马铃薯抗晚疫病主效基因R10的RGA-CAPS标记的开发

马铃薯晚疫病抗性基因R10,属于马铃薯抗晚疫病主效位点MLB单倍型之一,该位点已知的各单倍型基因均具有保守结构域,属于同一个R3a基因家族。将R3a基因和源于MLB位点的R3a基因的同源序列进行比对,根据它们高度保守的区域设计引物,以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10（含抗晚疫病基因R10）、四倍体马铃薯栽培种Katahdin（不含已知抗病基因）及其杂交一代为试材,得到R3a的抗病基因同源序列,再结合限制性内切酶筛选,开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记：RGA-600和RGA-1000,这两个标记距离R10基因0.25cM。     

马铃薯花青素转录激活基因stwd40的克隆与表达分析

根据GenBank中报道的茄属植物矮牵牛花青素wd40类转录激活基因an11及番茄wd40基因113964R的mRNA序列的保守区结构,设计简并引物,从紫色马铃薯皮中克隆了马铃薯wd40类转录激活基因的保守片段,再分别利用RACE技术获得了该基因的3'端和5'端。序列分析表明,该基因核苷酸序列为1292bp,具有完整的编码框,推导其编码362个氨基酸,命名为stwd40。推测的氨基酸序列与GenBank数据库中大量物种的花青素转录激活蛋白stwd40有较高的同源性,其中与矮牵牛的花青素转录调控基因an11的相似性达86%。RT-PCR表达分析显示stwd40在紫色马铃薯叶、茎、皮、肉及根中都有表达,其中在茎中的表达量最高,肉中表达量最低,且在白色马铃薯的叶、皮和肉中也有表达,推测该基因为组成型表达。     

马铃薯抗晚疫病基因R3a、R1和RB在番茄中的表达

 晚疫病由疫霉菌( Phytophthora infestans) 引起, 主要侵染番茄和马铃薯等茄科作物, 造成巨大的经济损失。马铃薯已有5个抗晚疫病基因被克隆。为了研究已克隆的马铃薯抗晚疫病基因是否在番茄中起作用, 将马铃薯的抗晚疫病基因R3a、R1和RB 通过农杆菌介导法分别导入番茄品种Moneymaker中。筛选得到的再生植株经PCR检测结果表明, 目的基因已整合入番茄基因组; 转基因番茄离体叶片接种验证结果表明, 接种马铃薯晚疫病菌株8914829 (即小种0) , 转基因番茄产生了抗病的过敏反应(HR反应) 。为了验证转基因番茄是否对番茄晚疫病菌株产生抗性, 用番茄晚疫病的主流小种和强致病力菌株共5个菌株接种转基因番茄植株, 结果表明转R3a和R1 基因的番茄对部分番茄晚疫病菌株能够产生抗性, RB转基因植株叶片对5个番茄晚疫病菌株均产生抗性。该研究为番茄抗晚疫病的基因工程育种开辟了新的途径。     

西瓜NBS类同源序列的克隆与分析(摘要)

R基因产物是植物抵抗病原物侵害的重要组成部分,在目前已经发现的植物抗病基因中,NBSLRR类占了绝大多数,在植物抗病基因中占有重要地位。NBS结构域是NBS-LRR基因编码蛋白中最保守的部分,含有8个保守基序,包括P-loop(又称Kinase-1a)、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL疏水结构域等。对西瓜NBS的克隆和分析将有助于筛选西瓜抗病基因及各种抗病基因的分子标记,而且通过对西瓜NBS的结构、表达和调控的研究,将有助于深入阐释西瓜的抗病机制。以根结线虫抗病西瓜材料‘红籽瓜’和感病西瓜材料‘ZDPI0006’为试材,根据西瓜NBS保守区设计简并引物及特异引物50对,根据葫芦科抗病基因序列在西瓜基因组数据库搜索同源序列,并以此设计特异引物1对,分别提取西瓜叶片g DNA和RNA并反转录成c DNA,采用PCR扩增西瓜抗病基因同源序列,琼脂糖电泳检测回收目标条带,克隆测序后结果提交到Gene Bank进行序列比对,提交至Pfam在线分析蛋白质功能,利用Clustalx与其他物种的抗病基因进行同源性分析,利用dnasp等软件进行序列多态性分析。结果表明,49对引物中共有43对引物在抗、感材料中成功扩增到目的片段,其中有4对引物在抗感材料中扩增出差异片段,简并引物W856在抗、感材料间扩增到一条约750bp的差异片段,测序结果提交至NCBI比对显示其与预测的黄瓜抗TMV的N端类似蛋白存在88%的同源性,根据葫芦科抗病基因在西瓜基因组数据库搜索同源序列设计的特异引物W6580在抗、感材料间扩增出大小一致的约800bp的片段,测序结果提交至NCBI比对,结果显示其与预测的黄瓜抗线虫类似蛋白存在90%的同源性,dnasp软件分析显示抗、感材料之间存在4个单核苷酸多态性位点。     

