茄子SmMsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析

利用RT-PCR从茄子单性结实品系D-10中获得甲硫氨酸亚砜还原酶A基因(Sm Msr A)的编码区。通过Gateway同源重组技术,构建了3个分别含Sm Msr A基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体p TRV2-Sm Msr Ai。表达载体转入农杆菌GV3101后,用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和q RT-PCR技术,评价构建的VIGS体系对Sm Msr A基因的沉默效果。结果表明,报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象,Sm Msr A基因沉默后叶片呈花叶状,果实变小,叶片和果实中的Sm Msr A基因的表达量明显降低,表明Sm Msr A基因是正向调控茄子果实发育的相关基因。     

蔗糖合成酶PavSS1调控甜樱桃果实成熟的功能分析

【目的】明确甜樱桃PavSS基因家族在果实成熟过程中的功能。【方法】利用qRT-PCR技术分析了7个蔗糖合成酶基因PavSS1～7在果实发育过程中的表达情况,并分析了蔗糖对PavSS家族基因表达的影响,利用甜樱桃果实的VIGS技术分析了PavSS1与PavSS6基因影响果实成熟的功能。【结果】PavSS1和PavSS2基因在甜樱桃果实发育和成熟过程中均表达,且PavSS1基因表达量是PavSS2基因的10倍以上;PavSS1和PavSS2在果实发育前期表达量逐渐升高,后期表达量逐渐降低。PavSS3和PavSS5基因在整个果实发育期均低表达,且表达量差异不显著。PavSS4和PavSS7基因在果实发育前期表达量高,后期表达量低。PavSS6基因在果实发育初期低表达,随后表达量逐渐升高,并维持较高水平。外施蔗糖显著下调了PavSS1和PavSS6基因的表达,而PavSS2、PavSS3、PavSS4、PavSS5和PavSS7基因的表达变化不显著。沉默甜樱桃果实PavSS1基因抑制了甜樱桃果实成熟,包括果实硬度、ABA含量、花色苷含量和可溶性糖含量发生显著变化以及成熟相关基因的表达量显著下调;而沉默PavSS6基因的甜樱桃果实与空载对照相比,没有显著变化。【结论】PavSS1基因可能是控制甜樱桃果实蔗糖代谢的关键基因,参与了甜樱桃果实成熟过程的调控。     

甜樱桃磷酸蔗糖合酶基因Pav SPS的功能分析

从甜樱桃基因组中鉴定了4个磷酸蔗糖合酶(sucrosephosphatesynthase,SPS)基因(PavSPSA1、PavSPSA2、PavSPSB和PavSPSC)。实时荧光定量PCR分析表明,PavSPSA1在甜果实发育和成熟过程中表达量最高,其次是PavSPSC,PavSPSA2和PavSPSB表达量较低;PavSPSA1和PavSPSA2在果实成熟软化过程中均上调表达,与甜樱桃果实的成熟软化过程吻合。通过利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默PavSPSA1,甜樱桃果实蔗糖含量降低,果实着色和果实成熟软化延迟;沉默PavSPSA2、PavSPSB和PavSPSC,甜樱桃果实蔗糖含量、果实着色和果实成熟软化与对照无差异,推测PavSPSA1或许是调控果实蔗糖合成与积累的关键基因,影响果实着色和成熟软化。     

李坏死环斑病毒诱导的桃PpPDS沉默体系的优化及验证

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是在桃（Prunus persica）上进行基因沉默的主要手段，现有VIGS体系效率较低，亟待开发针对桃的高效沉默体系。以桃八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase）基因PpPDS为指示基因，探究不同侵染方式、病毒载体、温度、接种苗龄和菌液浓度对桃叶片VIGS效率的影响。结果表明，在侵染方式上，叶片注射是有效的方式；李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV）载体（pCaRNA1/2和pCaRNA3）优于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）改造后的TRV载体（pTRV1和pTRV2）；温度为22℃左右PpPDS的沉默效率较高；苗龄为5～6片完全展开叶的桃苗沉默效率较高，达到85%；菌液浓度为OD600=1.0时沉默效率较高。以优化好的VIGS体系参数，选择桃叶绿素合成基因（PpGluTR和PpPOR）为目标基因进行验证，结果显示PpGluTR和PpPOR的表达均被显著抑制，叶片颜色变化明显。这些结果表明优化...     

