红肉蜜柚 PDR 型转运蛋白基因的发掘及 CmPDR11-2 表达与耐草甘膦初步分析

基于红肉蜜柚 RNA-seq 数据库,筛选出 50 个 ABC 转运蛋白家族基因,其中包含 11 条 PDR 型基因。对11 条柚 PDR 基因进行命名和生物信息学分析。同源性分析结果表明：CmPDR11-2 编码的氨基酸序列与拟南芥中转运百草枯除草剂的 AtPDR11 基因同源性最高,达 69.25%,利用 RT-PCR 技术克隆得到 CmPDR11-2 的 ORF 序列。该序列长度为 4 371 bp,编码一个含有 1 456 个氨基酸的蛋白质,分子量 165.138 03 ku,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有 12 个跨膜结构,定位于细胞膜。实时荧光定量 PCR 结果表明,草甘膦除草剂胁迫处理条件下,1~15 d 处理组柚叶的 CmPDR11-2 基因相对表达量呈整体上升趋势,且均高于对照组,反应迅速且持久,这表明 CmPDR11-2 基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。     

荔枝快速碱化因子基因的克隆与表达分析

从已构建的荔枝果皮cDNA文库中挑取克隆测序,获得一条荔枝快速碱化因子(LcRALF)基因(GenBank登录号:EU024484).该基因的cDNA全长为666 bp,含1个381 bp的开放读码结构,编码126个氨基酸.生物信息学分析表明,该基因的氨基酸序列与拟南芥、烟草等物种的RALF基因一致性较高,具有RALF基因氨基酸序列的典型特征.RT-PCR分析表明,该基因在荔枝果皮中特异表达,且在新采收的荔枝果皮中表达量最高.随着果皮的衰老该基因表达量逐渐下降.     

木薯蔗糖合酶(SuSy)基因的表达分析及SuSy1和SuSy4编码序列的克隆

依据拟南芥6个蔗糖合酶基因序列搜索木薯基因组数据库,获得了6个木薯蔗糖合酶基因亚型。将6个木薯蔗糖合酶基因亚型的外显子-内含子结构进行分析,结合其它物种蔗糖合酶基因的氨基酸序列构建进化树,将木薯蔗糖合酶基因可分为三类,分别为Su Sy1/Su Sy4,Su Sy2/Su Sy3和Su Sy5/Su Sy6。以木薯KU50的功能叶和5个不同时期块根的RNA为模板,利用RT-PCR的方法对蔗糖合酶基因家族进行表达分析,确定了Su Sy1和Su Sy4高表达的亚型,克隆并获得了Su Sy1和Su Sy4基因的编码区序列,对获得的序列进行同源性和功能结构域分析表明,2条序列的氨基酸同源性为97%,并且有相同的功能结构域。     

无核荔枝凝集素基因的克隆与表达分析

应用PCR技术克隆了无核荔枝凝集素(LcLec)基因的部分cDNA(JF920723)和gDNA(JF920724)序列,序列分析表明,获得的cDNA序列含有一个468 bp的完整开放读码框结构,编码含155个氨基酸残基的多肽序列,该氨基酸残基序列与木菠萝家族的甘露糖结合凝集素同源。获得的gDNA序列含有3个内含子,长度分别为124、108和119 bp。荧光定量PCR结果表明,LcLec基因的表达量在无核荔枝果皮发育前期上升,之后下降至稳定水平;在采后果皮衰老阶段,随果皮褐变指数上升LcLec基因表达量上升。     

甘蓝型油菜裂角相关基因BnRPL的克隆与分析

为鉴定甘蓝型油菜裂角相关基因，基于候选基因途径，利用同源克隆结合RACE方法，在甘蓝型油菜易裂角品系R2中扩增出了两个RPL基因的全长cDNA序列，其中一条序列长度为2 068bp，开放阅读框序列位置为154-1 911位，总长为1 758bp，命名为BnRPL.a。另一条序列全长为2 041bp，开放阅读框序列位置为154-1 887位，总长为1 734bp，命名为BnRPL.c。分析表明利用PCR方法得到的BnRPL基因由3个内含子和4个外显子组成，与拟南芥RPL基因结构相似。氨基酸序列同源性分析表明，BnRPL与拟南芥AtRPL和荒野独行菜（Lepidium campestre）的RPL具有较高的同源性。系统发育进化树显示RPL蛋白在双子叶植物和单子叶植物的分化过程中发生了序列变异。BnRPL基因存在时空表达的组织特异性，在发育的角果表达量最大；成熟后期在角果皮和假隔膜中表达，在种子中不表达。       