马铃薯抗晚疫病基因R8、RB和抗病毒病基因Rx1、Ryadg的多重PCR检测

在218份马铃薯材料中筛查晚疫病持久抗性基因RB和R8标记的基础上,进一步筛查了马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)极端抗性基因Rx1和Ry_adg的标记。利用筛查出的含有Rx1和RB标记的‘德薯3号’和含有Ry_adg和R8标记的P182马铃薯资源材料混合DNA为模板,选择已报道的Rx1和Ry_adg的标记引物,并根据RB和R8序列设计特异引物,同时设计马铃薯GBSS基因特异引物为内参监控PCR反应体系有效扩增,对多重PCR延伸温度、引物组合浓度等进行优化,建立了同时检测4个抗病基因的多重PCR方法。应用该方法对选育品系样品进行筛查,鉴定到聚合上述4个抗性基因的材料4份。本研究中建立的多重PCR检测体系用于分子标记辅助选择,为马铃薯晚疫病和病毒病多抗基因聚合育种提供了简单、高效的技术方法并为多抗性基因聚合新品种选育创制新资源。     

马铃薯抗晚疫病基因RB、R3a过表达及R3a特异性识别关键结构域的确定

 通过将马铃薯抗晚疫病基因RB、R3a编码区克隆到具有组成型CaMV35S强启动子的双元表达载体上,结合农杆菌介导的瞬时表达,分析过表达条件下RB-AvrB,R3a-Avr3a的特异性识别情况。并利用重叠延伸PCR实现R3a与同源序列I2GA1在卷曲螺旋（CC）、核酸结合位点（NBS）和富含亮氨酸重复序列（LRR）三个结构域的互换,根据过敏性反应（hypersensitive response,HR）是否被阻断分析各个结构域对特异性识别的影响,确定特异性识别的关键结构域。结果表明：CaMV35S启动子驱动的RB基因在表达量上较自身启动子有明显提高,使HR反应加快; R3a的表达量和特异性识别Avr3a诱导产生HR反应的速度在两者之间均无明显差别。另外,R3a与I2GA1在LRR区域序列发生交换后,识别Avr3a诱导产生HR反应的能力也发生了交换,即R3a特异性识别Avr3a的关键序列位于LRR结构域内。     

利用VIGS技术研究马铃薯抗晚疫病基因R3a和RB的信号传导

 利用VIGS技术，在烟草中沉默已知的抗病信号传导关键基因SIPK、NDR1、SGT1、HSP90、NPR1、Rar1、EDS1、WRKY1，再瞬时表达马铃薯抗病基因和其相应的无毒基因RB-Avrblb1和R3a-Avr3a，根据过敏反应（Hypersensitive Response，HR）反应是否被阻断来研究RB和R3a介导的抗病信号传导。结果发现SGT1和HSP90基因沉默阻断了HR反应的发生，表明SGT1和HSP90是参与RB和R3a抗病信号传导途径过程中的关键基因。该技术体系的建立，为以后发现新的晚疫病抗病相关基因的功能验证提供了一个高效的技术平台。     

辣椒抗根结线虫相关WRKY基因的分离

为了确定抗性基因Me3介导表达的抗根结线虫相关WRKY基因的种类及其表达特点,以含Me3基因的辣椒HDA149品种为材料,接种南方根结线虫二龄幼虫,通过同源克隆法获得辣椒4个WRKY新基因片段。利用RT-PCR技术克隆了WRKY-a、WRKY-b、WRKY-c、CaWRKY1、WRKY1和CaWRKY2等 6个WRKY基因的全长cDNA。研究表明,WRKY-a、CaWRKY2基因是受根结线虫诱导表达的;CaWRKY1基因的表达具有组织特异性,在根、叶中表达,在茎中不表达。聚类分析表明WRKY-a、WRKY-c、CaWRKY2蛋白属于第Ⅰ组WRKY蛋白,WRKY-b、CaWRKY1属于第Ⅱc亚组,WRKY1属于第Ⅱa亚组。     

