猪伪狂犬病病毒灭活疫苗对猪伪狂犬病病毒流行毒株和经典毒株的免疫保护效果评估

为评估猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）免疫后对PRV流行毒株和经典毒株的保护效果,本研究对试验猪分别免疫PRV灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）和PRV活疫苗（Bartha-K61）,免疫后第0、7、10、14、17、21、24和28天采血测定PRV gB抗体,并分别使用PRV流行毒株HN1201株和经典毒株闽A株测定免疫后第0、7、14、21和28天血清的中和抗体水平,于免疫后第28天分别使用HN1201株和闽A株攻毒并观察,之后测定体温,测定攻毒后第7和14天PRV gE抗体,及攻毒后0~8 d的排毒情况。结果显示,HN1201-ΔgE免疫组较Bartha-K61免疫组gB抗体和中和抗体产生早,且抗体水平较高。两个免疫组试验猪在攻毒后虽然均无明显临床症状,且免疫组织化学检测（IHC）组织中的病毒抗原均为阴性,但HN1201-ΔgE免疫组试验猪脏器未见任何病理损伤,Bartha-K61免疫组试验猪部分脏器具有病理损伤。与未免疫对照组相比,2个免疫组试验猪在HN1201株和闽A株攻毒后,gE抗体转阳时间晚且排毒率低,HN1201-ΔgE免疫组gE抗体水平整体均低于Bartha-K61免疫组,攻毒后排毒检测中,Bartha-K61免疫组于2个毒株攻毒后第3~5天可检测到排毒,而HN1201-ΔgE免疫组全程未检测到排毒。研究结果表明,灭活疫苗（HN1201-ΔgE株）对PRV流行毒株和经典毒株均可提供完全保护。     

猪源伪狂犬病病毒传代致弱LA2017株的安全性和免疫效力研究

为检测猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株作为疫苗后选株的安全性及免疫效力。本研究对4日龄初生仔猪和产前1个月妊娠母猪免疫LA2017株后的安全性、28～35日龄仔猪免疫效力以及免疫猪后排毒和同群传播性进行了研究。结果显示:滴鼻接种4日龄仔猪和肌肉注射产前1个月的妊娠母猪,均无任何临床症状,表明该疫苗株具有良好的安全性;肌肉注射接种28～35日龄的仔猪,免疫后7 d产生对PRV变异株AH02LA的完全保护并且可以阻止排毒,免疫14 d后攻毒均未发病和排毒,而PRV Bartha K61株免疫猪后7 d攻毒,有4头猪出现了体温升高,鼻拭子样品均检出病毒,免疫后14 d和21 d时对试验猪攻毒,PRV Bartha K61株免疫组均有猪发病,且鼻拭子样品均检出病毒;在抗体产生水平方面,PRV LA2017株免疫后14 d产生高水平中和抗体,PRV中和指数抗体≥10 000,且维持至免疫后5个月,而Batha-K61组免疫后1个月至3个月针对PRV变异株AH02LA的中和指数仅为178～1000,且4个月就开始下降;在同群感染方面,PRV LA2017株肌肉注射接种28～35日龄仔猪后14 d内均未从鼻拭子和肛门拭子检出排毒,gB抗体全部转为阳性,同群非免疫接种猪PRV gB和gE的ELISA抗体均为阴性,表明PRV LA2017株安全性好,无横向传播,不引起同群感染。结果表明,PRV LA2017株作为疫苗株对猪伪狂犬变异株的保护效果显著优于Bartha K61株,该毒株安全性好、抗体水平高和持续时间长,是一株极具开发价值的猪伪狂犬病流行株的弱毒疫苗候选株。     

猪伪狂犬病毒gB、gC和gD蛋白多抗制备及交叉中和抗体效价测定

为研究猪伪狂犬病毒(PRV)主要免疫原性基因的抗原变异情况,本研究构建了PRV变异株JS-2012和弱毒疫苗株Bartha-K61的g B、g C和g D基因重组真核表达质粒。通过基因枪途径免疫新西兰大白兔,对制备的兔源多克隆抗体进行交叉中和抗体效价的测定。结果显示,JS-2012和Bartha-K61株的g C蛋白和g D蛋白多抗对PRV JS-2012变异株、SC经典强毒株和Bartha-K61弱毒疫苗株的交叉中和效价均无显著差异;而两个病毒株的g B蛋白多抗对JS-2012和SC株的中和效价较低,分别为1∶29.0~56.7和1∶56.2~137.0,对Bartha-K61株以及其他毒力基因缺失弱毒疫苗株的中和效价较高,分别为1∶75.0~490.0和1∶198.6~986.9,差异显著,推测该结果可能与PRV毒力基因缺失有关。本研究为进一步鉴定PRV流行株的抗原变异奠定基础。     

高剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM-F92疫苗株对低剂量伪狂犬病毒Bartha-K61疫苗株的免疫干扰研究

为研究高剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92疫苗株对低剂量伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61疫苗株是否存在免疫干扰作用,本研究对其从体液免疫水平、免疫攻毒保护水平及病理学变化等方面进行评价。结果表明,二联免疫组抗体消长规律与低剂量PRV Bartha-K61株免疫对照组抗体消长规律相一致,二联免疫组中高剂量PRRSV TJM-F92株未抑制低剂量PRV Bartha-K61株抗体生成;二联免疫组与低剂量PRV Bartha-K61免疫对照组对PRV JL1株强毒攻击保护率均为5/5;免疫病理学研究结果表明,两组免疫组攻击PRV JL1株强毒后各组织器官病理变化轻微;二联免疫组与低剂量PRV Bartha-K61免疫对照组均可对PRV强毒攻击产生良好的保护效果。综上,高剂量PRRSV TJM-F92株对低剂量PRV Bartha-K61株无免疫干扰作用。     

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)对变异株的保护效力

本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)后,抵抗伪狂犬病病毒(PRV)变异株攻击的保护效果。取4~6周龄PRV抗体阴性仔猪,接种猪伪狂犬病活疫苗,1周后用PRV变异株(AH02LA株)攻毒,检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。疫苗免疫组在免疫后7 d均可以检测到gB抗体。攻毒对照组攻毒后出现典型伪狂犬症状,发病率为100%,死亡率为60%,所有猪只鼻拭子均检出排毒,所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。免疫组的猪只攻毒后,所有猪只均未出现明显临床症状,部分猪只鼻拭子检出排毒,排毒持续时间缩短,排毒量显著减少,所有免疫猪只肺部未见明显病变。结果表明:伪狂犬病活疫苗免疫猪后对PRV变异株的攻击具有良好的保护效果。     

评估3种不同毒株的猪伪狂犬病活疫苗的免疫效果

猪伪狂犬病病毒变异株的流行对伪狂犬病的防控提出了严峻挑战,传统的疫苗对新流行毒株不能提供完全的保护。为评估3种不同毒株的活疫苗C株、HB2000株、Bartha-K61株的免疫效果,在某猪伪狂犬病gE抗体阴性猪场进行试验。结果显示,虽然3组疫苗1次和2次免疫后gB抗体阳性率达到100%,但是中和抗体的效价差异显著。从经典毒株HB-J和变异毒株CW的中和试验结果看,C株产生的平均中和抗体效价均为最高,显著高于HB2000株和Bartha-K61株,提示C株免疫效果优于HB2000株和Bartha-K61株,可以作为防控猪伪狂犬病的高效疫苗。     

伪狂犬病病毒GD1406变异株的抗原性分析

为了解近年来广东省伪狂犬病病毒(PRV)变异情况,本研究从猪场收集Bartha-K61活疫苗免疫后的猪血清559份,经ELISA筛选出326份gB抗体阳性且gE抗体阴性的猪血清,进行中和试验,分析血清中的疫苗抗体对Bartha-K61株和临床分离到的PRV GD1406野毒株的中和能力。进一步应用小鼠进行交叉免疫保护性试验。结果显示,187份gB阳性且gE阴性的猪血清样品对Bartha-K61株和PRV GD1406野毒株的平均中和抗体滴度分别为1:57和1:13,并且免疫Bartha-K61株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率仅为20%,而免疫PRV GD1406野毒株使小鼠免受Bartha-K61株致死性攻击的保护率为100%,免疫灭活PRV GD1406野毒株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率为40%。根据试验结果推测,PRV GD1406野毒株与Batha-K61株之间存在抗原差异性,现用疫苗不能有效抵抗PRV变异株攻击。本研究结果将为PRV的防控提供实验依据,为研制PRV新疫苗提供新的思路。     

