一种评价甘蓝枯萎病菌转化子致病力的方法

为建立甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans)转化子致病力评价方法,从接种方法、甘蓝品种、苗龄、病原菌接种体浓度等几方面探索,建立了一种评价甘蓝枯萎病菌转化子致病力差异的体系。结果表明:蘸根法和伤根法均适于甘蓝枯萎病菌转化子致病力的评价,其中伤根法更优;其他适合甘蓝枯萎病菌转化子致病力评价的因素有:甘蓝品种为‘中甘21’,苗龄为三叶期,甘蓝枯萎病菌孢子悬浮液浓度为孢子含量1×106个/mL。该致病力评价方法的建立为甘蓝枯萎病菌转化子致病力衰弱或增强突变体的筛选提供了方法支持,也为下一步尖孢镰刀菌致病机理的解析奠定了基础。     

原生质体法介导真菌遗传转化的研究进展

原生质体法介导真菌遗传转化体系是实现大规模随机、定点突变和菌种改良的方法之一,为研究真菌致病性和侵染机制奠定了基础。原生质体法构建转化体系的步骤包括原生质体的制备、转化与再生,其中关键是原生质体的制备,通常采用酶解法破除细胞壁获得原生质体,其获得率直接影响转化效率。转化通常借助于聚乙二醇(PEG)介导、电击或限制性内切酶法完成,其中PEG介导的原生质体转化法较传统,技术较成熟;电击法操作较简单;限制性内切酶(REMI)介导的整合转化,因其转化效率较高,可产生大量稳定的转化子,正被越来越多地应用于丝状真菌的遗传转化。     

利用插入突变分离小麦全蚀病菌致病性突变体

 利用限制性内切酶介导的整合(restriction enzyme-mediated integration,REMI)技术转化禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.tritici,Ggt),以分离致病性突变体。将含有潮霉素磷酸转移酶基因的质粒pUC ATPH线性化后转化Ggt W-1菌株,从获得的1501个转化体中筛选出1个对小麦品种内乡13完全丧失致病能力的突变体,与野生型出发菌株相比,该突变体生长缓慢。对此突变体进行Southern杂交分析,显示出该突变体是外源质粒单位点串联重复插入的结果。     

原生质体融合技术改良植病生防木霉菌株

以产孢量大，对苯菌灵有抗性，对潮霉素B敏感的哈茨木霉菌株T9和产孢量少，对潮霉素B有抗性，对苯菌灵敏感的康宁木霉菌株Tk7a为亲本，进行原生质体融合，筛选获得抗最高浓度杀菌剂的融合子。所有融合子的产孢量均比亲本菌株Tk7a大。融合子按照菌落形态的不同分成4组，大部分融合子的几丁质酶、葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的活性比亲本菌株高。融合子对棉花猝倒病菌和小麦全蚀病菌的寄生能力基本等同于亲本菌株；融合子对小麦全蚀病的防效比亲本菌株稍好，其刺激麦苗根部生长的能力与亲本菌株相差不大。两个融合子根际竞争能力比亲本菌株T9强，和亲本菌株Tk7a相当。     

甘蓝枯萎病苗期抗性鉴定技术及抗源筛选

为建立快速、有效的甘蓝枯萎病苗期抗性鉴定技术,采用温室盆栽方法,分别对甘蓝枯萎病苗期鉴定的接种浓度、接种方法、接种生育期、接种菌龄及接种适宜温度进行系统筛选与比较,并应用筛选出的最佳方法对108份不同来源的甘蓝资源进行抗枯萎病鉴定与评价。结果表明,甘蓝枯萎病苗期抗性鉴定最适接种浓度为106孢子/mL,接种生育期为2～3叶期,接种方法以将根部土抖落干净后直接浸根为最佳,最适宜发病温度为25～30℃,浸根时间及枯萎病菌菌龄对枯萎病鉴定结果影响不大;从108份不同来源甘蓝资源中筛选出40余份抗枯萎病材料,准确地反映了甘蓝资源对枯萎病的抗性程度。     