扁桃AcCBF1基因VIGS载体构建与功能分析

【目的】利用VIGS(TRV-mediated Virus Induced Gene Silencing)方法沉默扁桃(Amygdalus communis L.)AcCBF1基因表达,并初步探讨AcCBF1对低温条件下花药发育的调控。【方法】从‘纸皮’扁桃花药中克隆AcCBF1基因(729 bp),并设计4个不同长度(729、345、464、270 bp)的AcCBF1基因片段,连接到pTRV2载体上,构建VIGS载体,转化根瘤农杆菌GV3101,并用注射法侵染到扁桃花蕾内。对侵染的花器官低温处理,用半定量PCR和荧光定量PCR分析AcCBF1基因表达,以及对花器官表型进行初步分析。【结果】成功构建了3个AcCBF1基因沉默表达载体,pTRV2-AcCBF12和pTRV2-AcCBF14能显著沉默扁桃花药中AcCBF1的表达;低温处理后这两组处理的扁桃花瓣小且颜色浅,花芽和花药鲜重轻且小,与对照相比差异显著。【结论】AcCBF1在调控低温条件下对花器官表型指标发挥重要作用。该研究结果可为扁桃生殖期抗冻相关基因的功能验证和分子调控机制研究提供重要的参考和技术支持。     

草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因的克隆和功能分析

【目的】克隆草莓YUC家族新基因,探究其在草莓中的具体调控作用。【方法】以‘久香’草莓为材料,利用同源克隆技术克隆草莓果实大小调控相关的新基因,利用病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)结合定量RT-PCR技术,分析新基因在草莓果实膨大调控中的作用。【结果】从‘久香’草莓果实中克隆到1个草莓果实大小调控相关的新基因,命名为FaYUC11(Gen Bank登录号:JX417083.1),用草莓幼果微注射法建立了病毒诱导FaYUC11基因沉默的转基因草莓体系,结果发现,FaYUC11基因沉默后果实的膨大和正常生长均受到影响,并且导致果实瘦果(种子)中游离生长素含量下降、果实纵横径增长率降低。【结论】FaYUC11基因是草莓生长素合成途径中的关键基因,该基因通过调控生长素的合成继而调控果实的膨大。     

佛手和山金柑果形相关基因CRC的TRV-VIGS体系的构建研究

以芸香科的佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle）和山金柑（Fortunella hindsii Swingle）花期叶片为材料,以果实发育相关的CRC基因为对象,利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）研究构建病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术体系,为基因功能研究提供有效简便的方法。待沉默的佛手植株剪枝、抹除花芽后,将CRC基因的沉默载体两次注射于佛手和山金柑的顶部叶片,注射间隔15～30 d。在注射后25～115 d内,佛手新生叶、新生花、果中的CmsCRC表达量均显著下调,且沉默植株的果形聚拢,果实指状结构数增加。CRC基因在佛手中的沉默有效时间是侵染后25～115 d,而在山金柑中沉默有效时间是25～105 d。     

中科院发现转录因子SIDof1在番茄果实成熟中的功能

正中国科学院植物研究所秦国政课题组报道了番茄完成果实成熟必需的转录因子SlDof1,敲除SIDof1将延迟果实成熟的过程。研究者发现,在番茄已知的34个Dof转录因子中,有29个基因在果实成熟的发育阶段表达,其中5个基因有显著上调。通过病毒介导的基因沉默技术,发现只有SlDof1沉默的植物表现出明显的果实颜色呈斑片状表型。SIDof1在番茄成熟期,集中表达在果皮的维管组织,而非果皮中,蛋白则在果皮组织中明显积累。     