利用多重PCR反应同时鉴定番茄Ty-3a基因和抗溃疡病QTL

番茄黄化曲叶病毒病和番茄溃疡病是两种分布广泛、危害严重的世界性病害,严重影响了番茄的产量,是国内外番茄抗病育种的重要目标。为了提高抗病育种的效率,研究建立了抗番茄黄化曲叶病毒病Ty-3a基因和抗番茄溃疡病QTL的多重PCR反应体系。该体系利用同一PCR反应,对分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-3a基因和抗番茄溃疡病的一个QTL位点Rcm5.1紧密连锁的标记进行了扩增、筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Ty-3a基因紧密连锁的标记Ty-3F/Ty-3R为共显性标记,基因型为Ty-3a/Ty-3a的材料均产生630 bp的特异性片段,基因型为ty-3/ty-3的材料均产生320 bp的特异性条带,基因型为Ty-3a/ty-3的材料产生630 bp和320 bp的特异性片段;与番茄溃疡病QTL位点Rcm5.1连锁的标记TG318F/TG318R为显性标记,只有抗病材料产生580 bp的特异性片段,感病材料不产生特异性条带。经反复验证结果准确、稳定,可用于同一PCR反应体系中对番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-3a基因和番茄溃疡病QTL的同时筛选鉴定。     

几个抗疫病性不同的辣椒材料抗病基因同源序列的分离与比较

 根据已克隆抗病基因的保守序列设计简并引物, 对9 个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组DNA 进行抗病基因同源性序列的特异PCR 扩增, 经序列测定和同源性分析发现14 个抗病基因同源性序列(RGAs) 与辣椒抗疫病作用相关, 其中B 引物扩增的8 个RGAs 与烟草抗花叶病基因N 、拟南芥抗丁香假单菌基因RPS2 和亚麻抗锈病基因L6 的同源性较高, 属于广谱(细菌、病毒、真菌) 抗病基因同源序列; C 引物扩增的6 个RGAs 与番茄抗叶霉病基因Cf2 和Cf9 有较高的同源性, 与抗疫病作用密切相关。研究还发现, 高感疫病的辣椒基因组中也存在抗疫病相关RGAs , 这与已报道的辣椒抗疫病微效QTLs 位点则来于感病亲本基因组的研究结论一致。     

接头连接介导的PCR 扩增马铃薯抗晚疫病基因侧翼序列研究

利用接头连接介导的PCR 技术，以前期NBS profiling 试验获得的1 条马铃薯抗晚疫病基因
片段为基础，设计巢式基因特异性引物，扩增获得两侧序列。结果表明：基因组DNA 经DraⅠ酶切后，
在已有536 bp 片段的左侧和右侧均得到序列延伸，右侧扩增得到2 301 bp，左侧扩增得到820 bp，去除
边界序列后，向左延伸789 bp，向右延伸2 273 bp，拼接后共长3 443 bp。采用GENSCAN 进行基因预测，
发现包含内含子在内的晚疫病抗性基因全长2 413 bp，在该预测基因 的UTR 区域设计特异性引物，在马
铃薯抗病和感病的基因型中扩增包含完整基因在内的2 571 bp 序列，发现该特异候选基因与晚疫病抗性相
连锁。     

马铃薯转萝卜抗菌肽基因植株的获得及其抗晚疫病的初步鉴定

为获得抗晚疫病的转基因马铃薯植株,采用根癌农杆菌介导法,以微型薯薯片为外植体,将萝卜抗菌肽基因（AFP）导入马铃薯栽培品种夏波蒂（Shepody）中,通过草甘膦抗性筛选和PCR检测获得了4株转基因试管苗,并经黑暗诱导获得了微型薯。采用离体叶片接种法,对微型薯长出的叶片进行抗晚疫病鉴定,结果表明这4个株系的抗病性均有一定程度的提高。     

