胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞CPT-Ⅰ和CPT-ⅡmRNA表达的影响

体外原代培养犊牛肝细胞,添加不同浓度的胰岛素（insulin,INS）（0、1、10、100、1 000nmol/L）和胰高血糖素（glucagon,GLN）（0、1、10、100、1 000nmol/L）,每个处理做3个重复,分别培养1h后,提取总RNA。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法,检测肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅰ）和肉碱棕榈酸转移酶Ⅱ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅱ）mRNA表达的变化。结果显示,随着培养液中INS含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量逐渐降低,呈现一定的剂量依赖性。随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量均升高,呈现一定的剂量依赖性,且当GLN的添加浓度高于100nmol/L时,CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量显著升高（P〈0.01）。结果表明,INS可在一定程度上抑制脂氧化关键酶的表达,GLN可显著促进脂氧化关键酶的表达。     

胰岛素、胰高血糖素和神经肽Y对体外培养犊牛肝细胞硬脂酰CoA去饱和酶mRNA表达的影响

在应用实时荧光定量PCR法观察胰岛素(In)、胰高血糖素(GLN)、神经肽(NPY)对体外培养新生犊牛肝细胞硬脂酰CoA去饱和酶(Stearoyl CoA desaturase,SCD) mRNA丰度的影响.结果显示,随着培养液中In含量的升高,肝细胞中的SCD mRNA表达逐渐升高(P＜0.05),呈现明显的剂量依赖促进效应;随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞SCD mRNA丰度表达逐渐减弱,高血糖素处理组SCD mRNA表达均极显著低于对照组(P＜0.01);而随着NPY质量浓度在0～1 000 ng/L之间逐渐上升,肝细胞SCDmRNA的表达水平不断升高,各处理组显著高于对照组,除50 ng/L处理组和500 ng/L处理组之间差异不显著外,其他处理组之间差异显著(P＜0.05).结果表明,胰岛素和神经肽Y促进SCD mRNA表达,胰高血糖素抑制SCD mRNA表达.     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA表达的影响

为了阐明神经内分泌因子在奶牛肝脂蛋白组装与转运过程中的调控作用,通过向体外培养的新生犊牛肝细胞添加胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白,采用内对照RT-PCR方法检测神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)mRNA丰度的影响。结果显示,随着细胞培养液中胰岛素和胰高血糖素浓度升高,MTP mRNA的丰度呈现剂量依赖性下降(P<0.01);随着瘦蛋白浓度的增加,MTP mRNA的丰度先升高后降低(P<0.01或P<0.05)。这表明胰岛素和胰高血糖素对肝细胞MTP mRNA表达具有抑制作用,呈现剂量依赖性;瘦蛋白对肝细胞MTP mRNA表达具有低剂量促进而高剂量抑制的双重作用,且均呈现剂量依赖性。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞脂合成作用的影响

为确定胰岛素(insulin,INS)和胰高血糖素(glucagon,GLN)对奶牛肝细胞脂合成作用的影响,本试验体外培养犊牛原代肝细胞,分别用不同浓度的INS和GLN处理肝细胞:对照组(0nmol/L)、浓度梯度组(1,10,100,1 000nmol/L)。培养1h后分别用免疫印迹(Western blot,WB)方法、荧光定量PCR(qRT-PCR)方法以及细胞免疫荧光(immunofluorescence,IF)方法检测INS和GLN处理体外培养肝细胞对关键转录因子固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)mRNA表达水平,SREBP-1c核质分布以及下游靶基因脂代谢关键酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FAS)mRNA表达水平的影响。结果显示:INS处理使SREBP-1c的表达水平和转录活性显著升高,入核量显著增加,其下游的脂合成关键酶ACC和FAS的基因表达水平也显著升高。而与之相反,GLN处理使SREBP-1c的表达水平和转录活性显著降低,入核量显著减少,其下游的脂合成关键酶ACC和FAS的基因表达水平也显著降低。以上结果说明,INS可通过增强SREBP-1c的活性从而促进肝细胞脂合成,增加肝脂沉积;而GLN则通过抑制SREBP-1c的活性从而降低肝细胞脂合成。     