我国猪伪狂犬病变异株研究概况

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的、严重危害养猪业的一种烈性传染病。在过去的几十年里,我国通过在猪群中广泛使用Bartha-K61株基因缺失弱毒疫苗,使PR得到了有效控制。但自2011年以来,在全国范围内,许多Bartha-K61疫苗免疫猪群出现了PR疫情。研究证实,该疫情是由PRV变异株引起的,与以往毒株相比,PRV变异株致病性明显增强,且Bartha-K61疫苗不能对猪只提供完全的免疫保护。目前针对PRV变异株的疫苗正在研制中,其中基因缺失活疫苗能够对当前流行的PRV变异株提供完全的免疫保护,这些疫苗大多处于转基因安全评价阶段。在诊断方法上,已经建立了能够有效区分Bartha-K61疫苗株、PRV经典强毒株和当前流行的变异株的三重荧光定量PCR方法。利用安全有效的基因缺失疫苗和配套的鉴别诊断技术,并结合有效的生物安全防控措施,对PR进行净化,是未来必由之路。本文对我国当前PR的流行病学、诊断方法、疫苗研制和防控策略等进行了简述和讨论。     

江苏省猪伪狂犬病流行病学调查及两种疫苗免疫效果评估

为了掌控江苏地区规模化猪场伪狂犬病野毒的感染情况及其流行性趋势,比较变异株猪伪狂犬病疫苗(C株)和Bartha-K61疫苗的免疫防控效果。于2017年5月份至2019年1月份对江苏地区59个规模场进行采样,通过间接ELISA方法检测猪群中的gE抗体来鉴定猪群是否被伪狂犬病野毒感染。另外,在一猪伪狂犬病阳性的规模猪场进行变异株猪伪狂犬病疫苗(C株)和Bartha-K61疫苗的防控效果的实验,通过检测猪伪狂犬病gE,gB抗体及中和抗体来判定猪群的猪伪狂犬病抗体保护水平。显示4 608份检测血样中,gE阳性1 681份,阳性率36%,母猪群gE阳性率46%,育肥猪群gE阳性率28%,59个猪场中育肥阶段gE阳性的猪场22个,占比37%。在其中一个商品猪群gE抗体100%阳性猪场进行2组猪伪狂犬病疫苗的实验,通过实验2组商品猪gE抗体18周龄至出栏前均为阴性,同时检测发现变异株疫苗(C株)对经典株和变异株的中和抗体效价均高于Bartha-K61疫苗。结果表明,江苏地区猪伪狂犬病感染压力较大,另外C株疫苗相对于进口的Bartha-K61株疫苗在本场的免疫效果更佳。     

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)免疫产生期和免疫持续期的研究

为评价猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)的免疫保护效力,本研究对3批疫苗分别进行免疫产生期试验和免疫持续期试验。免疫产生期试验中将3批疫苗以单剂量免疫仔猪,在免疫后2、3、4、5、6 d连同对照组分别攻击伪狂犬病强毒,结果表明猪伪狂犬病活疫苗免后5 d即可产生坚强的免疫保护力。免疫持续期试验中将3批疫苗以单剂量免疫母猪,免疫后12、14个月连同对照猪分别攻击伪狂犬病强毒,结果显示免疫母猪及其所产仔猪均健康存活,表明猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)的免疫持续期可长达14个月。     

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)最小免疫剂量的研究

为了确定猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)的最小免疫剂量,本研究将3批猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)分别稀释成10TCID_(50)/mL、102.0TCID_(50)/mL、103.0TCID_(50)/mL,每批疫苗各个稀释度分别免疫仔猪1.0 mL/头,并设攻毒对照组和阴性对照组。免后10 d连同攻毒对照组用伪狂犬病病毒GD1株进行攻毒保护试验,阴性对照组不攻毒。结果表明,10TCID_(50)/头和102.0TCID_(50)/头的免疫剂量在免疫后10 d依然无法提供完全的免疫保护,保护率为20%～80%(1/5～4/5);103.0TCID_(50)/头的免疫剂量能够保护仔猪抵抗PRV强毒的攻击,保护率为100%(5/5);攻毒对照组发病率为100%(5/5),死亡率为80%(4/5);阴性对照组全部健活。由此确定猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)最小免疫剂量为103.0TCID_(50)/头。     

