海南疣粒野生稻乙烯受体的保守序列分析

本研究用自行设计的乙烯受体(ERS)保守引物从海南疣粒野生稻基因组DNA中克隆获得长度为1454bp的乙烯受体基因片段，推测该片段由2个内含子和3个外显子组成，外显子总长为974bp，编码324个氨基酸。与栽培稻(O.sativa)乙烯受体基因基因组DNA(os DNA)可比对序列的相似性达81．84％，推导出其mRNA与栽培稻的乙烯受体基因cDNA(OsERS)相应片段的同源性高达95．59％，而与栽培稻(Oryza sativa subsp Indica)ERS2相应片段的同源性为71．05％。     

棉花叶绿体基因组的研究进展

近年来,随着分子生物学技术的应用与发展,对棉花叶绿体基因组也有了新认识。本文概述了棉花叶绿体基因组的研究进展,从棉花叶绿体基因组的图谱、功能基因的克隆及研究、叶绿体RNA编辑以及叶绿体转化等方面进行了介绍和评述,并对其在基础研究与应用研究中的前景进行了展望。     

千代田草莓乙烯受体Etr2基因克隆及序列分析

克隆了与草莓成熟有关的乙稀受体FaEtr2基因片段,为进一步研究FaEtr2基因功能并通过基因技术改善草莓贮运性能奠定基础。以千代田草莓成熟果实中分离到的基因组DNA为模板,经PCR扩增到1条约1．0kb的特异片段,将该片段克隆到pGEM-T easy vector上经测序分析,基全长共1049bp,编号349个氨基酸残基。序列分析结果表明,该序列与Chandler-Etr2的cDNA序列同源性99％、氨基酸序列同源性为98％。     

菊苣叶绿体同源片段的克隆及多顺反子定点整合表达载体的构建

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计合成引物,从菊苣叶绿体基因组中扩增包括rps7-rps12-trnV-16S rDNA基因在内的一段序列(GenBank登录号为GQ199478),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以叶绿体基因强启动子prrn驱动选择标记基因aadA及报告基因gfp构建多顺反子表达盒prrn-aadA-gfp-psbA-3,′然后将表达盒克隆进菊苣叶绿体同源片段中,获得菊苣叶绿体定点整合表达载体pJAG,酶切分析证明所构建的载体符合预期设计。该载体的构建为建立菊苣的叶绿体转化体系奠定基础,为进一步通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良,或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台。     

构建结球甘蓝KIN基因在叶绿体基因组定点表达的载体

获得叶绿体基因组定点整合表达载体是开展结球甘蓝叶绿体基因组的遗传转化研究的第一步。本研究克隆了CMS结球甘蓝的抗冻蛋白KIN基因,发现该基因定位于结球甘蓝的2号染色体上。通过构建中间载体p KA和p AI,将KIN基因的编码区构建到了CMS结球甘蓝叶绿体基因组定点整合表达载体p IKAA中。该载体以Trn A和Trn I基因片段作为同源整合片段,能整合到CMS结球甘蓝叶绿体基因组中。此外,该载体是双顺反子形式的,即在转录的单条m RNA上,同时包含了KIN和aad A基因编码区。将p IKAA转化到大肠杆菌中,结果显示转化有该载体的大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素(AMP)和壮观霉素(SPEC)的固体LB平板中生长。研究结果可为后期CMS结球甘蓝叶绿体基因组的遗传转化体系的建立奠定基础。     

拟南芥逆境胁迫诱导表达基因rd29A启动子的克隆与序列分析

以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到逆境胁迫诱导表达基因rd29A的启动子片段,将其克隆到pUC19质粒中进行序列分析。结果表明,获得的启动子片段大小为937bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸序列同源性为99．8％。     

番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段（psbD/trnG）,命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性, 与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3’,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3’-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western Blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。     

棉花高质量RNA的提取及MADS-box基因保守区段的克隆

研究和探讨了一种可用于高质量棉花总RNA提取的热硼酸法,并用于棉花MADS box基因的RT PCR分析,结果表明,该方法制备的RNA质量较高,克隆得到的基因片段序列与已知MADS box基因序列之间具有较高同源性。     

SDS-蛋白酶法分离棉花cpDNA及psbA基因启动子、终止子克隆

采用SDS-蛋白酶法提取了棉花的叶绿体DNA.琼脂糖电泳及紫外分光光度分析表明,所提取的叶绿体DNA质量高.用所提取的叶绿体DNA作为模板进行RAPD扩增,获得了清晰的扩增图谱.同时以所提取的叶绿体DNA作为模板,以psbA基因启动子、终止子序列设计引物,成功地扩增出预期为312 bp和382 bp的目标片段.将目标片段克隆测序,经Blantn分析,结果表明上述片段正是psbA基因启动子、终止子序列.该方法与传统的提取方法相比省时、高效、无污染,为进一步开展棉花叶绿体基因工程奠定了良好基础.     