甘薯NAC转录因子家族的全基因组鉴定与分析

利用生物信息学方法对甘薯(Ipomoeabatatas)基因组中NAC转录因子进行鉴定、保守结构域分析、motif查找、染色体定位、系统进化树分析以及逆境胁迫下基因表达分析。结果表明:甘薯全基因组序列中含有91个NAC转录因子基因,非均匀分布于甘薯15条染色体上;系统进化树及motif分析结果显示,91个甘薯NAC家族成员可分为16个亚组,共包含20个motif,其中大部分家族成员中均含有motif2、motif4、motif1、motif8和motif3,这5个motif分别对应NAC结构域中的5个子域A、B、C、D和E。在与拟南芥(Arabidopsis thaliana)NAC转录因子共同构建的进化树中,有64个甘薯NAC家族成员被归入拟南芥NAC基因家族的14个亚组,其中,NAC2亚组包含的成员数最多,有9个,TIP和AtNAC3亚组均仅有1个。转录组数据分析结果显示,在蔓割病菌(Fusarium oxysporum f. sp. batatas, Fob)胁迫下甘薯NAC基因家族中有10个基因的表达量发生变化;而在低温环境下有25个NAC基因差异表达。本研究结合利用基因组与转录组数据分析,该结果为进一步研究甘薯NAC基因家族的功能提供参考。     

茶树转录因子基因CsDREB-A4的克隆与温度胁迫响应的分析

基于本实验室茶树品种迎霜的转录组数据,通过PCR方法从迎霜的DNA中克隆得到CsDREB-A4基因。分析显示,该基因含开放阅读框长708βbp,编码235个氨基酸,含有AP2/ERF家族转录因子典型的保守AP2结合域,并且与大豆、番茄、葡萄、拟南芥等的DREB转录因子有高度同源性。从进化树、亲/疏水性、无序化特性、二级和三级结构等方面进行预测与分析,结果表明,该转录因子属于AP2/ERF家族中的DREB亚族的A4组,大多数氨基酸属亲水性氨基酸,无序化特征比较明显,三级结构与AtERF1相似。利用实时荧光定量PCR分析表明,在迎霜、安吉白茶、云南十里香3个茶树品种中CsDREB-A4基因均受高温、低温诱导表达。在4℃处理下,在上述3个茶树品种中CsDREB-A4基因表达量均在24βh时达到最大值,分别为对照的23、4、43倍,并且CsDREB-A4基因在迎霜和云南十里香中均比安吉白茶的基因表达上调时间更长,上调程度更大。在38℃处理下,CsDREB-A4基因在迎霜和云南十里香中表达受抑制,均只在8βh时表达量高于对照,而在安吉白茶中表达量显著增加,在12βh时高达对照的2β720倍。     

芒果中性/碱性转化酶MiNI基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术克隆了1个编码NI基因的cDNA序列,命名为MiNI基因,并对不同来源的中性/碱性转化酶的分子特征及系统进化进行比较分析。结果表明：MiNI基因开放阅读框为2034 bp,编码677个氨基酸,相对分子量为76.6 kDa,理论等电点为6.24;生物信息学分析结果显示,NI二级结构α螺旋占38.85%,无规则卷曲占35.45%,伸展链占18.91%,β折叠占6.79%;MiNI具有glycoside hydrolase family 100结构保守域,与克里曼丁桔、龙眼、巴西橡胶树和番木瓜都具有一致的motif位点;MiNI基因编码的氨基酸序列与克里曼丁桔、龙眼氨基酸序列同源性最高;构建NI系统进化树分析表明,与芒果遗传距离最近的是克里曼丁桔,最远的是玉米和枸杞。qRT-PCR分析显示,果皮MiNI基因表达量远高于果肉;花后10~40 d,果皮MiNI基因表达量显著下降;花后40~100 d,果皮MiNI基因表达量维持在一个相对稳定水平;花后100~130 d,随着果实成熟,果皮MiNI基因表达量又显著上升;而花后10~40 d,果肉MiNI基因表达量显著下降,至果实发育后期果肉MiNI基因表达量始终处于极低水平。该研究为进一步了解MiNI基因在芒果果实蔗糖代谢过程中的作用以及从分子角度阐明芒果糖代谢机理奠定理论和技术基础。     

