H5N1 亚型禽流感病毒在 MDCK 细胞中增殖条件的研究

目的：探索H5N1亚型禽流感病毒在MDCK中增殖规律,确定最佳增殖条件。方法将H5N1亚型禽流感病毒接种到6孔板培养的MDCK细胞进行增殖试验,检测不同病毒感染量、不同浓度TPCK-胰酶,接毒后不同时间病毒的HA滴度。根据确定的最佳增殖条件将病毒接种到微载体培养的MDCK细胞中进行大规模增殖。结果：最佳病毒增殖条件接毒量MOI为5＆#215;10-4、TPCK-胰酶浓度为4μg/mL,在5 L生物反应器中重复验证,获得稳定的试验结果,病毒血凝价最高为8 log2。结论：本研究为禽流感疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

利用RT-PCR技术扩增古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011株的8个目的基因片段,分别克隆至双向转录表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,48 h后收集上清,接种MDCK细胞。当细胞出现明显病变时,收集MDCK细胞上清,其血凝效价为1:64,与原始野生株血凝效价一致;提取拯救病毒的RNA并进行8个目的片段扩增及序列分析,测序结果显示与野生株病毒相同,表明病毒拯救成功。古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立,不仅为探索流感病毒致病机理、感染机制及功能研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研制开辟了新的途径。     

盐酸阿比朵尔体外抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的作用

<正>目的检测盐酸阿比朵尔体外对2009新型流感病毒A(H1N1)复制的影响。方法采用2009新型流感病毒A(H1N1)感染MDCK细胞系统,检测盐酸阿比朵尔抗流感病毒的活性。血凝实验、细胞病变保护实验、RT-PCR和定量RT-PCR实验用于病毒滴度确定。使用Chou软     

一种共表达不同亚型禽流感病毒基因且形成病毒样颗粒的真核表达载体的构建与鉴定

动物流感DNA疫苗是非常有应用前景的新型疫苗之一,本研究构建了能同时表达禽流感病毒2种血凝素H5HA和H9HA以及1种神经氨酸酶N1NA的真核表达质粒。间接免疫荧光结果表明,构建的真核表达质粒转染MDCK细胞后,同时表达出H5HA、H9HA和N1NA蛋白;转染293T细胞上清通过血凝试验可检测到2~4血凝价;通过透射电镜观察到了病毒样颗粒。本研究用一种质粒同时表达不同亚型流感病毒蛋白并且形成了病毒样颗粒,为流感病毒多价DNA疫苗研究提供了坚实基础。     

清毒片体外抗H1N1亚型流感病毒的研究

以MDCK细胞为H1N1亚型流感病毒宿主,金刚烷胺为阳性对照药物,通过细胞病变效应(CPE)和噻唑蓝比色法(MTT)测定清毒片对病毒的3种不同作用方式,即先感染病毒后给药,先给药后感染病毒和药物病毒同时作用,每种方式3个重复,观察清毒片对H1N1亚型流感病毒的抑制作用。结果表明,中药清毒片具有不同形式的抗H1N1亚型流感病毒作用,抑制病毒在细胞内合成作用,阻止病毒吸附传入细胞作用和直接灭活病毒作用。清毒片抑制H1N1亚型流感病毒在细胞内合成作用的3个重复的半数有效浓度(EC50)分别为411、434、532μg/mL,治疗指数(TI)为3.5;清毒片阻止H1N1亚型流感病毒的吸附、传入细胞的3个重复的EC50分别为404、458、467μg/mL,TI为3.6;清毒片对H1N1亚型流感病毒直接灭活作用的3个重复的EC50分别为479、481、461μg/mL,TI为3.4。说明清毒片体外对H1N1亚型流感病毒株具有明显的抑制作用,为H1N1亚型流感病毒感染的治疗和临床用药提供了理论依据。     

重组H5N3禽流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研究

为研究通过反义遗传学技术构建的重组禽流感病毒rH5N3疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖规律，确定最佳增殖条件，将rH5N3疫苗株分别在500mL和10L转瓶培养的MDCK细胞中进行增殖试验，检测不同接毒量以及接毒后不同时间里的血凝价，以确定病毒的增殖情况。结果表明，在确定的最佳病毒增殖条件下，该重组rH5N3疫苗株在500mL转瓶和10L转瓶中可获得大量增殖，病毒的最高血凝价均可达到1：1024。rH5N3疫苗株可以在MDCK细胞中大规模增殖，操作方法简便，成本低廉，该方法为禽流感细胞培养型疫苗的大规模生产奠定了基础。     

三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

利用RT-PCR技术扩增三源重组H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Tianjin/10/2013(H1N1)的8个基因片段,分别克隆至双向转录/表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,收取转染48 h后的细胞上清并接种MDCK细胞,成功拯救出有血凝活性的病毒。全基因序列测定结果表明,拯救病毒与野生病毒的核苷酸序列完全一致。生长曲线的测定结果表明,不同时间点野生毒株与拯救毒株在MDCK细胞上的病毒滴度没有明显差异。三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立为进一步开展猪流感病毒的生物学特性研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。     

MDCK细胞悬浮驯化及对H9亚型禽流感病毒敏感性的研究

为获得对H9亚型禽流感病毒敏感的纯悬浮MDCK细胞株,通过逐渐降低血清的方法对贴壁依赖的MDCK细胞进行了无血清纯悬浮驯化,最终获得了一株对H9亚型禽流感病毒敏感的纯悬浮细胞株MDCK-sus。通过测定表明,该细胞株能够迅速增殖,倍增时间为24h,使用H9亚型禽流感病毒BX13株感染该细胞,培养72h,培养液的病毒HA价可达到1∶512,每0.1mL病毒含量达到108.5EID50,为利用生物反应器大规模悬浮培养制备H9亚型禽流感病毒抗原奠定了基础。     

整合H1亚型流感病毒血凝素蛋白伪型病毒的构建

为构建包装含有H1亚型流感病毒HA蛋白的伪型病毒,本研究将人工合成的H1N1流感病毒(A/Califorma/04/2009株)血凝素(Hemagglutinin,HA)基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装含有HA蛋白的伪型病毒.通过对伪病毒感染细胞中LacZ报告基因表达产物的检测,证明伪病毒可以感染MDCK细胞;同时其感染过程可被流感病毒免疫后的小鼠阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程.本研究所构建的伪病毒系统为研究H1亚型流感病毒HA蛋白抗原特性及新型中和抗体检测方法的建立提供了理想的工具.     