马铃薯栽培品种‘合作88’细菌人工染色体文库的构建与评价

以四倍体马铃薯栽培品种‘合作88’培养12 ~ 15 d苗龄的幼嫩叶片为试材,提取高分子量基因组DNA,利用限制性内切酶HindⅢ部分酶切后回收100 ~ 300 kb片段,连接到载体CopyControlTM pCC1BACTM的HindⅢ位点上,构建了细菌人工染色体（BAC）文库。该文库约由850 000个克隆组成,空载率约2.08%,保存在1 700个混合池中,克隆插入片段平均大小约为90 kb,覆盖单倍型马铃薯基因组约85倍。随机挑取6个BAC克隆连续培养5 d,提取DNA进行HindⅢ完全酶切检测,确认不同培养时间的BAC克隆的指纹图谱完全一致,表明文库较好的稳定性。BAC文库的构建为马铃薯重要农艺性状基因克隆、基因组测序以及比较基因组研究等奠定了基础。     

10种杀菌剂对马铃薯晚疫病的防治效果与经济效益评价

选择72%霜脲·锰锌(克露)可湿性粉剂(WP)、50%烯酰吗啉(安克)WP、25%嘧菌酯(阿米西达)悬浮剂(SC)、64%恶霜·锰锌(杀毒矾)WP、68%精甲霜灵·锰锌(金雷)水分散粒剂(WG)、70%丙森锌(安泰生)WP、68.75%氟吡菌胺·霜霉威(银法利)SC、18.7%烯酰·吡唑酯(凯特)WG、25%双炔酰菌胺(瑞凡)SC和50%多菌灵WP等10种药剂进行了田间马铃薯晚疫病防治试验。结果表明:除50%多菌灵WP之外,其他9种药剂对马铃薯晚疫病均具有明显的防治效果和增产效果,防效均达90%以上,增产10.90%～20.30%,净收入增加500～1000元·(667m2)-1。根据药剂的防效和增产效果,提出广东省马铃薯晚疫病防治的参考药剂,首先是72%霜脲·锰锌WP和50%烯酰吗啉WP,其次是68%精甲霜灵·锰锌WG、18.7%烯酰·吡唑酯WG、25%嘧菌酯SC、70%丙森锌WP和64%恶霜·锰锌WP。     

马铃薯晚疫病水平抗性的QTL标记评价

 以11个马铃薯晚疫病水平抗性杂交组合后代的636个基因型为材料, 对4个与晚疫病( Phytophthora infestans) 水平抗性相关位于不同染色体的QTL位点标记GP179、GP76、prp1和GP125进行了评价。结果显示: 4个QTL位点标记共有6个特征带, 在不同遗传背景的组合中带型分布存在差异; 田间抗病性与4个标记的总带数呈极显著直线相关; 主要成分分析表明, p rp1570位点标记解释了供试材料35%的抗性表型变异, 为主效QTL。结合抗性表型分析, 组合群体的抗性与QTL位点数有关, 而个体的抗病水平与主效QTL有关。     

农杆菌介导P2300-pa-8e抗虫基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种早大白和克新18号微型薯为外植体,利用根癌农杆菌介导法,将来源于Bt菌株Bt185的P2300-pa-8e抗虫基因转入马铃薯,并对其遗传转化的影响因素进行研究。获得抗性植株早大白19株、克新18号21株|经PCR检测,5株早大白、9株克新18号呈阳性|经Southern-blot杂交分析,4株早大白、6株克新18号呈阳性,证明P2300-pa-8e基因已整合到马铃薯基因组中。在网室内对转基因植株进行抗虫试验,转基因材料对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟幼虫表现出抗性。     

根癌农杆菌介导BDN1 基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种东农303 微型薯为试验材料,通过根癌农杆菌介导法,将来自耐旱植物厚 叶旋
蒴苣苔的脱水蛋白基因BDN1 导入马铃 薯,并对其遗传转化的影响因素进行了研究。获得了抗性再生植株
35 株 ;PCR 检测27 株呈阳性;Southern-blot 检测4 株呈阳性,表明BDN1 基因已整合到马铃薯基因组中;
半定量RT-PCR 检测结果表明BDN1 基因在马铃薯抗性植株中表 达。通过对相对含水量、脯氨酸、丙二醛
含量和SOD 活性测定,证明4 个转基因株系对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。