猪伪狂犬病病毒疫苗株Bartha-K61在犬科动物体内的安全性评价及免疫实验

为了对猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗株Bartha-K61在犬科动物体内的安全性和免疫原性作出评价,通过3种免疫途径(肌肉注射、滴鼻免疫和口服免疫)对犬进行免疫(2 mL,6×10 8PFU/mL),并在免疫结束后通过组织病理切片、免疫组化、临床表现、产仔性能、排泄物中病毒存留情况进行了检测.结果发现,在PRV易感器官内未发现病毒抗原,且疫苗接种犬体温正常,精神状态良好,产仔正常,无任何不良症状,排泄物中亦无病毒粒子残留;同时,通过对免疫后犬只的细胞免疫水平、体液免疫水平和中和试验的检测发现,3种免疫途径均可有效地刺激机体产生免疫应答,且中和抗体水平达到较高水平.从而证明,PRV Bartha-K61在犬科动物体内安全有效,为以PRV为栽体表达犬科动物疫病的抗原基因重组活栽体疫苗的研制提供了科学依据.     

PRV变异株的分离及抗原差异性分析

2011年以来,我国多个省份免疫过伪狂犬病疫苗的规模化猪场发生新生仔猪出现神经症状和死亡的现象,并已确定为猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株感染所引起。为探究现PRV流行株特性,2014年下半年以来,我们从免疫过伪狂犬疫苗却暴发伪狂犬病的猪场分离到3株伪狂犬病病毒(分别为XP,QJ,LY株),并对其gE、gB、gC全基因进行测序和序列分析,序列比对结果显示,3株PRV分离株与2012年后分离毒株有较高的同源性;进化树分析显示,3株PRV分离株的gE基因与2012年后分离毒株处在同一进化树分支上,而gB、gC则分别形成了独立的小分支,但仍处在同一较大分支上。我们对当地广泛使用的疫苗株HB-98和Bartha-K61活疫苗免疫血清与Ea,HNX株以及3株PRV分离株进行中和试验,结果显示,HB-98和Bartha-K61活疫苗免疫血清对早期分离株Ea株的中和能力高于HNX、XP、QJ、LY株,但在NX、XP、QJ、LY株之间无明显差异,表明3株PRV分离株的抗原性与2012年后分离毒株无明显差异,而与传统毒株Ea株的抗原性存在一定差异。     

某猪场伪狂犬野毒感染情况跟踪调查及分析

<正>猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一种高度接触性传染病。疫苗接种虽可降低该病的发病率,但并不能完全阻止野毒的感染和排毒。笔者通过近三年的时间跟踪检测驻马店地区某猪场伪狂犬g E抗体,从时间上掌握PRV野毒在猪群中的扩散情况,并针对目前PRV野毒感染扩散情况进行了分析。1猪场基本情况该猪场从1993年4月份开始养猪,现母猪存栏约800头。猪场猪舍陈旧,饲养管理条件一般。使用的伪狂犬疫苗均为Bartha-K61株基因缺失冻干活     

猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断、血清学调查以及控制措施

目的为某规模化猪场猪伪狂犬病病毒野毒株感染防控工作提供科学的免疫防控方案。方法对某发病猪群（采用Bartha-K61经典毒株疫苗进行了猪伪狂犬病免疫）进行流行病学调查,并采用ELISA方法检测其猪伪狂犬病gB抗体和gE抗体水平。结果根据调查、解剖和血清抗体检测结果,初步确诊该发病猪群为猪伪狂犬病野毒感染。通过采取紧急免疫伪狂犬病HB2000毒株疫苗、调整免疫程序和配合药物治疗等措施,育肥猪死亡率从2.56%降低至0.60%;除了4周龄及12周龄猪群外,其余猪群伪狂犬病野毒抗体水平全部下降;种公猪、8周龄、10周龄、14周龄猪群伪狂犬病野毒抗体阳性率均为0。结论Bartha-K61经典毒株疫苗并不能提供完全的保护力,通过紧急免疫与流行毒株同源性较高的HB2000毒株疫苗,加强生物安全管理工作,能够有效控制猪伪狂犬病野毒感染。     

猪伪狂犬病病毒HDDJ株的分离鉴定

广东省某猪场常规免疫猪伪狂犬病疫苗(Bartha-K61株)的母猪流产,疑似为猪伪狂犬病病毒感染。为确定发病原因,将流产胎儿的脑、淋巴结、肺脏研磨混合液接种Vero细胞,形成稳定细胞病变(CPE),并测定其细胞半数感染量(TCID50),通过PCR鉴定、测序比对、进化树分析,确定感染病毒及基因型,动物回归实验判定病毒致病性。结果表明,分离毒株为PRV中国变异株,命名为HDDJ株,与猪伪狂犬病疫苗Bartha-K61株亲缘关系较远。     

猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性的研究

将猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，传代细胞源）基础毒种F7传至F13，并将PRV F8～PRV F13六个代次毒种接种仔猪进行安全性检验，PRV F8、PRV F10、PRV F13三个代次毒种接种仔猪进行免疫原性检验，用以研究猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，传代细胞源）生产用毒种不同代次生物学特性。安全性检验结果显示，各代次毒种经颈部肌肉接种仔猪，观察期内仔猪精神、食欲、体温均正常；免疫原性检验结果显示，免疫组仔猪攻毒后精神、食欲、体温均正常，对照组仔猪攻毒后体温升高，全部发病并死亡。以上结果表明，猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，传代细胞源）不同代次的生产毒种对仔猪均安全且保持良好的免疫原性。     

猪伪狂犬病病毒变异株TK/gE/gI三基因缺失突变株在小鼠体内的免疫原性

应用PCR方法扩增了猪伪狂犬病病毒(PRV)NY株TK基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,同时插入绿色荧光蛋白标记基因,构建转移质粒pUC-TKLRE,并与PRV变异株gE/gI双基因缺失突变株rPRV NY-gE~-/gI~-的基因组DNA共转染ST细胞,通过蚀斑纯化,获得表达荧光蛋白的PRV三基因缺失突变株。分别用PRV三基因缺失突变株、rPRV NY-gE~-/gI~-、PRV商品活疫苗Bartha-K61株、DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性小鼠,2周后对小鼠进行第2次免疫,且首免后6周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒试验。结果显示,成功拯救PRV三基因缺失突变株rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--EGFP~+,且对小鼠是安全的。间接ELISA试验和病毒中和试验证实rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--EGFP~+使小鼠机体产生了较高滴度的PRV特异性抗体,小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定证明,其诱导小鼠机体产生了细胞免疫应答。攻毒试验结果显示,rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--EGFP~+对PRV强毒NY株的攻击具有一定的抵抗力。本试验获得的PRV三基因缺失病毒rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--EGFP~+有望成为一种防控当前PR流行的疫苗株。     

猪伪狂犬病的诊断和防控效果评估

为了研究山西某规模化猪场发病原因、感染猪伪狂犬病毒(PRV)毒株及防控措施的有效性。通过观察分析猪群生产指标、临床表现和剖检变化,采集病猪组织、血清和猪场使用的疫苗,采用实时荧光定量PCR(qPCR)、病毒分离培养、PRV gC基因测序、中和抗体检测和ELISA抗体检测等方法,确诊疾病、鉴定病原、评估防控效果。表明猪场发病猪只检测PRV核酸阳性,从仔猪脑组织中分离到PRV,将其命名为PRV-TZ,母猪gE抗体阳性率从15.00%升高到84.62%,确诊猪场感染了PRV,且此毒株gC基因与国内2012年后流行变异毒株TJ、CD 2019和SN 2018等毒株同源性高达100.00%,与市场上HB2000弱毒疫苗同源性为99.70%,与C株弱毒疫苗同源性为95.82%,推断该猪场因免疫不能提供完全保护而造成猪只发病。猪场更换成HB2000疫苗免疫后2个月,母猪流产率降至0%,仔猪成活率恢复到发病前,针对PRV-TZ株的中和抗体1∶32所占比例由更换疫苗前的0.00%升高到68.75%,预测当中和抗体1∶32以上的比例达到60%时可阻止猪群继续感染。     

猪伪狂犬病流行状况和疫苗应用的研究进展

近年来,猪伪狂犬病在国内许多Bartha-K61疫苗免疫的猪场暴发,传播迅速,严重危害我国养猪业的发展,引起了广泛关注和研究。相关研究表明,引起该病大规模暴发的病原为发生变异的猪伪狂犬病病毒(PRV),多数猪场的PRV野毒株感染普遍存在,因此,有必要对新型伪狂犬病病毒变异株的抗原性、致病性和分子特征及其疫苗的研制等方面进行研究。针对我国猪伪狂犬病的流行和疫苗应用的研究进展进行阐述,以便为研制新型疫苗及猪伪狂犬病的防控提供参考。