非酯化脂肪酸对原代培养犊牛肝细胞胰岛素信号通路的影响

旨在探讨非酯化脂肪酸(nonestesterified fatty acids,NEFAs)对体外原代培养犊牛肝细胞胰岛素信号通路的影响及SIRT1在其中的调控作用。选择培养48h的原代犊牛肝细胞,添加不同浓度的NEFAs(0、0.6、1.2、1.8mmol/L),继续培养12h,胰岛素处理组在收样前用100nmol/L胰岛素处理30min,每个浓度3个重复。另外选取已培养48h的细胞,用SIRT1抑制剂Nicotinamide(10mmol/L)处理12h,胰岛素处理组在收样前用100 mmol/L胰岛素处理30min。运用免疫印迹Western blot方法,检测NEFAs和Nicotinamide对肝细胞胰岛素信号通路关键蛋白IR和Akt的磷酸化水平及SIRT1蛋白表达水平的影响。结果显示,与对照组相比,1.2、1.8 mmol/L NEFAs组胰岛素刺激的IR磷酸化水平显著降低(P0.01),而Akt的磷酸化程度在NEFAs浓度为0.6 mmol/L时即显著降低(P0.01),同时,SIRT1的蛋白表达水平在NEFAs为1.2、1.8mmol/L显著降低(P0.01);添加SIRT1抑制剂显著降低SIRT1的蛋白表达水平(P0.01),同时胰岛素刺激的Akt磷酸化水平也显著降低(P0.01)。结果表明,高浓度的NEFAs可以损伤体外原代培养肝细胞的胰岛素信号通路,SIRT1在NEFAs损伤的胰岛素信号通路中发挥重要作用。     

生糖底物和神经内分泌因子对新生犊牛肝细胞PEPCK-C mRNA表达水平的影响

在原代单层培养的新生犊牛肝细胞培养液中分别加入不同浓度丙酸钠、丙酮酸钠、胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白，培养12h后，应用半定量RT-PCR方法检测体外培养的肝细胞PEPCK—C mRNA的丰度。结果显示，随着丙酸钠、丙酮酸钠浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度均先升高后下降（P〈0．01）；随胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度分别剂量依赖性地降低、升高（P〈0．01）和无显著变化。表明，丙酸钠、丙酮酸钠能通过上调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而促进肝糖异生代谢，但上调作用是有限的；胰岛素能通过下调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而抑制肝糖异生代谢，且下调作用呈剂量依赖性；胰高血糖素与胰岛素作用刚好相反；瘦蛋白未起直接的调节作用。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞FAS mRNA表达的影响

为阐明胰岛素、胰高血糖素与脂肪酸合成酶（FAS）的关系,在体外培养良好的脂肪细胞中添加不同浓度的胰岛素（INS）、胰高血糖素（GLU）,每个激素设置6个浓度梯度,培养12h后,通过荧光定量PCR技术,观测胰岛素、胰高血糖素对FAS mRNA丰度的影响。结果显示,胰岛素促进了FAS mRNA的表达,而胰高血糖素抑制了FAS mRNA的表达。结果表明,胰岛素和胰高血糖素能直接调控肝细胞中FAS mRNA的表达。     

罗格列酮对非酯化脂肪酸体外诱导的犊牛原代肝细胞线粒体功能紊乱的影响

本试验旨在探讨非酯化脂肪酸(Nonestesterified fatty acid,NEFAs)对体外原代培养犊牛肝细胞线粒体功能以及罗格列酮对NEFAs诱导的线粒体功能紊乱的影响。体外添加NEFAs(1.8mmol/L)处理犊牛原代肝细胞不同时间,运用Western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测线粒体呼吸链复合体IV(COX IV)蛋白水平及mRNA水平的影响。另外选取细胞,罗格列酮(10nmol/L)预处理细胞24h后添加NEFAs(1.8mmol/L)处理9h。运用Western blot和qRT-PCR方法检测PGC-1α、Mfn-2的蛋白表达水平及COX IV mRNA表达水平。结果显示,随着NEFAs作用时间的增加,与0h组相比,NEFAs处理5h以上时COX IV蛋白表达水平极显著降低(P0.01),处理7~12h时COX IV mRNA表达水平呈显著降低(P0.05)。添加罗格列酮后,罗格列酮可极显著增加COX IV mRNA水平,PGC-1α、Mfn-2蛋白表达水平(P0.01)。结果表明,NEFAs可诱导犊牛原代肝细胞发生线粒体功能紊乱,罗格列酮可缓解由NEFAs诱导的犊牛原代肝细胞线粒体功能紊乱。     

