蔗糖合成酶PavSS1调控甜樱桃果实成熟的功能分析

【目的】明确甜樱桃PavSS基因家族在果实成熟过程中的功能。【方法】利用qRT-PCR技术分析了7个蔗糖合成酶基因PavSS1～7在果实发育过程中的表达情况,并分析了蔗糖对PavSS家族基因表达的影响,利用甜樱桃果实的VIGS技术分析了PavSS1与PavSS6基因影响果实成熟的功能。【结果】PavSS1和PavSS2基因在甜樱桃果实发育和成熟过程中均表达,且PavSS1基因表达量是PavSS2基因的10倍以上;PavSS1和PavSS2在果实发育前期表达量逐渐升高,后期表达量逐渐降低。PavSS3和PavSS5基因在整个果实发育期均低表达,且表达量差异不显著。PavSS4和PavSS7基因在果实发育前期表达量高,后期表达量低。PavSS6基因在果实发育初期低表达,随后表达量逐渐升高,并维持较高水平。外施蔗糖显著下调了PavSS1和PavSS6基因的表达,而PavSS2、PavSS3、PavSS4、PavSS5和PavSS7基因的表达变化不显著。沉默甜樱桃果实PavSS1基因抑制了甜樱桃果实成熟,包括果实硬度、ABA含量、花色苷含量和可溶性糖含量发生显著变化以及成熟相关基因的表达量显著下调;而沉默PavSS6基因的甜樱桃果实与空载对照相比,没有显著变化。【结论】PavSS1基因可能是控制甜樱桃果实蔗糖代谢的关键基因,参与了甜樱桃果实成熟过程的调控。     

TRV介导欧洲甜樱桃果实VIGS体系的建立

【目的】建立欧洲甜樱桃果实VIGS体系。【方法】利用In-Fusion cloning技术,构建欧洲甜樱桃的烟草脆裂病毒(TRV)介导基因沉默表达载体pTRV2-ANS,转入农杆菌GV3101中,采用注射压迫法侵染欧洲甜樱桃果实,通过分子检测、qRT-PCR和表型观察技术评价TRV介导VIGS沉默体系的效果。【结果】TRV::ANS侵染的欧洲甜樱桃果实ans基因的表达显著低于TRV::00侵染的果实。与TRV::00比较,TRV::ANS侵染的欧洲甜樱桃果实的果皮和果肉颜色都没有发生着色,果皮和果肉颜色呈绿色,而TRV::00侵染的欧洲甜樱桃果实的果皮和果肉正常着色。【结论】研究建立的TRV介导欧洲甜樱桃VIGS体系可有效沉默欧洲甜樱桃果实内源基因表达。该体系为欧洲甜樱桃果实品质基因的功能验证及分子机制研究奠定了技术基础。     

‘仓方早生’桃及其早熟芽变果实蔗糖和苹果酸积累与相关基因表达

为揭示'仓方早生'桃及其早熟芽变果实生长发育过程中糖酸积累差异的分子机制,以'仓方早生'及其早熟芽变果实为试材,比较了二者不同发育时期果实中糖和有机酸含量的差异,并对其蔗糖及苹果酸代谢相关基因的表达差异进行分析,选出变化趋势明显的相关基因并进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证其表达情况。结果表明:'仓方早生'及其早熟芽变果实发育过程中,葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、柠檬酸、苹果酸和莽草酸含量的变化趋势基本一致,二者成熟果实中上述糖酸的含量差异不显著。花后59和71 d时,早熟芽变果实中蔗糖含量显著高于'仓方早生',苹果酸含量显著低于'仓方早生'。RNA-seq数据分析及相关性分析表明,'仓方早生'及其早熟芽变桃果实中蔗糖含量变化差异主要受PpSUS1、PpSPS1、PpINV2和PpTMT1-1表达影响,其中PpSUS1和PpTMT1-1表达量在果实发育过程中逐渐增加,与蔗糖含量变化趋势一致;PpSPS1表达量与蔗糖含量呈显著正相关。苹果酸含量变化差异主要受PpMDH1-2和PpNADP-ME1表达影响,PpMDH1-2的表达量在果实发育过程中逐渐下降,花后59和71 d时早熟芽变中PpMDH1-2表达量显著低于'仓方早生';PpPEPCK1和PpPEPCK2对苹果酸积累起辅助调控作用。     