通过染色体整合β-1,4-葡聚糖酶基因glu14提高绿色木霉对小麦纹枯病的防治效果

 绿色木霉LTR-2是生物防治菌株。利用来自巨大芽胞杆菌Ap25的β-1,4-葡聚糖酶基因glu14构建木霉表达载体pSilent/glu14,利用限制性内切酶介导法(REMI)转化绿色木霉LTR-2。PCR扩增及Southern杂交证实目的基因已插入木霉转化子的染色体DNA上。转化子的β-1,4-葡聚糖酶水解活性,对小麦纹枯病菌的平板抑制作用及温室防治效果较原始菌株LTR-2明显提高(P<0.01),其中转化子L-10的效果最好,平板抑制率比LTR-2提高了27.0%,温室防治效果比LTR-2提高了26.7%。本试验表明,利用REMI技术,将β-1,4-葡聚糖酶基因重组到木霉染色体DNA上,是获得高效木霉工程菌株的有效手段。     

香梨果萼黑斑病菌Alternaria alternata遗传转化体系的建立及GFP标记菌株的获得

 为建立香梨果萼黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)的原生质体遗传转化体系,本实验以香梨果萼黑斑病菌强致病性菌株LI1为供试材料,研究菌龄、酶系统、酶解时间等对链格孢菌原生质体制备的影响。链格孢菌菌丝在CM液体培养基中培养20 h,以0.7 mol·L^-1 NaCl为稳渗剂,1%裂解酶+1%崩溃酶+1%蜗牛酶的酶液组合下,28 ℃酶解4 h,原生质体制备效率最高。通过PEG/CaCl₂介导法将含有潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白基因的质粒转入链格孢菌LI1,转化子生长表型及外源基因的PCR鉴定结果表明抗性基因已成功整合到香梨果萼黑斑病菌中。成功建立了香梨果萼黑斑病菌链格孢菌的原生质体遗传转化体系,并成功获得GFP标记菌株,为病原菌侵染定殖过程及致病机制研究奠定了基础。     

哈茨木霉LTR-2双价基因重组菌株的构建及其防治效果

本文利用限制性内切酶介导法转化哈茨木霉LTR-2,获得具有双价基因(glu14、chi42)的重组生防菌株.试验得到的木霉转化子具有遗传稳定性,于无药PDA平板上连续转接6次后,在Hyg 200 μg/mL的PDA平板上仍可继续生长.PCR扩增及Southern杂交证实目的基因已随机插入木霉基因组DNA上,本试验转化子均为单拷贝插入.转化子的β-1,4-葡聚糖酶和几丁质酶水解活性较出发菌株LTR-2显著提高(P＜0.01),其中转化子L-15的两种水解酶活性均最高.转化子在温室条件下对番茄晚疫病、茄子猝倒病和黄瓜灰霉病均有较好的防治作用,但不同处理间存在显著性差异(P＜0.01),其中转化子L-15最高,对3种病害的防治效果分别达到了91.5％、94.9％和83.8％,较出发菌株LTR-2处理分别提高了53.5％、55.9％和33.5％.结果表明,利用REMI技术,将β-1,4-葡聚糖酶基因glu14和几丁质酶基因chi42重组到木霉染色体DNA上,是获得高效重组菌株的有效手段.     