大豆转录因子GmWRKY4分子克隆与表达分析

为研究WRKY家族基因在大豆抵御非生物胁迫中的生物学功能及其作用机制,利用铁丰29,获得了大豆WRKY家族基因GmWRKY4的开放阅读框序列,并对其在不同非生物胁迫处理下的表达模式进行了分析。结果表明,GmWRKY4开放阅读框为1 083 bp、编码360个氨基酸残基;对其编码蛋白GmWRKY4进行保守域及同源性分析发现,属于WRKY转录因子家族第1类,与GsWRKY4高度同源;分析GmWRKY4与拟南芥WRKY转录因子系统进化树发现,与At WRKY3、At WRKY4相似性最高;进一步分析该基因在盐(NaCl处理)、干旱(PEG处理)与低温胁迫处理下的表达模式发现,GmWRKY4可参与对上述3种非生物胁迫的响应;同时分析基因在乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)等激素处理下的表达模式发现,GmWRKY4可通过参与ACC、SA、JA信号通路实现对逆境胁迫的响应,为进一步深入研究该基因生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

巴西橡胶树HbMET的克隆与表达分析

通过同源克隆和RACE方法获得了巴西橡胶树DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,MET)基因(Hb MET)。Hb MET长4 896 bp,含有4 635 bp的阅读框架,编码1 545个氨基酸。蛋白分子量174.36 ku,等电点为6.36。氨基酸序列与可可、毛果杨、黄瓜、拟南芥、碧桃、葡萄和烟草等物种的MET家族成员的同源性分别为73%、77%、74%、56%、72%和68%。进化树分析表明,Hb MET氨基酸序列与毛果杨的MET亲缘关系最近。Hb MET在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低;Hb MET在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。     

荔枝果实套袋技术研究进展

针对荔枝(Litchi chinensis Sonn.)生产过程中,常出现的座果率低、成熟期落果裂果严重、果皮着色不均匀严重影响果实品质等现象和多种病虫害危害,果农在荔枝果实生长期频频喷药保果,这样既增加生产成本,又不符合绿色果品的要求的问题。以华南农业大学为主的科研机构开展了荔枝果实套袋及其配套技术的研究,探索出一套切实可行的荔枝果实套袋技术,并加以示范与应用推广。本文对目前荔枝果实套袋技术的相关研究进展进行了总结分析,并提出以后的发展方向。     

农杆菌注射法瞬时转化荔枝果实组织的研究

为了寻找一种高效的荔枝果实瞬时基因表达方法,本研究以荔枝品种‘新球蜜荔’（Litchi chinensis Sonn. var. ‘Xinqiumili’）为试材,利用农杆菌注射法对荔枝果实组织进行转化,研究了果实发育时期、菌株种类、注射部位、取样时间、菌液浓度等对转化效率的影响。结果表明：选择果肉已完全包裹种子的Ⅱb期果实进行连体注射,在果柄、果皮、种子、果肉分别注入OD₆₀₀值为2.4的农杆菌菌株GV3101,4 d后取样进行检测,4个组织的GUS染色率较高。本研究成功建立了适用于荔枝果实的基因瞬时表达系统,为今后快速鉴定荔枝果实相关基因功能提供了基础。     