‘赣南早’脐橙早熟性状回复型突变体的生理与转录组分析

【目的】明确早熟品种‘赣南早’脐橙(wild type,WT)与其早熟性状回复型突变体(mutant type, MT)在生理和转录水平的差异,探究柑橘果实成熟的调控机制。【方法】测定MT和WT的果实品质及成熟相关生理指标,采用RNASeq分析MT和WT果实的转录差异。【结果】MT具有稳定的早熟性状回复现象。MT和WT果皮的各可溶性糖含量差异显著。MT和WT有机酸含量在果肉间及果皮间差异均显著。MT果皮的赤霉素(gibberellin,GA)、吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)和茉莉酸(jasmonic acid,JA)显著高于WT,脱落酸(abscisic acid,ABA)则相反。转录组测序分析表明,MT与WT果皮间DEGs数量为980个,果肉间为289个。在果皮DEGs中,有38种GO分类、6个KEGG代谢通路被显著性富集,而果肉中未见GO分类和KEGG代谢通路的显著性富集。ABA合成基因CsNCED1在MT果皮和果肉中均下调表达,而分解基因CsCYP707A1在MT果皮中上调表达。【结论】MT成熟期比WT推迟约30 d。MT果皮GA含量及GA合成基因CsCPS1、CsKAO表达量均高于WT,可能与果皮的褪绿延迟相关。MT果皮ABA积累抑制可能受合成基因CsNCED1下调表达及分解基因CsCYC707A1上调表达的影响。MT和WT果皮的生理和转录组水平差异均比果肉间差异大,说明果皮在柑橘果实成熟过程中具有重要作用。     

病毒诱导的基因沉默在番茄组织中的特异性分析

 病毒诱导的基因沉默（VIGS）是植物基因功能研究的新技术。以组成型表达gusA基因的转基因番茄为材料,通过VIGS技术沉默gusA基因,对VIGS在番茄中的组织特异性进行了初步分析。结果表明,VIGS技术能有效地诱导gusA基因在番茄植株的叶片、花、果实、侧枝、主茎及茎分枝点等部位和组织中沉默,证明VIGS在番茄中具有较强的系统性沉默特征。     

套袋对2种类型红肉猕猴桃果实着色的影响

【目的】探讨套袋处理对2种不同类型红肉猕猴桃果实着色的影响,为解析光照对花色苷合成分子机制的影响提供依据。【方法】以不同类型的红肉猕猴桃品种‘红阳’与‘天源红’为试材并分别对其进行套袋处理,使用日本柯尼卡美能达可携式色差计CR-400对不同处理、不同时期、不同果实部位进行色差指标的测定,采用高效液相色谱法对这些样品果的花色苷含量进行半定量分析。【结果】套袋能使‘红阳’猕猴桃果实中果皮、内果皮的色度角明显降低,促进中果皮绿色变淡,内果皮红色变深。‘红阳’猕猴桃的中果皮在整个果实发育过程中始终没有检测到花色苷的存在,内果皮在花后70 d开始有花色苷的积累,随后出现交替增长的规律。在果实生长发育前期,套袋果实解袋后内果皮花色苷积累量高于一直套袋和未套袋果实。在花后100~120 d,未套袋果实内果皮花色苷积累量一直增加,至花后120 d达到最大,高于一直套袋和解袋果实。套袋能够显著降低‘天源红’果实外果皮的色度角,而对果肉(中果皮和内果皮)和果心色度角并无显著影响。一直套袋会阻碍花色苷在外果皮、果肉、果心中的积累。套袋果实解袋后外果皮、果肉、果心花色苷的积累量明显升高,在花后110 d达到最大。【结论】套袋果实解袋能够促进‘红阳’猕猴桃果实内果皮更多地积累花色苷,甚至高于非套袋果实,可以促进内果皮更好地着色。一直套袋能够促进‘红阳’内果皮着色,但促进强度不如前者。套袋处理对‘天源红’果实的影响主要集中在外果皮,果肉次之,对果心的影响较小。套袋果实解袋能够促进‘天源红’猕猴桃果实外果皮、果肉更多地积累花色苷,甚至高于非套袋果实,可以促进外果皮和果肉更好地着色。一直套袋阻碍‘天源红’果实花色苷的合成积累,影响着色。     

