对瓠瓜幼苗的抗氧化酶活性及内源激素含量的变化规律。结果表明,在接种白粉病菌后,瓠瓜叶片中酶活性及内源激素含量表现为先升后降的趋势,且抗病品种的升高幅度大于感病品种。接种白粉病菌后,在部分时间段,抗病品种B-8与感病品种B-3的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨(PAL)、β-1,3-葡聚糖酶活性、水杨酸(SA)含量均存在显著差异。接种白粉病菌后,抗病品种B-8的SOD、POD、PAL、β-1,3-葡聚糖酶活性在各时间段均显著高于感病品种B-3,而抗病品种B-8的CAT活性在1、3、5 d时显著高于感病品种B-3,抗病品种B-8的乙烯(ETH)含量则在3、5、7、9 d时显著低于感病品种B-3,抗病品种B-8的SA含量在1、3、5、7 d时均显著高于感病品种B-3。综上,白粉病菌对不同抗性瓠瓜的防御酶活性及内源激素含量产生了显著影响,除ETH含量外抗病品种B-8的防御酶活性及SA含量均显著高于或部分显著高于感病品种...     

香蕉MaWRKY28基因的克隆及其功能分析

为探究香蕉WRKY28基因响应Foc-TR4侵染的作用及调节机制,本研究从抗病‘桂蕉9号’品种中克隆了香蕉MaWRKY28基因;利用ExPASy、MEGA 6.0等软件对其蛋白序列进行理化性质分析及系统进化树的构建;采用q RT-PCR分析了该基因在抗(‘桂蕉9号’)、感(‘威廉斯’)香蕉品种受Foc-TR4侵染不同时间后的表达量变化;构建过表达MaWRKY28基因载体,转化拟南芥,并检测该基因在转化植株中的表达量。结果表明,从‘桂蕉9号’中克隆了一个WRKY28基因,命名为MaWRKY28 (GenBank登录号为MK941141)。MaWRKY28基因编码区全长999 bp,编码332个氨基酸,属于不稳定的分泌蛋白,具有典型的WRKY结构域;系统进化树分析表明,香蕉与海枣(Phoenix dactylifera)、油棕(Elaeis guineensis)的同源性最高,相似性高达87%;qRT-PCR结果显示,在Foc-TR4侵染的香蕉根系过程中,MaWRKY28基因呈上调表达趋势,且在抗病品种中的表达量整体高于感病品种;筛选获得的7株阳性转化拟南芥植株中,MaWRKY28基因的相对表达量较野生型均显著提高。综上说明,MaWRKY28基因在香蕉抗枯萎病菌侵染过程中参与了抗病相关过程,且能在异源受体拟南芥中成功转化并高效表达。本研究结果为进一步研究香蕉抗病品种的抗性机理提供了帮助。     

苹果炭疽病抗性miRNA的筛选

为筛选炭疽病菌侵染苹果属植物后相关miRNA的响应情况,以抗病品种‘八棱脆’海棠、感病品种‘嘎啦’苹果2个为试验材料,分别用胶胞炭疽孢子悬浮液侵染组培苗,4天后发病,提取植物总RNA并反转miRNA,用qRT-PCR分析2种植物中抗病相关miRNA相对表达量的差异,并对其靶基因进行预测。在抗性品种中miR390a和miR396b/c/f表达量下调,而在感病品种中表达量上调,且其靶基因均有LRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白,miR482b靶基因为抗性蛋白。miR390a、miR482b和miR396b/c/f可能在苹果炭疽病的侵染过程中起重要作用。     

棉花ERF-B3亚组转录因子基因GhERF5-3的克隆及表达

植物在受到病原菌侵染时,ERF转录因子被诱导调控抗病相关基因的表达。为了研究棉花AP2/ERF-B3类转录因子在棉花抗病调控中的作用,用电子克隆及RT-PCR技术,从陆地棉抗枯萎品种‘中棉所12’根部c DNA克隆得到一个新的ERF转录因子Gh ERF5-3(登录号:MF197875)。利用q RT-PCR检测枯萎病及不同激素处理后该基因的表达。结果表明:其c DNA全长为672 bp,编码223个氨基酸,分子量24.95 k D,等电点为9.04,含有一个典型的保守AP2结构域,通过进化树分析属于B3亚组。枯萎病菌侵染后,随着侵染时间的延长,Gh ERF5-3基因呈现出先增后降的趋势,在24 h时间点,其相对表达量达到峰值;ET和Me JA处理后,Gh ERF5-3基因呈上调表达。SA处理后为下调表达。推断Gh ERF5-3基因响应枯萎病菌。     