日粮补充脂肪酸钙对泌乳早期奶牛泌乳性能、血液生化指标及激素浓度的影响

试验旨在研究日粮补充脂肪酸钙对泌乳早期奶牛泌乳性能、血液生化指标及激素浓度的影响。选择30头泌乳早期荷斯坦奶牛,随机均分为3组,每组10头,每头为1个重复。对照组饲喂基础日粮,试验组分别在基础日粮上添加200 g/d和400 g/d脂肪酸钙。试验期8周。结果表明:与对照组相比,200 g/d和400 g/d脂肪酸钙组显著提高泌乳量、标准乳产量、产奶效率、乳脂率、葡萄糖、胰岛素和胰岛素样生长因子1(IGF-1)(P0.05),显著降低游离脂肪酸、乙酰乙酸、β-羟丁酸、胰高血糖素和瘦素浓度(P0.05),200 g/d和400 g/d脂肪酸钙组间泌乳量、标准乳产量、料乳比、乳脂率、乳糖、乳蛋白、乳非脂固形物率、血清葡萄糖、游离脂肪酸、乙酰乙酸、β-羟丁酸、胰岛素、IGF-1、胰高血糖素和瘦素浓度差异不显著(P0.05)。综上所述,日粮添加200 g/d和400 g/d脂肪酸钙通过调节泌乳早期奶牛体内激素浓度,降低血清酮体生成,调节体内能量代谢,提高泌乳量和产奶效率,改善乳品质。     

神经内分泌因子、代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素（In）、胰高血糖素（GLN）、瘦素（LEP）和代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）、葡萄糖（GLU）在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）法观察了神经内分泌因子、代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（glucagon receptor，GLNR）mRNA丰度的影响。结果显示：随着培养液中In、NEFA、BHBA和GLU的升高，GI。NRmRNA表达逐渐增加（P〈0．01）；随着培养液中GLN浓度的升高，GLNRmRNA表达逐渐降低（P〈0．01）；而随着培养液中瘦素浓度的升高，GLNRmRNA的表达呈先升高后降低的趋势（P〈0．01）。表明：神经内分泌因子In、GLN、LEP和代谢产物NEFA、BHBA、GLU直接调控新生犊牛肝细胞GLNRIT／RNA的表达。     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素(In)、胰高血糖素(GLN)、瘦素(LEP)在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR ( real time fluorescent quantitative PCR)法观察了神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（glucagon receptor，GLNR）mRNA丰度的影响。结果显示：随着培养液中In的升高，GLNR mRNA表达逐渐增加（P<0.01）；随着培养液中GLN浓度的升高，GLNR mRNA表达逐渐降低（P<0.01）；而随着培养液中LEP浓度的升高，GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（P<0.01）。表明：神经内分泌因子In、GLN、LEP直接调控奶牛肝脏GLNR mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养肝细胞DGAT2mRNA的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素、胰高血糖素在奶牛脂肪代谢过程中的调控作用,用荧光定量PCR方法检测胰岛素、胰高血糖素对肝细胞二酰基甘油酰基转移酶（DGAT2）mRNA丰度的影响。结果表明低浓度的胰岛素能促进脂肝细胞内DGAT2mRNA的表达;胰高血糖素抑制脂肝细胞内DGAT2mRNA表达。由此证明：胰岛素和胰高血糖素能直接调控肝细胞中的DGAT2基因mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明胰岛素、胰高血糖素在奶牛脂肪代谢中的调控作用,应用RT-PCR法观察了胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞胰高血糖素受体(GLNR)mRNA丰度的影响。结果发现,随着培养液中胰岛素质量浓度的升高,GLNR mRNA表达逐渐增加(P<0.05);而随着培养液中胰高血糖素浓度的升高,GLNR mRNA表达逐渐降低(P<0.01)。本研究结果表明,胰岛素、胰高血糖素直接调控奶牛脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA的表达。     