利用VIGS技术研究草莓FaMYB5的功能

以‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonaka’)为材料,采用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)对果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子基因FaMYB5进行沉默,并对沉默后果实类黄酮化合物代谢途径相关的结构基因和其他转录因子基因表达量进行半定量RT-PCR及RT-qPCR分析。并分别采用HPLC和香草醛—硫酸比色法对沉默后果实中花青素苷和原花青素含量进行测定。成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS沉默载体,并建立了草莓果实VIGS沉默体系,FaMYB5基因沉默效率达60%;FaMYB5基因沉默处理与阴性对照相比,草莓类黄酮化合物代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FaMYB9、FaLAR、FaDFR、FaANR表达量显著增加,从而导致果实中原花青素含量增加;而花青素合成相关基因FaANS的表达量减少1/2,FaMYB10表达量变化并不显著。此外,bHLH家族的转录因子基因FabHLH3和FabHLH3Δ随着FaMYB5的沉默表达量显著下降,而FaGL3显著升高。结果进一步证明FaMYB5转录因子对草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径起负调控作用。     

莲雾实时荧光定量PCR内参基因的筛选和验证

【目的】莲雾果实品质不稳定和冬季低温寒害是生产上的两大问题,筛选稳定可靠的内参基因,以便开展莲雾品质形成和低温胁迫响应分子机制研究。【方法】以‘紫红’‘黑珍珠’‘翡翠’3个莲雾品种为材料,利用qRT-PCR检测7个候选内参基因ACT-7、GAPDH、UBQ、α-TUB、CYP20-1、EF-2和APRT-5在果实发育和低温胁迫时的表达水平,通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件进行基因稳定性评价。【结果】不同软件分析结果不同,geNorm、NormFinder和RefFinder结果相似,果肉发育过程、果皮发育过程、低温胁迫下表达最稳定的内参基因分别是ACT-7、α-TUB和CYP20-1,BestKeeper则显示UBQ为表达最稳定的基因。用筛选的内参基因α-TUB和UBQ分析莲雾花青苷合成途径中F3H基因的表达,2者表达规律较一致。【结论】莲雾果肉发育过程、果皮发育过程、低温胁迫下最适的内参基因数分别为4个(ACT-7、GAPDH、UBQ、α-TUB)、2个(α-TUB、UBQ)和2个(CYP20-1、UBQ)。     

1-MCP处理对采后‘澳洲青苹’苹果叶绿素降解的影响

【目的】以‘澳洲青苹’苹果为试材,研究1-甲基环丙烯(1-MCP)对果实采后叶绿素降解代谢的影响,为果实采后贮藏、保鲜及保绿技术提供新的理论基础。【方法】采用1μL·L^-11-MCP处理‘澳洲青苹’苹果果实,定期测定果实色泽、乙烯释放量和呼吸强度,通过高效液相色谱法(HPLC)对果皮中的叶绿素及其降解代谢产物进行定性定量分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测叶绿素降解途径中关键基因的表达水平。【结果】1-MCP处理显著延缓‘澳洲青苹’果皮颜色转变,降低乙烯释放量和呼吸强度。1-MCP处理能保持果皮叶绿素a、b含量处于较高水平,并抑制脱镁叶绿素a和脱镁叶绿酸a的生成。叶绿素降解相关基因MdSGR、MdHCAR、MdPPH和MdNYC1的表达量受到1-MCP的调控,1-MCP抑制基因MdPAO和MdRCCR的表达,推迟叶绿素降解代谢的下游反应;MdPAO表达量与果皮色泽和叶绿素含量显著相关。【结论】1-MCP可调节叶绿素降解途径相关基因表达水平来控制代谢产物的降解和生成,从而延缓果皮叶绿素降解,其中,MdPAO是调控叶绿素降解的关键基因。     