丙烯和1–甲基环丙烯处理对采后柿果实XTH基因表达的影响

 为了进一步探索木葡聚糖内糖基转移/水解酶（XTH）在柿（Diospyros kaki L.）采后软化中的分子调控机制,应用实时荧光定量PCR 技术检测常温下丙烯和1–甲基环丙烯（1-MCP）处理的‘富平尖柿’果实中XTH 基因表达量的变化。结果显示,丙烯处理能够促进柿果实成熟软化,增加乙烯释放并使高峰提前到来,而1-MCP 处理能够延缓果实软化,抑制乙烯释放。随着柿果实成熟软化推进,4 个XTH 基因呈现不同的表达方式,且丙烯处理促进了4 个XTH 基因的表达,而1-MCP 处理则抑制它们的表达。其中,DkXTH1 和DkXTH2 在柿果实成熟软化过程中表达量较高,且二者表达高峰分别在果实成熟的初期和中期,说明DkXTH1 和DkXTH2 分别与采后柿果实初期和中后期的软化关系密切。结合乙烯释放量结果分析显示,柿果实XTH 基因的表达受乙烯调控,对柿果实的成熟软化中具有一定的促进作用。     

苹果果实质地软化过程中碳水化合物代谢及其关键酶基因表达的变化

以耐贮的富士苹果和不耐贮的金冠苹果果实为试材,研究果实发育和采后软化过程中糖和淀粉含量及其代谢相关酶活性变化,并分析其关键酶基因表达的变化。结果表明,淀粉含量和淀粉酶(AM)活性与果实硬度变化显著相关,且在富士和金冠果实间差异显著。随果实软化,金冠果实AM活性显著升高,而富士果实维持在较低水平,与金冠果实淀粉含量下降而富士淀粉含量低且稳定的变化规律相吻合;MdAM基因在金冠贮藏期的表达量迅速增加,显著高于富士。苹果果实蔗糖、果糖和葡萄糖含量均与成熟期果实硬度变化显著相关,贮藏期金冠果实蔗糖含量与硬度变化显著负相关,且SPS活性与硬度下降显著负相关,MdSPS基因大量表达,与此期SPS活性升高及蔗糖积累相一致。由此认为,淀粉降解参与了苹果果实软化,并与果实耐贮性关系密切,而且SPS在苹果果实蔗糖代谢和果实软化中起着重要作用,也与果实贮藏品质存在一定的相关性。     

番木瓜果实软化相关CpEXPA2基因的克隆与表达分析

【目的】克隆一个与番木瓜果实软化相关的扩展蛋白基因,分析其功能,明确其在不同组织器官和不同成熟时期果实的表达模式。【方法】基于对番木瓜果实转录组学的研究,筛选并克隆了一个与果实软化相关的扩展蛋白基因Cp EXPA2。采用同源序列对比和系统进化树分析对该基因进行序列分析;运用生物信息学的方法对该基因编码的蛋白进行结构分析;使用RT-q PCR方法分析Cp EXPA2基因在不同组织器官、不同成熟时期果实中的表达量;采用GY-4硬度计测定不同成熟时期番木瓜果实的硬度。【结果】Cp EXPA2基因的开放阅读框(ORF)为780 bp(Gene Bank登录号为MF662209),编码259个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列具有典型的扩展蛋白保守结构:N端富含8个半胱氨酸、C端富含4个色氨酸和中间1个组氨酸功能域(His-Phe-Asp,HFD)。同源序列比对分析发现该扩展蛋白与山木瓜(ABF48653.1)、番茄(AAC64201.1)、草莓(AAF21101.1)、拟南芥(AAB38073.1)等扩展蛋白氨基酸序列有较高的同源性,分别为66.15%、64.86%、66.80%、65.00%。进化树分析表明,Cp EXPA2蛋白与拟南芥At EXPA6(U30480)、At EXPA16(NM_115407)关系最近。Cp EXPA2在不同组织器官中的表达量依次为成熟果实叶花茎根;在不同发育时期的果实中,Cp EXPA2在果皮的表达量相对高于果肉,且随着果实成熟软化程度提高,其表达量也相应提高。番木瓜果实的硬度随着果实的成熟呈逐渐下降趋势,在破色期开始硬度急剧下降,果实迅速软化。【结论】Cp EXPA2基因的扩展蛋白家族高度保守,且该基因编码的蛋白与山木瓜、番茄、草莓、拟南芥等扩展蛋白的氨基酸序列有较高的同源性。系统进化树分析发现番木瓜Cp EXPA2与拟南芥At EXPA6和At EXPA16亲缘关系较近。Cp EXPA2受乙烯诱导,且与果实发育进程有关,因此推测该基因可能在番木瓜果实成熟软化过程中发挥着重要的作用。     