香蕉乙烯受体基因cDNA的克隆及其表达分析

提取香蕉果实总RNA，根据有关文献报道的乙烯受体基因序列设计引物，通过RT-PCR方法扩增其开放读框(open reading frame，ORF)，结果同时扩增出2个长短不同的特异cDNA序列。测序结果表明：其中较长的cDNA序列与该报道的香蕉乙烯受体cDNA序列的对应区段(ORF)长度一致，同源性为99．1％；另一较短cDNA序列为新序列，其与该报道序列的同源性达97．2％，但缺少该报道序列中的19和1036 bp的区段。RT-PCR扩增结果显示，报道的cDNA序列在香蕉果实的几个成熟阶段均有表达，而在根和叶片等组织中检测不到其表达，说明其表达具有果实组织特异性。Southern杂交结果显示，该报道基因序列在香蕉基因组中为单拷贝存在。因此，推测新克隆的缺失cDNA序列可能来自同一基因的转录后剪辑，其可能为1个新的香蕉乙烯受体基因。     

能量供应对‘南岛无核’荔枝果实采后能量代谢及衰老的影响

以‘南岛无核’荔枝果实为材料,研究促进和抑制能量水平条件下,荔枝果实采后贮藏过程中呼吸、失水、果皮细胞膜损伤、能量产生及其关键酶活性与衰老的关系。结果表明:2,4-二硝基苯酚（DNP）解偶联剂抑制了能量供应,可促进荔枝果皮失水,加速果皮细胞膜损伤,能荷下降快,明显促进了荔枝果实衰老。而外源ATP处理降低了果皮失水和细胞膜损伤,果实贮藏期间保持了相对较高的能荷,延缓了荔枝果实采后衰老。DNP的解偶联作用使线粒体制造ATP受阻,直接诱导了贮藏前期细胞色素C氧化酶（COX）、H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性增强,贮藏后期这些ATP关键酶活性下降,对延缓果实衰老不利。而外源ATP处理,果实贮藏前期COX活性较低,贮藏后期COX、H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性增强,均对延缓荔枝果实衰老具有积极作用。总之,荔枝采后贮藏后期energy charge（EC）下降、ATP供应不足是导致荔枝果实衰老的重要因素,适当提高贮藏后期果实电子传递与氧化磷酸化过程中COX、H+-ATPase和Ca2+-ATPase等ATP相关酶的活性,对抑制荔枝果皮衰老、延长贮藏期更有利。     

多肽对荔枝成花、果实发育、产量和果实品质的影响

以海南主栽品种妃子笑和白糖罂为试材,探讨了多肽对荔枝成花、果实发育、产量和果实品质的影响。结果表明:多肽能显著提高荔枝的单株花穗数、单穗雌花数量、单果鲜重和单株产量;能通过提高优质果率、降低裂果率,提高了荔枝的商品果率;可使荔枝盛花期提前2～4d,采收期提前2～3d,能显著提高荔枝果肉的可溶性总糖含量、降低可滴定酸含量、增加了糖酸比;能提高荔枝果肉可溶性固形物、水解氨基酸和维生素C的含量,改善果实的营养品质;能提高果皮花色素苷含量,降低果皮叶绿素含量,果皮更加红艳,改善了外观品质;喷施多肽的800倍和1000倍水稀释液的总体效果好于500倍液。     

火龙果HpNAC1转录因子的特性分析及其对HpCytP450-like1基因的调控

以红肉火龙果(Hylocereus polyrhizus)果实为材料,克隆得到HpNAC1基因,研究该基因的荧光定量、亚细胞定位、转录活性及其对下游靶基因的调控能力,揭示其在火龙果生长发育过程中的分子作用机制。应用预测软件对HpNAC1基因进行生物信息学分析,利用q RT-PCR分析HpNAC1基因在果实发育过程中的表达情况,以农杆菌侵染烟草叶片的方法对HpNAC1基因进行亚细胞定位分析,以双荧光素酶瞬时表达的方法分析HpNAC1基因的转录活性及其对下游靶基因调控能力。结果表明,HpNAC1的ORF全长为846 bp,具有NAC结构域,q RT-PCR检测表明随着果实的生长发育,其表达明显增强;亚细胞定位和转录活性分析显示其是核蛋白,并且具有转录激活活性;双荧光素酶瞬时表达分析显示,HpNAC1转录因子可以激活基因Hp Cyt P450-like1的启动子活性。实验明确了HpNAC1基因的亚细胞定位信息及其在果实发育过程中表达和瞬时表达情况,为进一步研究其功能及分子机制提供依据。      