灰飞虱胁迫下水稻防卫相关基因的表达

灰飞虱是我国水稻生产上的一种重要害虫。运用荧光定量PCR方法及特异性引物,对不同时间(12、24、36、48和72 h)灰飞虱胁迫下抗虫和感虫水稻品种中主要防卫途径的相关基因进行转录水平上定量分析。灰飞虱取食后,与水杨酸合成途径相关的基因PAL、NPR1、EDS1和PAD4在抗灰飞虱品种Mudgo中的表达水平均高于在感虫水稻Kittake中。接虫12 h后,PAL基因表达量达到未接虫时的6.914倍;在Mudgo中,PAL基因相对表达量上升更快,在24、48和72 h分别是Kittake中的42.848、70.743和69.193倍。NPR1基因在灰飞虱为害12、36和72 h后,在Mudgo中的表达量分别是Kittake中的4.690、6.231和4.112倍。与茉莉酸合成相关的基因LOX和AOS2,在灰飞虱为害36 h后,在Kittake中的表达水平显著高于Mudgo中。乙烯信号途径中的受体基因EIN2在Kittake中的表达量也高于Mudgo中。结果表明,灰飞虱取食激活了抗虫水稻Mudgo中依赖水杨酸介导的抗性途径,同时诱导感虫水稻Kittake产生了依赖茉莉酸/乙烯途径的防卫反应,PAL和NPR1基因的表达在调节Mudgo抗灰飞虱中具有重要作用。     

玉米抗禾谷镰刀菌的转录组分析

赤霉菌茎腐病是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum,有性态,Gibberella zeae)引起的一类土传性病害,严重危害玉米的产量和品质。本研究依据玉米第10和第1染色体上的2个抗茎腐病QTL,qRfg1和qRfg2,培育近等基因系NIL-R (2个QTL位点均为抗病等位基因)和NIL-S (2个QTL均为感病等位基因)。在成株期和幼苗期接种禾谷镰刀菌,两近等基因系的抗性差异均显著。用2个近等基因系的幼根接种禾谷镰刀菌,进行转录组分析研究。结果表明,与NIL-S相比,NIL-R在接种禾谷镰刀菌后,乙烯(ethylene,ET)合成、信号途径基因,病程相关蛋白、脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(deoxynivalenol,DON)解毒基因等呈现特异上调表达。与NIL-S相比,有1170个基因在NIL-R对照组中表达量较高,其中水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)和乙烯合成和信号介导途径以及苯丙烷合成途径中的基因显著富集;接种禾谷镰刀菌6 h或18 h后,病程相关蛋白、激素JA和ET合成基因、DON解毒基因在NIL-R中表达量较高。     

毛白杨植物络合素合酶(PtPCS)基因克隆及其表达研究

植物络合素(PCs)是植物细胞中一类螯合重金属离子的多肽,对细胞解毒和重金属的富集有重要的作用。植物络合素合酶(PCS)是合成PCs途径中的关键酶。本研究克隆了毛白杨的植物络合素合酶基因PtPCS,该基因cDNA序列全长1512bp,可编码503个氨基酸;与其它8种植物同源基因比对显示,它们的氨基酸序列相似性在67%～74.1%之间;构建进化树发现,这9种植物明显的分为两大分支,并且两大分支PCS蛋白的高级结构显示出明显的差异,一种呈月牙状,一种为伞状,重金属超富集植物均为月牙状结构。对毛白杨在不同镉浓度处理下PtPCS基因的表达情况分析发现,毛白杨根、茎、叶中PtPCS基因均表现出先升高后缓慢降低的表达趋势,并且在同一镉浓度处理下,毛白杨不同器官PtPCS基因的表达具有规律性,即根表达量最强,茎次之,叶片最弱。研究结果不仅为植物育种提供了重要的基因资源,也为剖析毛白杨的镉抗性和富集特性的研究奠定了良好的基础。     

