Cloning and expression of phytoene synthase gene in Strelitzia reginae

[目的]揭示八氢番茄红素合成酶(PSY)基因在鹤望兰花色形成中的作用.[方法]依据植物PSY基因的氨基酸保守序列设计引物,从鹤望兰黄色花萼中克隆PSY片段,对该片段进行序列比对和系统进化分析,并应用RT-PCR技术分析PSY基因在不同器官和花朵发育过程中的表达特性.[结果]克隆获得248 bp的PSY段,编码82个氨基酸,经注册,在GenBank的登录号为JN887695.由该片段推导出的氨基酸序列与其他植物的PSY蛋白有很高的同源性,其中与大蒜的亲缘关系最近,达90％,初步证明为目标基因.此外,该基因在鹤望兰始花期和黄色萼片中表达量最高.[结论]PSY可能在转录水平上对鹤望兰黄色花的形成起调控作用.     

鹤望兰二氢黄酮醇-4-还原酶基因SrDFR的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法从鹤望兰蓝色花瓣中克隆到类黄酮合成途径关键基因 S rD FR ,该片段长246 bp ,编码82个氨基酸。氨基酸同源性分析表明, SrDFR推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的DFR蛋白具有很高的同源性。系统进化树分析显示,鹤望兰 S rD FR与姜荷花聚为一类,亲缘关系较近。应用半定量 PCR分析表明, S rD FR在蓝色花瓣中高表达,在黄色花萼和叶片中低表达,且在花发育的始花期表达量最高,表明该基因在蓝色花瓣发育过程中起着重要作用。     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建

[目的]克隆菊花CmAPETALA1基因(CmAP1)并构建植物表达载体,为该基因功能的遗传改良打下研究基础.[方法]采用同源克隆及RT-PCR从菊花叶片中克隆CmAP1基因,运用在线生物信息学分析工具对其核苷酸及氨基酸序列进行分析,利用实时荧光定量PCR对该基因的组织表达差异进行分析,并用双酶切法将目的基因与pCAMBIA1300载体连接,构建植物表达载体.[结果]克隆获得的CmAP1基因(GenBank登录号KU872999)编码区开放阅读框(ORF)长741 bp,编码246个氨基酸;CmAP1蛋白属亲水性蛋白,分子质量约28.3 kD、理论等电点(pI)为8.76,预测该蛋白内含10个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点;蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明,CmAP1蛋白与CDM111蛋白的同源性达98%,属MADS-box基因家族A类基因的euAP1分支;实时荧光定量PCR分析结果表明,CmAP1基因在花蕾中表达量极高,在舌状花和筒状花中表达量较低,而在营养器官中仅痕量表达.将CmAP1基因连接到pCAMBIA1300载体上,可成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1.[结论]CmAP1基因在花的发育及形成过程中发挥重要作用,成功构建获得的植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1可为后期利用基因工程手段改变菊花花形态结构、调控花期及遗传改良打下基础.     

薄壳山核桃MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

[目的]克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS-box家族基因及其发育的分子机理奠定基础.[方法]以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT-PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析.[结果]分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137 bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65.7%~98.5%,其推导氨基酸序列中有11个存在差异.系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因.[结论]薄壳山核桃中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因.     

Semi - quantitive Analysis of Isomaitooligosaccharide and Yeast Cell Wall on the Expression of Lysozyme Gene in the Liver of Trionyx sinensis

[目的]探讨低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖肝脏中溶菌酶基因表达的影响.[方法]利用CODEHOP设计简并引物,通过RT-PCR克隆中华鳖溶菌酶基因,然后通过半定量PCR分析低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶基因在肝脏中表达量的影响.[结果]通过克隆中华鳖溶菌酶基因,获得303 bp的溶菌酶基因片段,其GenBank登录号HQ437284,与GenBank登录号Q7LZQ1.3的中华鳖C型溶菌酶氨基酸序列同源性为75％.半定量分析结果表明,低聚异麦芽糖可显著提高中华鳖溶菌酶基因在肝脏中的表达量,而酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶基因片段在肝脏中的表达量的影响不显著.[结论]该研究可为低聚异麦芽糖和酵母细胞壁在中华鳖养殖中的科学应用以及绿色环保添加剂的开发提供理论依据.     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