农杆菌介导的拟康氏木霉遗传转化及T-DNA插入突变体的筛选

建立并优化了农杆菌介导转化拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii SMF2)获得T-DNA插入突变体的体系,在木霉孢子浓度106个/mL、农杆菌A600=0.15~0.20、乙酰丁香酮浓度为250μmol/mL的条件下共培养36 h转化率最高,转化子可达60~120个/106个孢子。共获得转化子1 000多个,连续转接5代能够稳定遗传,部分转化子表现为生长和形态异常,PCR验证潮霉素B抗性基因已整合进转化子基因组DNA中。该转化体系的建立为开展其生防机理研究和探索菌株改良奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种的转化

 本文针对香蕉枯萎病菌4号生理小种这一对我国香蕉生产构成了极大威胁的检疫性有害生物,建立了根癌农杆菌介导的该生理小种的转化体系,确定了影响转化效率主要因子的最佳条件分别是:共培养乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、共培养时间为48 h、培养温度为25℃、诱导培养基pH值为5.5。此条件下,转化效率达到21~24个转化子/10⁴香蕉枯萎病菌孢子。PCR和Southern杂交分析表明外源的T-DNA已经成功随机地整合到该病原菌基因组中,且多为单拷贝。应用该转化体系已获得近25 000个转化子,为研究该生理小种致病机制奠定了基础。     

Similarity between Copper Resistance Genes from Pseudomonas syringae pv. actinidiae and P. syringae pv. tomato

Twenty-eight strains of Pseudomonas syringae pv. actinidiae isolated in 1984, 1987 and 1988 from kiwifruit orchards in Japan were tested for their resistance to copper sulfate. All strains isolated in 1984 were copper sensitive with a minimum inhibitory concentration (MIC) of cupric sulfate of 0.75 mM. However, some strains isolated in 1987 and 1988 were resistant, with the MIC ranging from 2.25 to 3.0 mM. All copper-resistant strains contained at least one of two plasmids, pPaCul (about 70.5 kb) or pPaCu2 (about 280 kb), or both. In a copper-resistant strain Pa429, the location of the copper-resistance gene(s) was examined by insertional inactivation with Tn5. The MIC of copper sulfate in the copper-sensitive mutant obtained by Tn5 tagging decreased from 2.75 to 0.75 mM. The 14.5 kb BamHI fragment, designated pPaCuB14, containing the same locus mutagenized with Tn5 was cloned from pPaCu1. However, pPaCuB14 did not confer copper resistance in the transformant of copper-sensitive strain Pa21R, suggesting that this clone did not contain a full set of copper-resistance gene(s). Then a cosmid library of pPaCu1 was constructed and six cosmid clones hybridized with pPaCuB14 were selected. One of the six cosmids, designated pPaCuC1, conferred a near wild-type level of copper resistance in the transformant of the copper-sensitive strain. pPaCuC1 had a homologous region that hybridized with all of the PCR-amplifled fragments of copA, copB, copR, and copS genes of P. syringae pv. tomato. DNA sequence analysis of the homologous region revealed the existence of four open reading frames (ORF A, B, R and S) oriented in the same direction. The predicted amino acid sequences of ORF A, B, R and S had 80, 70, 97 and 95% identity with CopA, B, R and S of P. syringae pv. tomato, respectively. Received 5 July 2001/ Accepted in revised form 27 September 2001     

美国出境旅游市场特征及旅华美国市场拓展对策研究

美国是世界出游大国,同时也是我国第一大远程客源国和第四大入境旅游客源国,在我国入境旅游市场中占据着举足轻重的地位。文中运用2001-2010年美国出境旅游市场统计数据,采用季节变动指数、地理集中指数和首位度、位序-规模分布等理论,通过对美国出境旅游市场规模变化、季节分布、全球流向分布及在中国和亚洲其他国家之间分配特征的研究,提出拓展旅华美国市场的对策。研究发现美国出境旅游市场具有以下特征:1)出境旅游市场规模大且持续增长,但是受国内和国际危机事件影响显著;出境旅游旺季在3月、6月、7月和12月,最主要的出境旅游目的地是墨西哥、加拿大和欧洲,亚洲虽非美国人的主要旅游目的地,但其占美国出境市场的份额逐年上升;2)美国人在亚洲旅游的主要目的地包括日本、中国大陆、印度、中国香港、韩国、中国台湾等6个国家和地区;3)中国大陆对美国出境市场的旅游吸引力持续上升,日本对美国市场的垄断地位开始动摇,但仍是中国大陆最大的竞争对手。最后,根据研究结论提出旅华美国市场的拓展对策。     