小麦NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析

AtNPR1是拟南芥系统获得性抗病反应中的关键基因,对拟南芥的广谱抗性起重要调控作用。从赤霉菌诱导的小麦抗、感赤霉病近等基因系RNA差异表达谱中获得3个与AtNPR1类似的EST片段,据此检索相应序列信息并设计引物,采用RT-PCR方法从小麦中克隆得到3个cDNA全长序列,分别命名为TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3,其开放阅读框分别编码580、607和601个氨基酸残基。序列分析表明,这3个小麦NPR1-like蛋白都含有保守的BTB/POZ、ANK和NPR1_like_C结构域及功能氨基酸,但仅TaNPR1具有2个对NPR1寡聚体形成十分必要的保守半胱氨酸残基。蛋白质聚类分析表明,TaNPR1与TaNPR2和TaNPR3的同源性均较低,其中TaNPR1与NPR1蛋白聚为一类,而TaNPR2和TaNPR3均与NPR1同源蛋白聚为一类。荧光定量PCR分析结果显示,TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3基因都可被植物抗病相关信号分子水杨酸和茉莉酸甲酯诱导。与感病材料Apogee相比,抗病近等基因系Apogee73S2中TaNPR1和TaNPR3能够更早地响应赤霉菌的诱导并显著上调表达;而TaNPR2在感、抗材料中对赤霉菌侵染的响应都较为缓慢且变化不明显。这些结果表明,TaNPR1和TaNPR3可能在小麦对赤霉菌的防御反应中起重要作用。     

响应辣椒疫霉菌诱导的CaWRKY转录因子筛选及其信号通路分析

在辣椒基因组中全面鉴定WRKY转录因子并筛选出受辣椒疫霉菌诱导的CaWRKY基因,并分析关键CaWRKY基因参与的信号通路。以CM334和NMCA10399为材料,基于辣椒基因组和RNA-seq数据,并在水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理下通过qRT-PCR技术检测基因表达并分析。全基因组共鉴定出69个CaWRKY基因。接菌后12 h,抗、感材料中分别鉴定出7个和3个差异表达基因;接菌后36 h,分别有13个和22个差异表达基因,表明抗病材料能更快速应答。在筛选出的8个关键CaWRKY基因中,CaWRKY19和CaWRKY65受SA诱导上调表达;CaWRKY50受MeJA诱导上调表达;CaWRKY25受SA诱导上调表达同时受到MeJA抑制下调表达,而CaWRKY49同时受SA和MeJA抑制下调表达,推测CaWRKY19和CaWRKY65通过SA,CaWRKY50通过JA,而CaWRKY25和CaWRKY49则通过SA和JA信号途径参与辣椒抗疫病防御反应。     

花叶毛白杨叶片致黄因子的病毒学研究

为了探索花叶毛白杨的花叶形成因子,以花叶毛白杨为研究材料,采用接种鉴定、ELISA测定法、病毒双链RNA检测及RT-PCR检测4种方法对花叶毛白杨的致黄因子进行病毒学鉴定。结果表明：（1）花叶毛白杨花叶样品过滤液经对指示植物烟草（Nicotiana tabacum）、大豆（Glycine max）及北京杨幼苗（Populus beijingensis）摩擦接种或注射接种后,未出现皱折、局部失绿等症状。（2）花叶毛白杨花叶样品过滤液选用24种抗血清进行酶联免疫检测,均未得到阳性结果。（3）花叶毛白杨花叶样品dsRNA电泳图未出现明亮条带。（4）RT-PCR未得到扩增产物。花叶毛白杨的叶片致黄因子不是由植物病毒引起。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa7候选基因的实时荧光定量表达分析