H5N1禽流感病毒微磁粒捕捉系统和SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用禽流感H1N1抗体包被微磁珠制备免疫磁珠,再通过抗原抗体反应得到了含有N1亚型的病毒,然后设计针对H5亚型的特异性引物,同时构建含有H5亚型HA基因部分序列的标准质粒,定量后作为模板,建立了可以检测H5亚型禽流感病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果表明,制备的免疫磁珠可以吸附4个血凝单位的H5N1流感病毒和5个血凝单位的H1N1流感病毒,而对H9N2亚型流感病毒无特异性结合,从而可以富集N1亚型的流感病毒.H5亚型RRT-PCR检测灵敏度可达到4.6拷贝/μL,线性范围达5个数量级;特异性强,与NDV和H1、H9亚型禽流感病毒不发生交叉反应.因此,利用该方法可以很好地检测H5N1禽流感病毒.     

山羊瘤胃中单宁降解菌的分离、筛选和鉴定

本试验旨在从山羊瘤胃中分离、筛选和鉴定单宁降解菌。从隆林山羊瘤胃采集内容物,采用单宁浓度耐受培养基进行初筛,再采用单宁酶活力鉴定培养基分离、筛选单宁降解菌,筛选出的细菌通过16S r DNA基因序列测定初步鉴定,将菌株在单宁浓度为0.5%、1%、1.5%的单宁酶诱导培养基中培养,测定酶活力。结果表明:共分离、筛选到4株降解单宁的细菌,根据16S r DNA基因序列分析结果,分别为产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、克斯特菌(Kerstersia)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。经单宁酶诱导培养基培养后,Kerstersia的胞内单宁酶活力高于其他3株菌,而其他3株菌的酶活力较为接近;Kerstersia、Providencia vermicola和Pseudomonas aeruginosa经1%单宁浓度诱导的单宁酶活力均高于经0.5%和1.5%单宁浓度诱导(P0.05)。本试验成功从山羊瘤胃中筛选、分离、鉴定出4株单宁降解菌,且它们均表现出较高的单宁酶活力。     

中国草地自然灾害及其防治对策

介绍了中国草地的五大自然灾害,提出了综合防治的五项对策。     

An equine herpesvirus 1 (EHV-1) vectored H1 vaccine protects against challenge with swine-origin influenza virus H1N1

In 2009, a novel swine-origin H1N1 influenza A virus (S-OIV), antigenically and genetically divergent from seasonal H1N1, caused a flu pandemic in humans. Development of an effective vaccine to limit transmission of S-OIV in animal reservoir hosts and from reservoir hosts to humans and animals is necessary. In the present study, we constructed and evaluated a vectored vaccine expressing the H1 hemagglutinin of a recent S-OIV isolate using equine herpesvirus 1 (EHV-1) as the delivery vehicle. Expression of the recombinant protein was demonstrated by immunofluorescence and western blotting and the in vitro growth properties of the modified live vector were found to be comparable to those of the parental virus. The EHV-1-H1 vaccine induced an influenza virus-specific antibody response when inoculated into mice by both the intranasal and subcutaneous routes. Upon challenge infection, protection of vaccinated mice could be demonstrated by reduction of clinical signs and faster virus clearance. Our study shows that an EHV-1-based influenza H1N1 vaccine may be a promising alternative for protection against S-OIV infection.     

A/H1N1研究进展

2009年3以来,包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了甲型H1N1流感[Swine-origin Influenza A (A/H1N1)]疫情,WHO已于2009年6月20日将此次流感流行的预警级别提升至6级.现已基本明确,引起此次流感疫情的A/H1N1流感病毒是猪流感病毒(Swine Influenza Virus, SIV)的一种新型变异株.此次流感疫情的发生,再次使猪流感成为社会各界关注的焦点之一.本文就甲型H1N1流感的临床表现、病毒特征、相互关系及其对动物卫生监督工作的影响等作一综述.     

鸽禽I型副粘病毒油佐剂灭活苗对肉种鸽免疫效果观察

用鸽Ａ／ＰＭＶ－１ＳＸ株（简称ＳＸ株）制成的油佐剂灭活苗与ＮＤＶ油佐剂灭活苗分别免疫肉种鸽,免疫后２０天抗体水平达到峰值,抗体水平在３ｌｏｇ２以上维持３０天以上。免疫后４０天用鸽ＳＸ株和新城疫强毒对两种疫苗免疫鸽分别进行攻击,两种疫苗免疫组对ＮＤＶ强毒攻击的保护率均为１００％,鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗免疫组对鸽ＳＸ株攻击的保护率为１００％,而ＮＤＶ油佐剂灭活苗免疫组对鸽ＳＸ株攻击的保护率仅为６６７％。鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗田间试验抽检４８份肉种鸽血清,抗体平均值为４３０±１１６ｌｏｇ２。