‘南果梨’及其芽变‘南红梨’果实中糖分积累与相关基因表达差异分析

【目的】对‘南果梨’及其芽变‘南红梨’果实发育期间的可溶性糖含量及糖代谢相关基因的表达量进行分析,探索‘南果梨’及‘南红梨’糖积累差异的分子机制。【方法】以‘南果梨’及‘南红梨’果实为试材,利用高效液相色谱对2者可溶性糖含量进行测定,qRT-PCR对蔗糖代谢关键基因中性转化酶(NI)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)及蔗糖合成酶(SS)的表达差异进行分析。【结果】‘南果梨’与‘南红梨’中的果糖含量均在果实发育后期(8月21日)达到最大值,而‘南果梨’与‘南红梨’果实中葡萄糖与山梨醇含量差异不明显。果实发育初期,2者蔗糖含量差异不明显,采收期(9月14日)‘南红梨’果实中蔗糖含量约为‘南果梨’果实的2倍。PuNI与PuSS3在‘南果梨’中的表达量显著高于‘南红梨’,而PuSPS1、PuSS1和PuSS2在‘南红梨’中的表达量则高于‘南果梨’。【结论】‘南果梨’及‘南红梨’果实发育过程中糖代谢相关基因的差异表达会导致不同糖分的积累量出现差异。     

苹果糖转运蛋白TMT基因的表达及其与糖积累的关系

利用苹果基因组筛选液泡膜单糖转运蛋白TMT 家族基因,通过qRT-PCR 探索它们在苹果各器官组织中的表达特性,并分析其表达与果实糖积累的关系。结果表明,在苹果中主要存在5 个TMT 家族基因,均含有11 个跨膜区,并具有1 个长约330 氨基酸的亲水loop 区位于胞质内,它们与拟南芥和葡萄的TMTs 高度同源。定量表达分析发现,它们均在苹果中表达,且MdTMT1 表达量相对最高,MdTMT3和MdTMT4 表达量较低。MdTMT1 在花和成熟果实中表达量最高,MdTMT2 在成熟果实中表达最高。在果实发育过程中,MdTMT1 和MdTMT2 的表达量与果实中总糖、还原性总糖、果糖、蔗糖含量呈极显著正相关,说明MdTMT1 和MdTMT2 可能参与了苹果果实成熟期果糖和蔗糖的积累。     

草莓果实发育过程中糖代谢相关基因的表达分析

 为了分析草莓（Fragaria × ananassa Duch.）果实发育过程中可溶性糖积累与相关基因表达量的关系,以‘杜克拉’草莓7个发育时期的果实为试材,利用实时荧光定量RT-PCR的方法,分析果实发育中蔗糖转运蛋白及糖代谢关键酶（酸性转化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶）4个基因的表达量以及可溶性糖含量的变化趋势。结果表明,蔗糖、葡萄糖和果糖含量随着果实发育都呈逐渐增加的趋势,尤其蔗糖积累与果实成熟的关系较密切。随着果实发育,蔗糖磷酸合成酶基因表达量呈逐渐增加的趋势,尤其在果实发育的后期增加较快;蔗糖合成酶和酸性转化酶基因表达量除了白熟期和转色期外,呈逐渐降低的趋势;蔗糖转运蛋白基因表达量呈先升后降,降后又升的变化趋势,尤其在白熟期前急剧增加。结合可溶性糖和基因变化趋势分析表明,蔗糖转运蛋白和蔗糖磷酸合成酶在草莓果实发育过程中发挥着重要的作用。     