甘薯黄烷酮3-羟化酶基因IbF3H的克隆和表达特性分析

黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase,F3H）是黄酮类化合物合成途径中的一个关键酶。本研究基于前期转录组数据,以‘福菜薯7-6’叶片为材料成功克隆CDS序列长度为1107 bp的基因IbF3H,利用生物信息学分析甘薯F3H基因的序列特征、氨基酸序列对比、蛋白系统进化树、蛋白的二、三级结构、预测其跨膜结构和亚细胞定位,并利用qRT-PCR分析盐旱胁迫处理下基因的表达特性。结果表明,该基因含有3个外显子和2个内含子,编码368个氨基酸,蛋白分子量为41.12 kDa,等电点为5.83。存在多种类型的启动子顺式作用元件,如光响应元件G-Box、ACE,干旱胁迫相关的MBS元件,与脱落酸激素响应相关的ABRE元件等。与其他植物的氨基酸序列相似性达到了80%以上,可见IbF3H的编码区高度保守,且黄烷酮3-羟化酶在进化上具有较高的保守性。IbF3H蛋白含有非血红素双加氧酶结构域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能结构域（2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶结构域）,属于双加氧酶超家族。IbF3H蛋白可能在细胞质中表达并且不具备跨膜结构。qRT-PCR研究结果表明,IbF3H基因并非组织特异性表达的基因,叶和茎表达量高于茎尖和根。模拟盐胁迫处理后,IbF3H基因表达量呈现先下降后上升的趋势;模拟干旱胁迫处理后,IbF3H基因表达量始终高于对照组,以响应逆境胁迫。本研究可为下一步探索IbF3H基因在调控甘薯类黄酮生物合成途径和功能作用奠定基础。     

龙眼果实脱落特性参数与果柄分离力的相关性分析

海南反季节龙眼采前落果普遍发生,严重制约了反季节龙眼产业的发展。而果柄分离力可以反映果实离层活动的状况,成为果实脱落进程的重要指标,但未见在龙眼上使用的报道。本研究以DS2-1000 gf和DS2-5000 gf型推拉力仪检测果柄分离力,并分析果实脱落过程中各项生理特性参数,旨在弄清龙眼果实脱落过程中果柄分离力与果实碳水化合物、呼吸速率和离层细胞壁代谢酶活性的关系。数据表明反季节龙眼果实脱落过程中,果柄分离力的变化范围为0~3000 gf,且果柄分离力低于1000 gf会导致果实呈现脱落趋势;落果率与果柄分离力呈现显著负相关性（r=-0.984,P=0.000）;果实总糖和淀粉含量与果柄分离力呈现显著正相关性,相关系数分别为0.942（P=0.005）和0.952（P=0.003）;果柄呼吸耗氧速率与果柄分离力呈负相关性（r=-0.807,P=0.099）;果柄离层纤维素酶和β-甘露聚糖酶活性也与果柄分离力呈显著分负相关性,相关系数分别为-0.936（P=0.019）和-0.954（P=0.002）。结果表明反季节龙眼果实脱落进程可用果柄分离力的变化体现,果实脱落进程伴随着果柄分离力的不断降低,与果柄细胞壁降解酶活性的增加呈线性关系;脱落的发生与碳水化合物含量关系密切,而高的果实呼吸消耗,可能加快果实脱落进程。     

荔枝资源果实成熟进程中糖、酸变化

为探讨荔枝品种资源果实成熟期间的糖、酸变化特点,对15份荔枝品种资源果实成熟进程中假种皮的糖、酸含量变化及其完熟果的还原糖、蔗糖含量进行分析。结果表明,15份荔枝资源果实成熟进程中的糖的变化可分为还原糖积累型和蔗糖积累型2大类,其中还原糖积累型又可分为4个亚类;不同品种资源间,完熟果的还原糖、蔗糖含量差异显著,还原糖的含量在67.50~118.63 mg/g,蔗糖的含量在13.60~93.27 mg/g,大部分的荔枝资源其果实主要积累还原糖;荔枝果实假种皮的可滴定酸含量在成熟的前期急剧下降,后期变化趋缓;以完熟果的各糖分指标进行聚类分析可将15份荔枝资源分为2个类群5个组群。