甜菜叶绿体rbcL基因的克隆与序列分析

rbcL基因编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶,在光合作用和光呼吸中均起重要作用。利用植物叶绿体基因组在进化中高度保守的特点,根据烟草、水稻和菠菜叶绿体基因组全序列设计合成引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增了包含甜菜rbcL完整基因(GeneBank登录号为DQ067450)在内的一段序列,序列分析表明:该片段全长2023bp,其中包括1425bp的编码区序列,推测编码475个氨基酸。同源性比较显示,该基因编码区序列与烟草、菠菜、油菜、豌豆、水稻、玉米、矮牵牛、苜蓿、地钱、葡萄、猪毛菜及松树的rbcL基因核苷酸同源性为77.38%~96.45%,氨基酸同源性为85.53%~98.11%。因此,可以确定所克隆的基因为甜菜叶绿体rbcL基因。     

水稻巯基蛋白酶抑制剂基因在烟草叶绿体中的表达

将水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) cDNA基因克隆、测序分析后,与烟草(Nicotiana tabacum L.)叶绿体16S rDNA基因启动子和T393终止子构建表达盒,与抗壮观霉素选择标记基因aadA表达盒相连,以烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和ORF512一起构建成叶绿体转化载体pZOC.通过基因枪轰击烟草幼苗叶片,壮观霉素筛选,获得转化再生     

温敏核不育系株1S籼粳属性研究

温敏核不育系株1S是生产上广泛应用的水稻优良早籼型不育系品种。以典型籼稻和粳稻为对照,采用ISSR、SRAP和TRAP三种分子标记方法对株1S核DNA进行分子遗传学分析,结果表明,株1S核DNA以籼型基因为主,但含有部分粳型特异性片段,具有一定的粳型血缘;3种分子标记方法都能建立株1S所特有的分子指纹。对株1S叶绿体DNA中ORF100、ORF29-TrnC^GCA、TrnT^UGU–TrnL^UAA、rps16基因内含子等序列分析表明,株1S为籼型叶绿体,对照材料培矮64S、准S为粳型叶绿体;株1S在TrnT^UGU–TrnL^UAA片段中存在两个特异碱基。利用籼型细胞质和含有适量粳稻血缘的两用核不育系可能是长江中下游双季稻区高产稳产早稻组合的育种途径。     

马铃薯卷叶病毒(PLRV)内蒙古分离物基因间隔区(IS)的克隆与序列分析

根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保守,而且在PLRV的全基因组序列中也是相对保守的。研究结果预示,将IS构建成RNA干扰型结构导入马铃薯,将有可能获得抗PLRV多种株系且抗性更高的转基因植株。     

雷蒙德氏棉叶绿体基因组Fosmid文库构建

 采用高盐、低pH值法提取雷蒙德氏棉叶绿体DNA;通过物理剪切法获得随机断裂的DNA片段;剪切片段末端、补平修饰后与pCC1FOS载体连接;用噬菌体包装蛋白包装重组DNA,侵染大肠杆菌EPI300,构建了雷蒙德氏棉叶绿体基因组文库。对于叶绿体DNA剪切,以1 mL注射器中等速度吸打18次为最佳参数。叶绿体基因组Fosmid文库滴度为1×10⁴ cfu·mL^-1,插入片段大小平均为38 kb,最终筛选出39个克隆用于后续研究,覆盖叶绿体基因组9.2倍。以叶绿体特异标记筛选出能够覆盖雷蒙德氏棉叶绿体全基因组的6个克隆：F66,F46,F28,F8,F55和F3,为基因组结构和功能基因分析提供了良好的基础。     

phaG和phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。羟酰-CoA-ACP-转移酶和II型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的两个关键酶。将编码羟酰-CoA-ACP-转移酶的基因phaG与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子连接构建表达盒RpsbA-pro-phaG-RpsbA-ter,将II型PHA合酶的基因phaC与水稻叶绿体16S rRNA基因的强启动子Prrn及rbcL基因的终止子连接构建表达盒prrn-phaC-RrbcL-ter,连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD之间,得到烟草叶绿体表达载体pTGC。用包裹有质粒pTGC的金粉子弹轰击烟草无菌苗叶片,经壮观霉素筛选后获得6株叶绿体型转基因植株。对T₀代和T₁代转基因植株进行PCR检测和Southern blot分析表明,外源基因已整合进烟草叶绿体基因组中,且T₁代转基因植株已同质化。RT-PCR分析结果证实外源基因已在转录水平上表达。转基因植株的自交及正反交结果表明,外源基因在转基因后代中能够稳定遗传,遗传方式遵循母性遗传规律,不存在转基因的花粉漂移现象。     

水稻26kDa球蛋白基因启动子克隆及序列分析

以水稻品种日本晴基因组总DNA为模板,采用PCR扩增获得约900bp大小的DNA片段,回收该片段并与pUCm-T载体连接,转化感受态大肠杆菌.进行PCR检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含904个核苷酸对;采用vector NTI软件将本试验中克隆的序列与Genbank（AY427575）公布的日本晴球蛋白基因启动子序列比对,有9个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻球蛋白基因启动子;在重要功能区段上,两者核苷酸序列完全一致.本研究认为造成长期不在一个环境中种植的同一水稻品种球蛋白基因启动子序列差异的原因之一,可能是核苷酸中性突变.水稻球蛋白基因启动子的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

除草剂抗性基因bar导人烟草叶绿体

将编码Phosphinothricin acetyltrans ferase的bar基因与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建成表达盒,连同烟草叶绿体基因组同源片段rpl2-trnH-psbA和trnK-ORF509A以及选择标记基因aadA一起构建成烟草叶绿体转化载体pTZBA。基因枪法转化烟草叶片,经壮观霉素筛选获得转化再生植株。分别以1.0 kb的叶绿体同源片段trnK-OR