梨果糖激酶基因PpyFRK5在果实蔗糖积累中的作用

以‘丰水’梨为试材,对果实果糖激酶基因Ppy FRK5进行克隆、表达分析和功能研究。结果表明,Ppy FRK5编码的蛋白属于磷酸果糖激酶B亚家族（pfk B）,具有高度保守的pfk B家族特征性结构域及果糖激酶特有的ATP结合域和糖结合域;Ppy FRK5在果实不同发育时期和不同器官中存在差异表达,在成熟的果实和种子中表达量最高;Ppy FRK5定位于质膜和细胞质中;在果实发育的整个过程中,Ppy FRK5的表达与蔗糖含量呈显著正相关,瞬时超表达Ppy FRK5的梨果实蔗糖含量显著升高,瞬时沉默Ppy FRK5的梨果实蔗糖含量显著降低;Ppy FRK5的启动子区域包含多个参与光响应、激素诱导以及胁迫响应的顺式作用元件。     

采后‘嘎拉'苹果果实糖和淀粉代谢及关键酶基因表达特性

以‘嘎拉’苹果为试材,研究了采后果实后熟软化过程中可溶性糖和淀粉含量、相关酶活性及关键酶基因表达的变化,分析了低温、乙烯因子(1-MCP、乙烯利)处理对它们的影响,探讨了糖和淀粉代谢与采后‘嘎拉’果实软化的关系。结果表明:‘嘎拉’果实软化的初始阶段,淀粉降解对果实软化的影响最显著,并伴随淀粉酶(AM)活性和MdAM基因表达的快速上升,且淀粉含量、AM活性及它们与硬度的相关性均显著受到低温和乙烯因子的调节,表明淀粉降解与‘嘎拉’果实软化关系密切。糖代谢中,蔗糖、果糖和葡萄糖含量变化与果实软化表现显著的相关性,均受到低温和乙烯因子的调节,但仅有蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性与果实硬度的变化显著相关。随着果实软化SPS活性和MdSPS基因的表达量不断增加,并显著受乙烯利的促进,受低温与1-MCP的抑制,其活性及其与硬度间的相关性也受到同样的影响,表明蔗糖代谢参与了‘嘎拉’果实的后熟软化,SPS在蔗糖代谢中起重要作用。     

正常成熟与不成熟西瓜果实中ACS、ACO基因表达及乙烯产生的动态比较

<正>目的与意义:乙烯对非呼吸跃变型果实的成熟调控机制尚不明确。西瓜果实属于非呼吸跃变型果实,据报道称,外源乙烯处理会导致西瓜果实软化加速和水脱。以呼吸跃变型果实番茄为对照,拟测定西瓜果实乙烯的释放量和组织乙烯(CIE)含量,分析乙烯合成酶基因ACS和ACO基因在不同类型西瓜果实成熟过程中表达量变化,希望能解     

利用VIGS技术研究草莓FaMYB5的功能

以‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonaka’)为材料,采用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)对果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子基因FaMYB5进行沉默,并对沉默后果实类黄酮化合物代谢途径相关的结构基因和其他转录因子基因表达量进行半定量RT-PCR及RT-qPCR分析。并分别采用HPLC和香草醛—硫酸比色法对沉默后果实中花青素苷和原花青素含量进行测定。成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS沉默载体,并建立了草莓果实VIGS沉默体系,FaMYB5基因沉默效率达60%;FaMYB5基因沉默处理与阴性对照相比,草莓类黄酮化合物代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FaMYB9、FaLAR、FaDFR、FaANR表达量显著增加,从而导致果实中原花青素含量增加;而花青素合成相关基因FaANS的表达量减少1/2,FaMYB10表达量变化并不显著。此外,bHLH家族的转录因子基因FabHLH3和FabHLH3Δ随着FaMYB5的沉默表达量显著下降,而FaGL3显著升高。结果进一步证明FaMYB5转录因子对草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径起负调控作用。     