大叶芥菜对眼子菜化感作用潜力的初步评价

以眼子菜为受体,研究大叶芥菜水浸提液对眼子菜的化感作用。结果显示,浓度分别为0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.085 0、0.062 5、0.050 0、0.033 5、0.008 5 g/m L的大叶芥菜水浸提液对眼子菜种子的萌发抑制效应以0.500 0 g/m L最高,平均抑制率为100.00%;低浓度(0.008 5 g/m L)处理对眼子菜种子萌发的抑制率为13.89%。此外研究发现,大叶芥菜水浸提液对眼子菜叶片数量及鲜质量积累有明显的抑制作用,对鲜质量积累的平均抑制率分别为100.00%、74.68%、65.19%、55.70%、47.79%、46.20%、35.13%和8.23%;对眼子菜种子萌发和鲜质量的化感综合效应(SE)分别为100.00%、74.84%、57.59%、47.29%、43.34%、36.99%、34.23%和11.06%。结果表明,大叶芥菜对眼子菜有很强的化感潜力,能为眼子菜的绿色防控提供理论依据。     

历史时期(着重近4kaB.P.以来)南疆地区气候环境与人地关系演化的初步研究

南疆地区近四千年来气候与环境演化的研究表明 ,本地区气候环境的干旱状况持续未变 ,但期间仍有若干次相对凉湿与暖干旱时期的波动 ,且揭示出 3 .0 ka B.P.、2 .0 ka B.P.、1.5 ka B.P.、1.0 ka B.P.、0 .2 ka B.P.五个气候突变转干时间界线。本研究揭示了近四千年来本地区持续干旱化的特征 ,并有后期加剧的趋势 ,并指出历史时期南疆地区若干人文事件的发生如近两千年以来丝绸之路的兴衰、南疆古城镇的废弃等与气候环境演化之间存在着良好的准对应关系 ,表明气候环境的自然演化是影响人地关系类型与内容的重要因素之一。     

菜豆种子普通细菌性疫病菌检测

 由Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli和Xanthomonas fuscans subsp. fuscans引起的菜豆普通细菌性疫病是严重影响菜豆生产的限制因子之一,可造成严重的产量和品种损失。染菌种子是病原菌传播的主要途径。本研究对5个菜豆主要产区的60份菜豆种子样品进行普通细菌性疫病菌检测。在MT选择性培养基上有36份种子样品浸提液检测到目标病原菌, 种子样品带菌量为2.49×10²~5.20×10⁷ CFU/粒。选择36个分离物接种感病品种“英国红”植株,所有分离物均引起接种植株发病。特异PCR检测结果表明,有20个分离物为X. fuscans subsp. fuscans,16个分离物为X. axonopodis pv. phaseoli。试验结果表明,我国一些菜豆主产区商业种植和研究用种子多数污染普通细菌性疫病菌,建议建立无菌种子生产区和加强种子管理,以有效控制病害发生。     

香蕉枯萎病菌生理分化研究

本研究对香蕉枯萎病菌菌株FOCAAA9（来自香蕉）和FOCABB1（来自粉蕉）进行培养试验和接种试验；在含粉蕉和香蕉组织漫提液的培养基上2个菌株的培养性状、菌丝生长速度、孢子形态、大小型孢子比率和产孢量显示出差异；接种结果FOCAAA9能侵染香蕉（Musa AAA）品种巴西蕉、红香蕉和台蕉引起枯萎病，而FOCABB1对3个香蕉品种无致病性。研究结果表明侵染香蕉和粉蕉的古巴尖镰孢[Fusarium oxysporum f．sp．cubeilse（E．F．Smith）Snyder]存在生理分化现象。     