INS、GLN和LP对体外培养牛脂肪细胞内HSL、LP的mRNA丰度的影响

为了阐明胰岛素（INS）、胰高血糖素（GLN）和瘦蛋白（LP）对牛脂肪细胞内激素敏感酯酶（HSL）、LP的mRNA表达的调控作用，本试验采用体外原代培养牛脂肪细胞的培养液中添加不同浓度的胰岛素（0、5、10、20、50、100mmol／L）、胰高血糖素（O、25、100、200、500、1000pg／mL）和瘦蛋白（O、2．5、5、10、50、100ng／mL），培养12h后，应用建立的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法检测牛脂肪细胞内HSL、LP的mRNA丰度。结果表明：胰岛素对牛脂肪细胞内HSL的mRNA表达呈现剂量依赖性抑制作用，对LP的mRNA表达呈现剂量依赖性促进作用。胰高血糖素对牛脂肪细胞内HSL的mRNA表达呈现剂量依赖性促进作用，对牛脂肪细胞内LP的mRNA表达无作用。瘦蛋白对牛脂肪细胞内HSL的mRNA表达先呈现剂量依赖性促进作用，后呈现抑制作用。但对牛脂肪细胞内LP的mRNA表达呈现剂量依赖性抑制作用。     

脂多糖对体外培养山羊瘤胃上皮细胞的影响

为了鉴定脂多糖(LPS)对体外培养的山羊瘤胃上皮细胞炎性因子表达及浓度的影响,试验采用体外培养细胞法培养山羊瘤胃上皮细胞,添加不同浓度的LPS(1,5,10,50,100 mg/L)刺激山羊瘤胃上皮细胞,用MTT法筛选最佳刺激浓度,收集细胞;经qRT-PCR法分析核因子κb(p65)[NF-κb(p65)]、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)基因mRNA相对表达量。结果表明:50 mg/L组细胞抑制率(IR)接近10%,初步确定LPS抑制细胞生长最佳浓度为50 mg/L; 50 mg/L组NF-κb(p65)的mRNA相对表达量极显著高于其他浓度组(P0. 01); 10 mg/L组TNFα的mRNA相对表达量极显著高于1,5,100 mg/L组(P0. 01),50 mg/L组次之; 10 mg/L组IL-1β的mRNA相对表达量极显著高于其他浓度组(P 0. 01),50 mg/L次之; 50 mg/L组IL-6的mRNA相对表达量最高,极显著高于1 mg/L组和100 mg/L组(P0. 01),与5,10 mg/L组相比差异不显著(P0. 05)。说明LPS体外诱导山羊瘤胃上皮细胞炎性反应的最佳浓度为50 mg/L。     

瘦素对体外培养新生犊牛脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明瘦素在奶牛脂肪代谢中的调控作用,应用荧光定量RT-PCR法观察了瘦素对体外单层原代培养脂肪细胞胰高血糖素受体(glucagon receptor,GLNR)mRNA丰度的影响。结果表明:随着培养液中瘦素浓度的升高,GLNR mRNA的丰度呈现先升高后降低的趋势(P<0.01),瘦素对GLNR mRNA的表达具有双重作用;研究结果表明,瘦素直接调控新生犊牛脂肪细胞GLNR mRNA的表达。     

瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明瘦素（Leptin）在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用,应用RT-PCR法观察了瘦素对体外培养肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果发现,随着培养液中瘦素浓度的升高,GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（p〈0.01）;研究结果表明瘦素直接调控奶牛肝胰高血糖受体mRNA的表达。     