水稻白叶枯病抗性基因Xa7精细定位的区域包括三个与抗性相关的候选基因。为研究这三个候选基因在水稻抗性反应中的作用,本研究利用水稻白叶枯黄单胞菌SCB4-1(Ⅳ型菌)接种分别在20℃、26℃和32℃条件下栽培的感病品种IR24及其含有Xa7基因的近等基因系IRBB7,采集接种前0d(对照),及接种后0.5d、1d、2d、3d、4d、5d和6d的叶片,通过实时荧光定量PCR技术,研究在不同温度条件下Xa7三个候选基因(CG-XA7-1、CG-XA7-2、CG-XA7-3)在IRBB7和IR24中的表达情况。研究结果表明,在20℃条件下,CG-XA7-1和CG-XA7-2在IRBB7的表达量比IR24的低,CG-XA7-3的个别时间点在IRBB7的表达量比IR24的高,但并不显著;在26℃和32℃条件下,三个候选基因在IRBB7的表达量比IR24的高。对于抗病品种IRBB7,三个候选基因在26℃时的相对表达量比在20℃和32℃的高;对于感病品种IR24,三个候选基因在20℃时的相对表达量比在26℃和32℃的高。根据白叶枯病的发生适宜气温为25～30℃,而20℃以下和33℃以上该病发生受抑制的特点,测试的三个候选基因的表达量与水稻白叶枯病抗性有较高的相关性,可能在白叶枯病抗性反应中发挥一定的作用。     

转人工改造的Bt Cry1Ac 基因中林美荷杨的 获得及其抗虫性分析

中林美荷杨具有适应性强、雄性不飞絮、速生丰产和耐瘠薄等优良性状,然而受到一些害虫的危害,造成树苗生长不良,严重影响苗木的产量和质量。采用中林美荷杨的叶片和节间组织作为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将人工改造后的抗虫基因Bt Cry1Ac 导入杨树基因组中。对所获得的中林美荷杨转基因植株进行PCR、Southern blotting 和Real-time PCR 等分子生物学检测,结果表明Bt Cry1Ac 基因多以单拷贝整合到受体植物基因组中,其中7 个转基因株系显示外源基因有较高的转录表达。经过实验室喂虫鉴定,筛选出2 个抗性效果好的株系。中林美荷杨转抗虫基因株系的获得为该品种绿化造林和推广提供了条件。     

杨树PePIF3基因的克隆与表达分析

生物节律基因直接影响植物的生长发育,光敏色素相互作用因子3(phytochrome-interacting factor3,PIF3)属碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族,是生物节律中的一个关键因子,在分子水平上对植物所受到的环境变化起协同调控作用。本研究以‘南林895’杨(Populus deltoides×P.euramericana’Nanlin 895’)为材料,通过克隆获得杨树Pe PIF3基因,分别为Pe PIF3-1和Pe PIF3-2序列,长度为1686 bp和2142 bp,编码561个氨基酸和713个氨基酸,且均为亲水性蛋白。对Pe PIF3进行多序列比对分析,发现其与毛果杨和胡杨同源性最高。组织特异性分析显示PePIF3在杨树幼叶中表达量最高,在柄、茎和根组织中表达都较低。对自然条件下的杨树成熟叶中PePIF3的生物节律性变化规律分析发现其在黑暗中不断累积,上午表达量达最高,以后呈下降趋势。在全黑暗条件下,14 h前PePIF3-1和Pe PIF3-2二者的表达量变化趋势相似,但14 h后二者的表达量呈相反变化趋势。     

烟蚜取食对抗、感烟草品种信号分子和CAT活性的影响

为研究烟草品种抗蚜机制,选用6个不同烟蚜抗性的烟草品种,采用盆栽试验接种蚜虫,研究烟蚜侵袭后第0、3、6、9 h烟草叶片茉莉酸(JA)、一氧化氮(NO)含量以及CAT活性的变化。结果表明,受到蚜虫为害后,叶片JA含量均表现为先增加后降低的趋势,烟蚜取食6 h后叶片JA含量达到峰值,且抗蚜品种JA增量大于感蚜品种。受到蚜虫为害后,抗蚜品种叶片NO含量表现为先增加后减少的趋势,烟蚜取食3 h后NO含量达到峰值,感蚜品种烟蚜取食3 h后的NO含量与取食前差异不显著,但6 h和9 h后显著低于0 h。受到烟蚜侵袭9 h后,参试品种CAT活性均表现为增加趋势,烟蚜取食9 h后,抗蚜品种‘竖把老母鸡2113’的CAT活性增量最多,增幅最大。JA和NO含量以及CAT活性均可以作为烟草品种蚜虫抗性鉴定的生理指标,烟蚜取食5～6 h叶片茉莉酸含量的增幅可以用于鉴定烟草品种抗蚜性。