WRKY转录因子的结构及其在植物抗逆境胁迫中的功能

WRKY转录因子是一超级基因家族,广泛存在于高等植物界,参与了植物的多种生理生化与生长发育过程,在植物应对外界逆境胁迫发挥了十分重要的功能。WRKY超级基因家族由于其N端包括保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名,通过其保守的氨基酸序列与靶标基因启动子区W-box相互结合,从而对靶标基因进行表达调控。本文主要综述了WRKY基因的结构特征及其在植物应答外界逆境胁迫过程中的功能,为进一步研究WRKY超级基因家族提供有益的启示。     

WRKY转录因子及其在植物防御反应中的作用

WRKY蛋白是只存在于植物中较为复杂的转录因子家族。由WRKY蛋白N端高度保守的WRKYGQK氨基酸序列及其特殊的锌指结构而命名的WRKY结构域能专性与其顺式作用元件W-盒[(T)(T)TGAC(C／T)]结合。根据WRKY结构域的数量及锌指结构的特征将WRKY蛋白家族分为3类,其中拟南芥中第三类家族中几乎所有的WRKY成员都与应答生物胁迫有关。WRKY蛋白的表达特性为快速、瞬时、具组织特异性诱导表达。目前,WRKY蛋白被广泛认为参与植物生物与非生物胁迫应答反应、植物衰亡、种皮及毛状体发育及果实发育等一系列的生理活动,本文综述了WRKY转录因子的结构特征及其功能特性,重点讨论了它们在植物防卫反应中的调控作用。     

大豆中3个Dof转录因子的生物信息学及表达分析

植物Dof转录因子在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探明Dof转录因子参与大豆对非生物胁迫的响应,对大豆中3个Dof转录因子(GmDof2.1、GmDof3.1和GmDof4.6)的基因序列进行生物信息学分析。3个Dof基因分别位于不同染色体上,它们所编码的蛋白序列长度为212～305个氨基酸残基,均具有1个保守的Dof结构域。3个Dof蛋白主要定位于细胞核中且含有不同数量的磷酸化位点。启动子序列分析表明,GmDof2.1启动子序列中含有3种与逆境和激素响应相关的元件(ARE、DRE1和MBS),GmDof3.1启动子序列中含有6种与逆境和激素响应相关的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、TGACG-motif、W-box和WUN-motif),GmDof4.6启动子序列中含有7种与逆境和激素响应相关的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、GARE-motif、MBS、TGACG-motif和WUN-motif)。实时荧光定量PCR结果显示,3个Dof基因均可不同程度的响应高盐、干旱、低温和高温胁迫。GmDof2.1和GmDof3.1在大豆根中的表达量最高,GmDof4.6在大豆茎中的表达量最高。由此推测3个Dof转录因子可能在大豆应对非生物胁迫过程中发挥转录调控作用。     

中国红豆杉中WRKY转录因子基因克隆及其对紫杉烷合成的调控

WRKY是一类专一结合W-box序列的转录因子,它对植物抗病、损伤、衰老等生物学过程起到调控作用,尤其是在植物次级代谢物质合成中起到了重要调控作用。本研究采用中国红豆杉细胞转录组数据库序列设计引物,从中国红豆杉基因组中克隆转录因子基因TcWRKY26,该基因大小为2 202 bp;构建pBI121超表达载体,转化农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导转化红豆杉细胞,继而基于RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,发现转录因子基因明显超表达,相对表达量提高了2.92～3.49倍,紫杉烷合成相关酶dbat基因也有明显的超表达,相对表达量提高了1.78～2.03倍,说明TcWRKY26基因对dbat基因有明显的上调作用,继而为构建高产、稳定的红豆杉基因改良细胞株提供参考依据。     