异丁酸对犊牛瘤胃及小肠黏膜基因表达的影响

本试验旨在研究饲粮补充异丁酸对断奶前后犊牛瘤胃及小肠发育相关基因表达的影响。选取平均体重(40.0±0.2)kg、发育正常、30日龄的中国荷斯坦公犊牛36头,随机分为4组,对照组饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮的基础上添加异丁酸3、6和9 g/d。分别于45、60(断奶)、90日龄每组屠宰3头并采集瘤胃及小肠黏膜组织样品,通过实时荧光定量PCR技术检测生长激素受体(GHR)、胰岛素受体(INSR)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1(HMGCS1)和钠-葡萄糖共转运载体1(SGLT1)的mRNA表达量。结果表明:犊牛体重和GHR、INSR、HMGCS1 mRNA的表达量均随着犊牛日龄的增长而出现显著增长(P0.05),而SGLT1mRNA的表达量在断奶前后随着日龄的增长先下降后增长,变化显著(P0.05)。45和60日龄时,犊牛体重在9 g/d异丁酸组显著高于对照组(P0.05),但与6 g/d异丁酸组差异不显著(P0.05)。各日龄6和9 g/d异丁酸组瘤胃和小肠各部位GHR、INSR、HMGCS1 mRNA的表达量均高于对照组,且这2组之间差异不显著(P0.05)。添加异丁酸对45日龄和90日龄犊牛小肠各部位SGLT1 mRNA的表达量没有显著影响(P0.05);60日龄6和9 g/d异丁酸组十二指肠SGLT1 mRNA表达量显著高于对照组和3 g/d异丁酸组(P0.05),9 g/d异丁酸组空肠近端、空肠远端和回肠SGLT1 mRNA表达量显著高于对照组(P0.05),但与6 g/d异丁酸组差异不显著(P0.05)。综合以上结果,饲粮中补充异丁酸能够促进犊牛生长和瘤胃及小肠黏膜的发育,本试验条件下其适宜添加量为6 g/d。     

过瘤胃葡萄糖对奶牛能量代谢的影响

本试验随机选取产后10¹5 d,年龄、胎次相近,年产奶量大于6吨的荷斯坦奶牛24头,随机分为4组,每组6头。根据基础日粮精料中每头每天添加200 g、300g、400g和0 g过瘤胃葡萄糖分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和Ⅳ组(对照组),连续饲喂20 d。通过对试验奶牛在饲喂前1 d、饲喂后10d和20d的血液代谢产物(葡萄糖、β-羟丁酸)和激素(胰岛素、瘦素和胰高血糖素)的测定,结果显示,与对照组比较,血浆胰高血糖素水平显著升高(P<0.05),Ⅱ组血浆葡萄糖浓度极显著升高(P<0.01)和血浆胰岛素水平显著升高(P<0.05),Ⅲ组血浆β-羟丁酸浓度显著升高(P<0.05)。而瘦素变化均不显著(P>0.05)。结果表明,过瘤胃葡萄糖能有效的提高奶牛泌乳量和升高血糖水平,降低酮体水平,改善能量负平衡,以200 g和300 g过瘤胃葡萄糖的效果更好。     

糖皮质激素对鸡胚肝细胞脂肪和胆汁酸代谢相关基因表达的影响

为揭示应激导致家禽肝脏代谢异常的机理,本研究探查了糖皮质激素——地塞米松(DEX)对鸡胚肝细胞脂肪和胆汁酸代谢相关基因表达的影响。选取19胚龄的无特定病原体(SPF)鸡蛋,原代培养鸡胚肝细胞(37℃、5%CO2),用0(对照)、200、500、1 000 nmol/L的地塞米松分别处理24 h。结果表明:与对照组相比,高剂量(500、1 000 nmol/L)地塞米松处理显著降低了脂肪代谢相关基因——脂肪酸转运蛋白1 (FATP-1)、固醇调节元件结合蛋白-1C(SREBP-1C)、载脂蛋白B100(APOB100)、肝脏X受体(LXR)以及胆汁酸摄取相关基因Na+/牛磺胆盐共转运体(NTCP)的mRNA相对表达水平(P0.05),显著提高了胆汁酸排出相关基因——胆盐输出泵(BSEP)的mRNA相对表达水平(P0.05);低剂量(200 nmol/L)地塞米松处理显著提高胆汁酸合成相关基因——胆固醇7-羟化酶(CYP7A1)和法尼酯X受体(FXR)的mRNA相对表达水平(P0.05),同时,SREBP-1C的mRNA相对表达水平显著降低(P 0.05),BSEP的mRNA相对表达水平显著上升(P0.05)。由此得出,高剂量糖皮质激素对鸡胚肝细胞的脂肪合成、转运和胆汁酸的摄取具有抑制作用;低剂量糖皮质激素可以促进胆汁酸的合成和排出,部分反应具有剂量依赖性。