球型芽孢杆菌2362和苏云金杆菌H-14灭蚊实验

观察球型芽孢杆菌2362和苏云金杆菌H -14杀灭蚊虫幼虫效果。方法 :小型孳生地现场试验。结果 :现场实验结果显示 ,Bs.2362按10mL/m2 施药 ,第3d、7d校正密度下降率分别为84.44%和92.86% ;水沟中按20mL/m2施药 ,第3d、7d校正密度下降率分别为99.68%和100%。Bt.H -14按10mL/m2施药 ,第3d、7d校正密度下降率分别为83.33%和61.55% ;水池中按20mL/m2 施药 ,第3d、7d校正密度下降率均为100%。     

Occurrence of Fusarium oxysporum f. sp. melonis Race 1 in Japan

In 1994, Fusarium wilt of melon cultivars which are resistant to races 0 and 2 of Fusarium oxysporum f. sp. melonis was observed in southern area of the Lake Biwa region, Shiga prefecture. In commercial fields, mature plants of cv. Amus which were grafted onto cv. Enken Daigi 2, and of cv. FR Amus showed yellowing, wilting and finally death before harvesting of fruits. Diseased plants had vascular and root discolorations, and their stem sections yielded typical colonies of F. oxysporum. When the Shiga strains were tested for their pathogenicity to 12 species of cucurbits, they caused wilts only on melon. Using race differential cultivars of melon, the Shiga strains were classified as race 1 of F. oxysporum f. sp. melonis, which has not been reported in Japan. To further characterize their pathogenicity, the strains were used to inoculate 46 additional cultivars of melon, oriental melon and oriental pickling melon. All the race 1 strains were pathogenic to the cultivars tested, and their host range was apparently different from those of strains belonging to other races (races 0, 2 and 1,2y). DNA fingerprinting with a repetitive DNA sequence, FOLR3, differentiated race 1 strains from strains of races 0 and 2, but not from race 1,2y strains. Received 2 July 1999/ Accepted in revised form 30 September 1999     

Isolation of Pathogenicity Mutants of Fusarium oxysporum f. sp. melonis by Insertional Mutagenesis

Restriction enzyme-mediated integration (REMI) mutagenesis was used to isolate mutants of Fusarium oxysporum f. sp. melonis impaired in pathogenicity. The race 2 strain Mel02010 was transformed with linearized pSH75, conferring resistance to hygromycin B, with or without the enzyme used to linearize the plasmid. Addition of restriction enzymes did not affect the transformation frequency. A total of 2929 REMI transformants were tested for pathogenicity to three melon cultivars, Amus, Ogon 9 and Ohi. The race 2 strains are pathogenic to Amus and Ogon 9, but not to Ohi. Of 43 transformants with reduced pathogenicity on susceptible melon cultivars, 12 mutants were examined in detail for pathogenicity, vegetative growth and integrative mode of pSH75. The levels of pathogenicity varied among these mutants. Two mutants (B48 and B137) almost completely lost pathogenicity to both susceptible cultivars, and the others had reduced pathogenicity. Mutants B48, B241, B886 and X36 were also impaired in vegetative growth. Mutant B809 was a biotin auxotroph. By DNA gel blot analysis, nine mutants were found to contain a single copy of the transformation vector. These mutants may thus be useful in isolating genes involved in pathogenicity. Received 22 December 2000/ Accepted in revised form 16 April 2001     

美国农药登记再评价及其启示

作为美国农药再评价工作的长效机制,登记再评审是在风险评估技术和管理政策发生变化的情况下,以确保所有已登记农药持续满足管理要求与登记标准。本文从法律法规、专题、时间表、实施、利益相关方和公众参与、当前工作情况等方面介绍了美国登记再评审。最后,从法律依据、工作程序、风险分析等方面探讨了美国农药登记再评审对我国农药再评价工作的启示。