甜樱桃PavMYB10.1促进PavRiant表达和花青苷积累

为了解谷胱甘肽S–转移酶（GST）参与甜樱桃花青苷积累的机制,以甜樱桃‘美早’为试材,克隆1个phi类型GST基因PavRiant(XM＿021968160)。通过系统进化树分析、qRT-PCR、瞬时表达沉默、酵母单杂交、电泳迁移率试验和荧光素酶报告试验,探究PavRiant调控甜樱桃花青苷积累的作用。系统进化树分析表明,PavRiant与桃PpRiant蛋白序列相似度最高。果实发育期,PavRiant表达量与花青苷含量和花青苷调控基因PavMYB10.1表达量变化趋势一致。瞬时沉默试验证实PavRiant在甜樱桃花青苷积累调控中发挥重要作用。酵母单杂交和EMSA试验发现,PavMYB10.1结合PavRiant启动子的MRE序列。荧光素酶试验表明PavRiant启动子活性受PavMYB10.1正调控。因此,PavMYB10.1可能通过促进PavRiant的表达促进花青苷的积累。     

基于转录组研究光质对转色期红地球葡萄果实着色及品质的影响

[目的]探讨不同光质对设施红地球葡萄果实着色及品质的影响,并从中挖掘出关键的光调控基因.[方法]以8年生红地球葡萄为试验材料,采用4种不同光质(红蓝光2∶1、蓝光、红光、白光)补光处理设施红地球葡萄,以不补光为对照,对果实中花青素、还原糖、可滴定酸和可溶性固形物含量进行测定,并对果皮进行转录组测序.[结果]不同光质处理下果实中花青素、还原糖和可溶性固形物含量均高于对照,其中在蓝光处理下最高.利用FPKM计算基因表达量,以差异表达倍数| log2fold changes|≥1,P-adjust＜0.05为筛选条件,共获得1313个差异表达基因,包括上调基因728个,下调基因585个,其中红蓝光、蓝光、红光、白光处理与对照之间的差异基因数目分别为638、434、375和320个.GO分析发现差异基因与代谢过程、细胞过程、膜、催化活性、结合等条目密切相关.KEGG分析发现不同光质通过调控葡萄光合作用、类黄酮生物合成、淀粉和蔗糖代谢等相关基因表达进而影响葡萄果实着色及品质.根据富集结果选取9个差异表达基因,经qRT-PCR验证,基因表达趋势与转录组测序结果一致.[结论]不同光质补光均能改善葡萄果实的着色及品质,其中以蓝光的效果最为明显;葡萄果实中类黄酮基因CHS、F3H及淀粉和蔗糖代谢基因INV、SPS、HK和BG的差异表达,是导致各处理葡萄果实着色及品质差异的重要原因.     

‘南果梨’果实发育过程中糖分积累与相关基因表达分析

【目的】探讨‘南果梨’果实发育过程中糖分变化与糖代谢相关基因表达之间的关系。【方法】以‘南果梨’不同发育时期的果实为试材,测定了其中果糖、葡萄糖、山梨醇和蔗糖的含量并分析了与糖代谢相关基因的表达。【结果】在果实幼果期山梨醇为主要糖,而在中后期则为果糖。蔗糖合成酶Pu SS1在花后60 d表达量最大,而Pu SS2在花后60、120及134 d表达量相对较高;蔗糖磷酸合成酶Pu SPS1在花后120 d的表达量最大,而Pu SPS2在花后60 d表达量最大;蔗糖转运蛋白Pu SUT及β-葡萄糖甘酶Pu BGLU1、Pu BGLU2和Pu BGLU4在果实发育的早期大量表达;碱性/中性转化酶Pu NINV1和Pu NINV2在花后134 d大量表达。【结论】各糖分在果实发育过程中变化规律不同,可能与糖代谢相关基因的差异表达有关。     

FaASR基因超表达促进草莓果实着色

以‘甜查理’草莓为试材,在克隆草莓ASR同源基因的基础上,对草莓中FaASR基因进行生物信息学、时空表达分析,通过调控草莓果实中ASR基因表达水平,分析果实的着色、蔗糖、ABA、色素和果实硬度等生理指标的变化,以及与色素代谢相关基因CHS、UFGT的表达水平,揭示ASR基因调控草莓果实成熟的机制。草莓ASR含有一个典型的与果实成熟和抗逆有关的ABA/WDS区域,ASR基因过量表达可以促进草莓果实提前上色,促进果实内源ABA积累、蔗糖含量增加和果实变软,并且促进与果实花色苷积累相关的关键基因CHS和UFGT的转录水平。该研究有助于深入揭示果实发育信息传递的分子机制,也为今后草莓的分子改良育种奠定重要的基础。     