铁皮石斛查尔酮合酶基因克隆与表达分析

[目的]克隆铁皮石斛中查尔酮合酶(CHS)基因,分析其基本生物学信息及组织表达特异性,为进一步研究CHS基因在铁皮石斛中的表达调控机理及其在铁皮石斛中的功能打下理论基础.[方法]采用铁皮石斛转录组序列与NCBI同源序列进行比对,根据保守区段设计引物克隆铁皮石斛CHS基因的cDNA全长,采用实时荧光定量PCR定量表达分析不同生长年限、不同组织部位中CHS基因的表达水平.[结果]铁皮石斛CHS基因cDNA编码区1188 bp,编码395个氨基酸,GenBank登录号KT783451,分子量为43.2 kD,理论等电点6.05.铁皮石斛GHS氨基酸序列与同属植物金钗石斛(Dendrobium nobile)的CHS氨基酸序列同源性最高,达99%,与非同科植物欧洲大叶杨(Populus trichocarpa)、巨桉(Eucalyptus grandis和紫玉兰(Magnolia liliiflora)等植物的同源性在83%左右.该基因编码的蛋白质属非分泌蛋白,定位于细胞质基质中,为非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白.CHS基因在1年生铁皮石斛叶片中的表达量最高,随着植株年龄的增长,叶片中CH基因的表达量降低,茎中的表达量升高.[结论]铁皮石斛CHS基因早期主要参与激素运输和器官形态建成,后期主要参与类黄酮物质合成.     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

鹤望兰组织培养和快速繁殖的研究

[目的]建立以组织培养为基础的鹤望兰快速繁殖体系。[方法]研究了以鹤望兰成熟种子切段作为外植体的组织培养方法。以MS为基本培养基,通过改变激素的种类和浓度配比来选择合适的培养基,建立鹤望兰组培快繁体系。[结果]以成熟种子切段作为外植体,表面消毒以浓度70%酒精预处理30 s,再用浓度0.1%HgCl2浸泡10 min,效果较好;培养基MS＋6-BA1.5 mg/L＋ZT1.0 mg/L＋NAA1.0 mg/L有利于原球茎的诱导,适用于初代培养;MS＋6-BA2.0 mg/L＋ZT1.0 mg/L＋NAA0.5 mg/L有利于原球茎丛生芽的形成和增殖,可用于继代增殖;1/2 MS＋IBA0.6 mg/L适宜诱导生根获得再生植株,生根率达90%以上;生根苗移栽到添加适量腐叶土、粗砂的疏松肥沃的培养土中,成活率达92%以上。[结论]该研究结果为鹤望兰快速繁殖体系的建立提供了基础资料。     

鹤望兰组织培养研究进展

鹤望兰为世界著名的多年生草本花卉,具极高的观赏价值和经济价值。笔者从外植体选择、植物生长调节剂与添加物的使用、培养基和培养条件的影响、褐化控制等方面,综述了国内外鹤望兰组织培养研究的进展,并就有关研究工作提出建议。     

中国水仙花色相关基因的克隆与分析

【目的】克隆并初步分析与中国水仙花色发育相关的八氢番茄红素合成酶（PSY）、八氢番茄红素脱氢酶（PDS）和番茄红素β-环化酶（LycB）等3个酶基因序列及结构,了解其花色形成的分子机制,为进一步研究中国水仙类胡萝卜素代谢基因工程奠定基础。【方法】以中国水仙花瓣的mRNA为模板,采用RT-PCR技术扩增PSY、PDS和LycB等3个关键酶基因的保守序列,并进行序列结构分析。【结果】分离得到的中国水仙PSY、PDS和LycB的保守序列长度分别为343、500和486 bp,分别编码112、166、161个氨基酸。基因比对结果表明,推导氨基酸序列与已知其他不同植物均具有较高同源性,分别为76.5%～96.1%、69.8%～98.3%和77.3%～95.5%,且包含PSY、PDS和LycB酶的相关功能结构域,初步证明为目标基因,不同物种间的PSY、PDS和LycB基因具有相当高的保守性。编码蛋白预测结果发现,PSY、PDS和LycB虽然有部分疏水区域,但是不存在明显的跨膜结构域。【结论】研究结果为进一步了解中国水仙花色相关酶基因的调控功能及花瓣着色机理奠定分子基础。     