谷子SiWRKY03基因的分子特征与表达分析

WRKY是参与植物生长发育与抗逆反应的一类转录因子。为了解谷子中SiWRKY03基因的功能,利用生物信息学软件分析了其生物学特征,采用Real-time PCR技术检测了SiWRKY03转录因子在谷子不同组织部位和抗谷锈病过程中的表达丰度变化。结果表明,SiWRKY03基因的开放阅读框全长为1 137 bp,编码378个氨基酸,预测分子质量为39.73 ku,理论等电点(pI)为5.91,含有1个WRKY保守结构域。该蛋白质二级结构的最大元件是无规则卷曲,最小元件为β-转角。进化分析表明,SiWRKY03与糜子(RLM93064.1)和哈氏黍(PAN29607.1)的氨基酸序列同源性最高,为99%。组织表达分析表明,该基因在谷子根、茎、叶和穗中均有表达,其中根中表达量最高,穗中表达量最低,与转录组数据一致。在谷子响应锈菌胁迫反应的120 h内,SiWRKY03基因在抗病反应的12,36 h上调表达,而感病反应过程中无显著性变化,推测SiWRKY03在谷子抗锈病反应中起正调控作用。上述试验结果为进一步研究SiWRKY03基因功能与抗病机制奠定理论基础。     

玉米ZmWRKY53基因克隆及诱导表达分析

WRKY是植物细胞中进化较为保守的一类转录因子,参与了生物和非生物逆境胁迫应答反应的调控。本研究基于干旱诱导的玉米(Zea mays L.)B73转录组数据库,成功克隆到1个WRKY基因,命名为Zm WRKY53。序列比对发现,该基因含有904 bp的完整开放读码框,编码302个氨基酸,在C端含有1个保守的WRKYGQK结构域,同源比对ZmWRKY53属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测,Zm WRKY53为碱性不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域。洋葱内表皮亚细胞定位显示,Zm WRKY53蛋白位于细胞核中。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,Zm WRKY53基因在玉米的根和叶中有较高的表达水平,而在茎、玉米须、雄穗和胚中的表达量较低。不同的非生物胁迫如低温(8℃)、NaCl、H2O2和PEG均能显著提高Zm WRKY53的表达水平,尤其是PEG诱导使其表达水平上调9.5倍。接种玉米纹枯病的叶片中,Zm WRKY53的表达量提高了13倍。对比不同的激素处理情况,脱落酸(abscisic acid,ABA)和水杨酸(salicylic acid,SA)处理后,Zm WRKY53的表达水平持续上调;而在赤霉素(gibberellin,GA)和乙烯处理的玉米根中,Zm WRKY53呈现无规律的变化特征。蛋白互作预测,十个候选基因可作为后续Zm WRKY53调节机制的靶目标研究。上述实验表明,Zm WRKY53基因通过对不同激素信号的调节,不仅参与玉米对纹枯病的抗性反应,还参与对非生物胁迫信号的转导。     

大豆中一个WRKY28-like基因的克隆与功能分析

WRKY转录因子参与调节植物生长发育、生物与非生物胁迫应答等多种过程,AtWRKY28是拟南芥中与抗病和耐逆相关的重要转录因子。为探讨大豆中一个AtWRKY28同源基因GmWRKY28-like(Glyma.14G028900)的生物学功能,本文对该基因进行了克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、组织表达等试验,并对其在ABA、PEG、NaCl胁迫下的表达水平进行了分析。结果显示,GmWRKY28-like基因的编码区(CDS)为1008bp,编码335个氨基酸。GmWRKY28-like蛋白具有保守的WRKY结构域,含有22个丝氨酸(Serine)、1个苏氨酸(Threonine)、2个酪氨酸(Tyrosine),不含跨膜结构与信号肽;进化树分析表明大豆GmWRKY28-like与菜豆(Phaseolus vulgaris)WRKY28的相似性最高;亚细胞定位显示GmWRKY28-like定位在细胞核中。该基因在根、种子中表达量很低,在真叶、花、及茎尖分生组织表达量较高。GmWRKY28-like启动子中含有多种与生物和非生物逆境胁迫应答相关的元件,如MBS、W-box、ABRE、Box-W1等,且表达受到ABA、PEG、NaCl的诱导。此外,过表达GmWRKY28-like显著增强了拟南芥的耐盐性。     