乙酰水杨酸调控猕猴桃果实后熟软化进程中的Ad-EXP1基因表达

以布鲁诺猕猴桃(Actinidia deliciosa cv.Bruno)成熟果实为材料,根据植物α-expansin(EXP)基因的氨基酸保守序列设计简并引物,利用RT-PCR方法结合3’RACE扩增得到1个长为957bp的cDNA片段(Ad-EXP1)。该基因片段编码211个氨基酸,与其它植物该基因核苷酸同源性为59%～85%,氨基酸同源性为73%～91%。Northern杂交结果表明,Ad-EXP1基因在采收当天的果实中表达很弱,随着果实成熟衰老进程加快趋于增强;乙酰水杨酸(ASA)处理延缓果实后熟软化和乙烯生成,也显著抑制Ad-EXP1基因表达。鉴于Ad-EXP1表达丰度与乙烯生成、果实软化程度的一致性,推测该基因在猕猴桃果实后熟软化进程中起着重要作用。     

纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶与果实成熟

对果实成熟软化过程中组织超微结构变化以及Cx和PG对果实成熟软化的作用,Cx、PG在分子水平上的研究和尚待进一步研究的问题进行了系统综述:果实成熟软化与Cx、PG活性增强直接相关,PG在果实成熟软化过程中对果实着色也有着一定影响;编码Cx的基因已经在某些果实的cDNA文库中被鉴定;利用反义RNA技术对PG进行负调控是研究PG对果实成熟软化作用的主要手段。目前对Cx、PG在果实成熟过程中的作用研究主要集中在呼吸跃变型果实上,而在非呼吸跃变果实中的作用很可能有所不同。因此,研究Cx、PG在柑橘等非呼吸跃变果实成熟过程中的作用将是尚待研究的又一重要方向。     

裂果性不同的番荔枝品种果皮中细胞壁代谢相关基因的表达分析

【目的】探讨细胞壁代谢相关基因在裂果品种(AP番荔枝)和不裂果品种(PO番荔枝)采后贮藏期间的表达差异。【方法】对番荔枝2个品种采后后熟不同阶段以及对AP番荔枝进行喷施乙烯利处理后对果皮进行取样,测定果实硬度和可溶性固形物含量,利用实时荧光定量PCR技术检测8个细胞壁代谢相关基因在2个品种室温贮藏期间和乙烯利处理后,基因在不同阶段的表达变化,并应用CLUSTER软件对基因的差异表达进行双向层次聚类分析。【结果】AP番荔枝和PO番荔枝采后后熟期间的可溶性固形物含量和硬度值变化基本一致,2者之间无明显差异,而乙烯利处理能加速AP番荔枝的成熟与开裂。定量PCR分析表明,贮藏期间8个基因在PO番荔枝中的表达量均低于AP番荔枝,其中PPO在PO番荔枝中无表达,EXP2、EXP3和PE在PO番荔枝贮藏期前3 d表达量很低。EXP1在2个番荔枝品种贮藏期间一直处于高水平表达,但不受外源乙烯诱导,而EXP2、EXP3、XET1、XET3、PE和PPO均不同程度受到乙烯诱导。大多数基因在第1天,果实开裂前表达量已增加,随着裂果的加重表达量下降。聚类分析表明在PO番荔枝后熟过程中发生剧烈变化的有EXP1、EXP2、EXP3和PE基因,在AP-正常和AP-乙烯裂果前后表达量变化比较剧烈的基因基本一致,包括EXP1、EXP2、EXP3、PPO和PE。【结论】EXP1更多和果实成熟软化有关。EXP2、EXP3、PE和PPO与裂果关系较为密切,而XET1、XET2和XET3可能与果实成熟软化有一定关系,但不是果实开裂的关键基因。