茄子TRV-VIGS体系的优化及SmIAA19基因功能初步分析

以经过改造的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体PYL156为工具,采用叶片注射法侵染茄子（Solanum melongena L.）叶片,通过表型比较、TRV病毒分子检测和荧光定量PCR技术分析,探究环境温度、植株大小、目的基因插入片段大小对茄子TRV-VIGS沉默体系的影响。结果表明,昼夜温度为（25 ± 3）℃和（20 ± 2）℃时,接种茄子幼苗子叶的植株沉默效果明显,侵染后植株叶片中目的基因表达量与阴性对照相比明显降低;早春日光温室和秋季日光温室条件下,侵染植株表型性状和基因表达量差异不显著。沉默片段大小为200 bp左右时目的基因的沉默效果最好;侵染茄子幼苗子叶期植株出现明显病毒斑,而接种6周龄真叶则无明显表型差异。用茄子生长素诱导基因（SmIAA19）为靶基因对其进行验证,结果表明显著抑制了SmIAA19的表达,其在叶片中的表达量和生长素含量均显著降低,表明SmIAA19是1个与生长素代谢途径相关的基因。     

不同生态条件杧果着色及花色苷合成相关基因表达比较

【目的】比较2个不同生态区杧果果实着色的差异,并探讨着色差异的内在机理。【方法】试验于2012年比较了‘台农1号’杧果在四川攀枝花和广东雷州2个生态区的果皮颜色、花色苷含量和花色苷合成相关基因表达模式差异。【结果】四川攀枝花地区高海拔、昼夜温差大,较低降雨量,该生态区‘台农1号’杧果果皮花色苷含量显著高于雷州地区,着色较好,果皮色度角显著低于雷州地区。花色苷合成基因Mi PAL、Mi C4H、Mi CHS1、Mi F3H1、Mi DFR和Mi UFGT的相对表达量以攀枝花地区显著高于雷州地区,其中Mi C4H、Mi CHS1、Mi F3H1、Mi DFR和Mi UFGT基因的相对表达量分别为雷州地区的130、228、63、2.7和4.3倍。【结论】四川攀枝花地区海拔高、辐射强和昼夜温差大等生态因子有利于诱导果皮中花色苷合成相关基因尤其是Mi PAL、Mi CHS1、Mi DFR和Mi UFGT的表达,促进‘台农1号’果皮着色。     

西瓜果实几个性状的QTL分析

【目的】探讨西瓜果肉颜色和β-胡萝卜素含量等性状的遗传规律并进行QTL分析。【方法】以白色果肉西瓜品系PI186490和红色果肉西瓜品系LSW-177为亲本获得包含359个单株的F2代群体,对成熟西瓜果实果肉颜色、β-胡萝卜素含量等性状进行调查,同时以高通量测序为基础开发195个CAPS分子标记,进行遗传连锁图谱的构建和QTL分析。【结果】该群体果肉颜色(黄色、红色、白色)的分离比例符合9∶3∶4的隐性上位遗传模型。构建的遗传连锁图谱包含11个连锁群、覆盖基因组总长度为2 029.8 c M,标记间平均距离为10.46 c M。共获得与果肉颜色、β-胡萝卜素含量、果实长度、果实宽度、果形指数、边缘果肉硬度及可溶性固形物含量等性状相关的位点24个,可解释1.39%~70.29%的表型变异。其中,与果肉颜色相关的主效位点2个,位于4号和6号连锁群上;与果形指数相关的主效QTL位点1个,位于3号连锁群上;β-胡萝卜素含量、果实长度、果实宽度、边缘果肉硬度4个性状均找到贡献率大于10%的位点。【结论】用CAPS标记构建西瓜遗传连锁图谱,获得与西瓜果肉颜色、β-胡萝卜素含量等性状相关的QTL位点24个,为进一步开展西瓜果实相关基因定位和克隆研究提供理论依据。     