SUSIRI基因的生物信息学分析及亚细胞定位

转录因子是植物生长发育及其对外界环境的应答反应中起重要作用的蛋白调控因子,一般含有DNA结构域、转录调控域、寡聚化位点和核定位信号。WRKY蛋白是一类具有重要作用的转录调控因子。在水稻的基因组中预测到的WRKY基因多达103个,对这些基因的功能加以注释具有重要的意义。SUSIRI基因是前人从粳稻日本晴中克隆的一个WRKY家族的转录因子。其开放阅读框长度为1755 bp,可编码584个氨基酸,具有典型的双WRKY结构域。为了进一步研究SSUSIRI基因,阐明它在水稻中的生物调控功能。通过应用生物信息学的方法,对该基因的预测蛋白进行了结构与功能的分析。利用EBI的interpro数据库分析SUSIRI基因序列的基序(motif),并结合NCBI的CDD(conserved domains)数据库分析该蛋白的保守结构域,用DNAMAN软件和CBS的TMHMM软件分析蛋白氨基酸残基的亲（疏）水性特点和跨膜结构域,用CBS的Protcomp version9.0软件和Protfun软件分别分析了蛋白的亚细胞定位和功能预测;通过实验设计把SUSIRI基因与GFP基因相融合,构建了由actin启动子驱动的SUSIRI基因的荧光表达载体pNSUGFP。通过采用基因枪法把该载体转入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位鉴定。结果表明,生物信息学预测值显示：SUSIRI基因具有转录、转录调控、信号转导类功能的可能性最高,预测值分别为0.973、1.598和0.602;同时,其参与翻译功能、中间代谢功能和脂肪酸代谢功能的可能性也较大,预测值分别为4.800、1.490和1.265;由于SUSIRI蛋白中含有的亲水性氨基酸残基较多,该蛋白不具有跨膜性,是一种非跨膜类蛋白。对其亚细胞定位预测表明：在其氨基酸序列中含有较强的核定位信号,所以定位于细胞核内的可能性很大。进一步用荧光显微镜对基因枪轰击的洋葱表皮细胞的观察发现：对照的GFP蛋白主要沿细胞壁表达,而SUSIRI-GFP融合蛋白在细胞核中有很强的表达。通过试验研究得出：SUSIRI基因可能是一个参与中间代谢调控功能的基因,主要在基因转录环节发挥作用,是一种核定位蛋白。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析

WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。利用cDNA宏阵列(macroarray)和RT-PCR相结合的方法,从小麦全长cDNA文库的WRKY转录因子中筛选出一个应答小麦白粉病菌胁迫的TaWRKY34转录因子,该基因编码464个氨基酸。染色体定位分析表明,该转录因子位于小麦第一同源群染色体的短臂上,并且只在细胞核中表达。其蛋白序列与拟南芥、大麦和葡萄抗病相关WRKY转录因子的亲缘关系较近,与其中的3个WRKY基因具有相似的表达模式。TaWRKY34在Pm16/北京8377抗白粉病近等基因系中,对小麦白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导的表达模式存在差异。TaWRKY34可能与小麦对白粉菌的抗性有关。     

转录因子与植物抗逆性研究进展

近年来,转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中的应用越来越广泛。本文综述了与植物逆境抗性相关的5个转录因子家族: MYB类、bZIP类、WRKY类、AP2/EREBP类和NAC类的调控机制以及它们在植物抗逆基因工程的研究进展。     

谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应

谷子白发病是谷子生产上的重要病害,可严重影响谷子的产量和品质。WRKY转录因子广泛参与植物的抗病,生长发育等多种生理过程。为了探究谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应,进而发掘谷子特有的抗病基因并为以后的抗病研究提供参考,本研究以感病品种‘晋谷21’为试材,基于前期对转录组测序的基础上,筛选出8个与谷子白发病相关的WRKY转录因子基因,然后通过生物信息学技术,对这8个WRKY转录因子基因特征,基因序列及所在染色体位置,基因组结构模式启动子序列元件,与白发病菌相关的调控元件以及表达模式等进行了分析。研究发现,8个WRKY转录因子基因中5个基因分布在5号染色体上,在受白发病菌胁迫后其表达水平存在显著差异。启动子顺式元件分析的组成和分布也存在较大差异,8个基因的蛋白大小是202~440个氨基酸,系统进化树分析表明,基因Seita.8G123100,Seita.5G261700的亲缘关系较近,并且受侵染后的表达水平均高于正常水平。发现8个基因中5个基因在受到病原菌侵染时其表达水平高于其正常状态下的基因表达水平,可以作为谷子抗病的重要候选基因。本研究结果为后续筛选谷子抗病基因及谷子抗病机制的研究奠定了一定的理论基础。     