桃果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg²⁺结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

葱蝇Dorsal基因的克隆·表达及生物信息学分析

[目的]探讨Dorsal与葱蝇滞育发育的关系。[方法]以葱蝇(Delia antiqua)为试虫,采用RACE方法克隆了葱蝇Dorsal的全长cDNA序列;将该序列推导的氨基酸序列在GenBank搜寻同源序列,与搜寻到的14个代表性昆虫Dorsal序列进行相似性比较,并进行系统进化分析;采用半定量RT-PCR方法分析了Dorsal基因在葱蝇非滞育、夏滞育、冬滞育蛹中的表达情况。[结果]克隆了葱蝇Dorsal基因的cDNA序列,全长2 412 bp,开放阅读框1 974 bp,编码657个氨基酸,等电点PI约8.5,分子量72.9 kDa。与GenBank中的其他14个昆虫代表性Dorsal序列相似性比较和进化分析显示葱蝇的Dorsal与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、拟暗果蝇(Drosophlia pseudoob-scura)的Dorsal序列相似性最大。半定量分析显示葱蝇Dorsal基因在葱蝇冬滞育、夏滞育、非滞育蛹滞育发育关键期的表达量均明显升高,尤其在滞育后期表达量最高,初步判断Dorsal基因与葱蝇滞育发育相关。[结论]为进一步开展Dorsal基因在昆虫滞育发育过程中的功能研究奠定了基础。     

不同种皮软化时间和浸种时间对鹤望兰种子发芽率的影响

[目的]寻找最佳的鹤望兰（StrelitziareginaeBanks）种子种皮软化时间和浸种时间。[方法]98％H2SO4软化鹤望兰种子种皮3、5、8、10min,以清水为对照,软化后种子分别在清水中浸种3、4、5d,之后进行发芽试验测定鹤望兰种子发芽率。[结果]最佳处理为98％H2SO4软化种皮8min、浸种3d,发芽率达到60％,优于其他处理30％以上。[结论]该研究可为扩大鹤望兰种子繁殖提供依据。     

黄金鲈鱼的一种ZP基因的电子克隆与鉴定分析

[目的]克隆分析黄金鲈鱼的一种邪基因。[方法]利用生物信息学手段克隆了黄金鲈鱼的一种ZP基因的全长CDNA序列,并对其序列进行了分析。[结果]该cDNA序列包含1653bp的开放阅读框,编码550个氨基酸。氨基酸序列同源性分析和进化分析表明,黄金鲈鱼的ZP蛋白与丰滑舌鳎ZP3b和青鳝ZPC5具有较高的同源性。[结论]所获得的黄金鲈鱼的ZP基因属于ZP3类型。     

羊草乙醛脱氢酶（ALDH）基因片段的克隆及表达分析

[研究目的]克隆羊草的乙醛脱氢酶ALDH基因片段,研究该基因在不同条件下的表达情况。[方法]采用RT-PCR技术克隆羊草的ALDH基因片段,并对其核苷酸和氨基酸序列进行分析,采用RealTimeRT-PCR方法研究该基因的表达。[结果]获得了羊草的ALDH基因片段,长度为675bp,编码225aa。核苷酸序列比较表明,与水稻ALDH1a序列(AB037421)同源性为86%,与玉米RF2C(AF348413)同源性为85%。BLASTp分析,该序列与水稻、玉米、拟南芥的乙醛脱氢酶一致性分别高达87%、86%、60%,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。RealTimeRT-PCR数据表明,在诱导条件下该基因的表达量呈先升高后降低的趋势。总体上来说,该基因对盐的响应要高于干旱和冷冻。[结论]成功获得了羊草ALDH基因片段,并研究了该基因的表达情况,为进一步克隆羊草ALDH全长基因奠定了基础。