软枣猕猴桃果肉花色苷关键光响应调节因子AaMYB1的筛选

【目的】从前期‘天源红’不同发育时期果肉转录组测序结果中筛选了与全红型软枣猕猴桃果肉着色相关的14个转录因子基因,鉴定在套袋过程中的表达特征,并筛选关键光响应转录因子。【方法】以全红型软枣猕猴桃品种‘天源红’盛花后8个时期的果肉样品为试材,在盛花后30 d对果实进行套袋处理,以不套袋果实作对照;使用日本柯尼卡美能达可携式色差计CR-400进行色差指标测定,采用超高效液相色谱串联质谱法检测花色苷组分及总含量,利用实时荧光定量PCR技术检测14个转录因子基因的表达量并对其进行相对定量;通过表型、基因表达量与花色苷含量的相关性分析,综合筛选关键光响应转录因子。【结果】随着果实生长发育,果肉颜色均由绿变红,在盛花后120 d红色最深,未套袋果肉红色明显深于套袋果肉,色泽比和色度角的测定结果与表型鉴定结果一致。果肉主要呈色物质是矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷,二者与总花色苷含量呈极显著相关;盛花后120 d,矢车菊素-3-O-半乳糖苷和总花色苷含量在套袋与不套袋果肉中差异显著。实时荧光定量PCR结果显示,MYB1在盛花后120 d未套袋果肉中的表达水平显著高于套袋果肉,并且与未套袋果肉矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷含量呈显著正相关,与套袋处理果肉不相关。【结论】筛选到软枣猕猴桃花色苷形成响应光照的关键转录因子AaMYB1;套袋处理可能通过抑制AaMYB1的表达从而抑制花色苷(主要是矢车菊素-3-O-半乳糖苷)的合成与积累,从而阻碍果实正常着色。     

‘锦绣’桃果实25℃贮藏的硬度与色泽变化及相关性分析

【目的】明确桃果实25℃贮藏的主要贮藏品质变化。【方法】2012年与2013年供试‘锦绣’黄桃树体分别施用常规化肥及15、20与30袋控缓释肥,研究2个年度4种施肥处理桃果实25℃贮藏0 d、4 d和8 d的采后变化。【结果】供试果实25℃贮藏过程中,果肉硬度呈下降趋势,果皮与果肉的A*值呈上升趋势,果皮与果肉的L*值、B*值和Chroma(C*)值的变化较小。4种施肥处理果实的采收品质和25℃耐贮性没有明显区别。【结论】‘锦绣’黄桃25℃贮藏过程中,果皮和果肉的A*值与果肉硬度显著负相关。     

查尔酮合酶基因对桃果实花色苷代谢的影响

从桃（Prunus persica）果皮中克隆了493 bp的查耳酮合酶（Chalcone Synthase,CHS）基因片段,利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）构建干扰载体TRV-LIC-CHSi,通过农杆菌渗入法沉默目的基因CHS的表达,从而研究CHS在桃果实花色苷代谢途径中的功能。干扰CHS基因的表达后,CHS的表达量降低88.8%,果皮中花青素糖苷含量下降87%,槲皮素糖苷含量下降35%,绿原酸含量升高57%,原花青素含量、儿茶素含量和山奈酚糖苷含量无显著变化。研究结果表明,沉默CHS基因,会使整个花色苷代谢途径转向绿原酸及其复合物方向。CHS基因调控着类黄酮类物质的代谢方向,是花色苷代谢途径中的重要基因。