转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的研究进展

转录因子是一类调节基因表达的重要调控蛋白,转录因子和与其结合的启动子中的相关顺式作用元件,在基因表达方面起着分子开关的作用,因此探究转录因子与启动子的相互作用尤为重要。为了研究在植物遭受逆境胁迫时,转录因子对下游靶基因的调控机制,本文综述了参与逆境胁迫的主要转录因子家族、转录因子的转录激活活性鉴定、转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的应用,为全面、深入研究植物应答逆境胁迫时的基因表达调控机制提供参考。     

热激转录因子在植物胁迫应答和生长发育中的作用

由于其固有的生长方式,植物常常会面临诸如干旱、盐碱、极端温度和病虫害等不利因素的影响,因此,植物在漫长的进化过程中发展出一套精巧的调控机制来应对自然界中的各种环境和生物胁迫,并维持其正常的生长发育。植物基因表达的分子调控网络十分复杂,包括转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平等多个层次。转录因子介导的转录水平上的调控对于基因表达调控发挥着至关重要的作用,转录因子与靶基因启动子区的顺式元件相互作用来调控下游基因的表达。热激转录因子(heat shock factor,HSF)是真核生物中广泛存在的一类转录因子,通过识别热激元件(heat shock element,HSE)调控基因表达,从而参与植物的各种生命活动。植物HSF数量众多、功能多样、调控机制复杂精巧,不仅能够影响植物对高温、干旱、重金属等胁迫的抗性以及植物的抗病性,还参与了对植物配子形成和根发育等过程的调控。本综述归纳了植物中HSF的基本结构和分类、HSF受到的调控,重点介绍了HSF在应答各种胁迫条件和调控植物生长发育中的研究进展,并对植物HSF研究中有待进一步阐明的问题进行了探讨和展望,以期为植物的抗逆性改良和分子育种中潜在候选基因的选择提供参考依据。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

SPL调控因子在植物生长调控的研究进展

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的转录因子,它参与了植物叶、花、果实的发育、发育阶段转变、花青素的合成以及胁迫应答等调控过程。SPL转录因子家族成员均含有高度保守的SBP结构域,可以特异性结合所调控基因启动子的顺式作用元件,还可与其它调控蛋白相互作用,共同调控相关基因的表达。另外,SPL在转录后水平还受miRNA156/miRNA157的负调控。本研究从SPL调控因子在植物形态建成、次生代谢、生理胁迫中的表达调控研究进展方面进行综述。     

陆地棉三个WRKY基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生长发育以及对外界环境的反应中起着重要的调控作用,目前对棉花WRKY家族基因的研究比较少。本研究利用电子克隆的方法,从陆地棉品种山农圣杂3号中克隆得到了3个具有完整开放阅读框的棉花WRKY基因,聚类分析表明它们同属于WRKY家族中的第Ⅱ类。利用RT-PCR结果表明:250mmol/LNaCl盐胁迫和20%PEG6000干旱胁迫下同时诱导GhWRKY4的基因表达,GhWRKY5仅受干旱胁迫下的诱导,而GhWRKY6对这两种逆境胁迫都没有变化。     

转录因子基因TaWRKY72b-1的克隆，表达及在烟草中表达对植株磷效率的影响

在富集低磷胁迫特异表达基因的小麦根系cDNA差减杂交文库中，鉴定了1个与拟南芥WRKY75同源的小麦WRKY型转录因子基因表达序列标签(EST)。依据该EST序列高度同源的小麦WRKY72b序列，克隆了对应基因TaWRKY72b-1。TaWRKY72b-1与WRKY72b在cDNA序列上有2个碱基的差异，但编码氨基酸没有改变。TaWRKY72b-1开放阅读框为621 bp，编码206个氨基酸残基，氨基酸组成上含有保守的WRKY基序和C2H2基序。系统进化分析表明，TaWRKY72b-1与小麦WRKY72a和大麦WRKY12可能来自相同的祖先。与对照供磷水平(2 mmol L^-1 P)相比，低磷处理使根叶中TaWRKY72b-1的转录本数量均明显增多。表明TaWRKY72b-1对低磷胁迫逆境产生了明显的应答作用。TaWRKY72b-1在烟草中表达表明，低磷胁迫条件下，高表达TaWRKY72b-1的烟草植株干重、单株磷累积量和磷利用效率均较对照明显增加。因此，TaWRKY72b-1基因在改善低磷胁迫下作物的磷效率中可能具有较重要的应用价值。