不同簇毛麦6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用

小麦6VS·6DL易位系Pm97033和6VS·6AL易位系92R137中的6VS染色体臂来自不同的簇毛麦种质,均表现良好的白粉病抗性,本研究利用分子标记对这2个易位系所包含抗病基因的异同进行了鉴定。利用与Pm21抗白粉病相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Stpk-V基因(GenBank登录号为HQ864471.1)的基因组和cDNA序列为基础,在包含至少1个内含子的2个编码区设计引物,从Pm97033中扩增获得特异的多态性片段。为进一步提高特异性和扩增的稳定性,对特异扩增片段测序并重新设计引物,扩增筛选获得2个引物对,其中PK-F1/PK-R可专一扩增6VS·6DL易位系Pm97033及其抗病亲本,而PK-F2/PK-R可同时特异扩增2个不同来源的簇毛麦6VS染色体,但二者间的特异片段具有多态性。利用这2对引物,对系谱中包含6V(6D)和6VS·6AL、抗白粉病的小麦品系CB037进行检测,发现仅出现与6VS·6AL易位系相同的簇毛麦扩增片段,不存在簇毛麦No. 1026 (Pm97033的6VS供体)的扩增片段。基因组原位杂交结果表明,CB037仅含1对小麦-簇毛麦的易位染色体,用已报道的分子标记检测证明易位涉及的小麦染色体为6A,与本研究开发的分子标记检测结果相吻合,表明CB037携带的白粉病抗性基因来自6VS·6AL易位系92R137,其白粉病抗性可能与Pm97033具有不同的遗传基础。     

簇毛麦6VS上4个新分子标记的鉴定及与抗白粉病基因Pm21的连锁分析

Pm21具有强抗白粉病特性，位于簇毛麦6V染色体短臂（6VS）上。染色体分析和白粉病抗性检测表明，Pm21在受体小麦内是稳定遗传的。筛选与Pm21相连锁分子标记，在小麦抗白粉病辅助选择育种上有重要意义。利用RAPD和AFLP分子标记方法，对簇毛麦6V染色体和含有6V的小麦-簇毛麦代换系、6VS的易位系6AL/6VS、6DL/6VS进行分子标记筛选，以分析位于6VS上的分子标记及其与Pm21的关系。RAPD检测表明，OPK08910特异片段存在于含簇毛麦6V染色体的代换系（6A/6V）、易位系（6AL/6VS，6DL/6VS）和簇毛麦中。AFLP检测显示，PstⅠ+AGG / MseⅠ+CAC、PstⅠ+ACC / MseⅠ+CCT和PstⅠ+ AAG / MseⅠ+CGC 共3对引物分别可以在6A/6V、6AL/6VS、6DL/6VS和VV中扩增出264 bp、218 bp和232 bp特异带，并与抗白粉病基因Pm21共分离，因此，上述来源于6VS上的4个新的分子标记，可作为源自簇毛麦Pm21基因的选择标记，用于小麦抗病育种。     

小麦-簇毛麦染色体代换系、易位系Ⅴ染色体RAPD标记筛选

利用105条S系列和100条Operon随机引物,对小麦一簇毛麦代换系(6V／6A)、两个易位系(6VS／6AL,6VS／6DL)及亲本簇毛麦(VV)、硬粒小麦(AABB)、栽培小麦(AABBDD)的多态性进行了筛选分析。80．95％的S系列引物扩增出了结果,且条带较清晰;在100条OP系列引物中均扩增出结果,条带清晰可见。从205个随机引物中发现,只有1个引物OPW03在含有簇毛麦V染色体的4个材料中均扩增出l条约570bp的谱带,而在栽培小麦和硬粒小麦中没有发现。因此,可以推测这个分子标记(OPW03—570)是位于簇毛麦V染色体短臂上的。     

基于EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用

为定位、转移和利用簇毛麦有益基因, 通过花粉辐射, 获得一批包括小麦-簇毛麦易位染色体的异染色体系。为了鉴定这批材料中的簇毛麦染色体身份, 根据水稻、小麦的EST序列合成了240对STS引物, 其中34对引物在普通小麦中国春与簇毛麦间存在多态性;进一步对亲本及簇毛麦二体异附加系进行PCR扩增分析, 标记CINAU32_-300可追踪簇毛麦1V染色体, 标记CINAU33_-280、CINAU34_-510、CINAU35_-1100、CINAU36_-380和CINAU37_-400可追踪簇毛麦2V染色体, 标记CINAU38_-250可追踪簇毛麦3V染色体, 标记CINAU39_-950和CINAU40_-800可追踪簇毛麦4V染色体, 标记CINAU41_-745和CINAU42_-1050可追踪簇毛麦5V染色体, 标记CINAU44_-765和CINAU45_-495可追踪簇毛麦7V染色体。加上本室已开发的2个6V染色体特异标记, 用这些簇毛麦特异分子标记鉴定辐射诱导材料的部分回交后代, 选育出小麦背景中只包含单条簇毛麦染色体的整套1V至7V染色体系, 同时有18条易位染色体的簇毛麦身份得到确定, 表明这些标记可以用来快速检测普通小麦背景中的簇毛麦染色体或染色体片段。     

簇毛麦6V染色体短臂特异分子标记的开发和应用

为开发簇毛麦6V染色体短臂特异的分子标记,并利用这些标记对缺失系进行鉴定,选用11个RGA和17对STS引物进行多态性分析,其中1个RGA引物和1对STS引物在对普通小麦扬麦5号、簇毛麦及普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系进行多态性分析时,分别检测到一条约1 000 bp和约800 bp的多态性片段,将这两个标记转化为稳定的特异性分子标记,分别命名为CINAU17-1086和CINAU18-₇₂₃。运用这两对引物对一系列材料进行扩增,只有含6V染色体短臂的材料才能扩增出相应的特异条带,表明这两个标记均位于簇毛麦6VS上。进一步利用簇毛麦6VS缺失添加系、易位系将CINAU17-₁₀₈₆标记定位在簇毛麦6VS FL0.58与FL0.70之间,将CINAU18-₇₂₃标记定位在簇毛麦6VS FL0.45与着丝粒之间。利用这两个特异标记对通过花粉辐射获得的部分簇毛麦6VS结构变异材料进行PCR鉴定,其结果与细胞学鉴定结果一致。CINAU17-₁₀₈₆和CINAU18-₇₂₃标记可用来快速检测和追踪导入普通小麦背景中的簇毛麦6VS染色体片段,并对缺失系的断点进行了初步界定。     

利用SDS-PAGE和AS-PCR标记鉴定簇毛麦HMW-GS基因

本研究通过SDS-PAGE和AS-PCR标记对簇毛麦HMW-GS进行鉴定,对于快速鉴别导入到普通小麦中的簇毛麦HMW-GS和改良普通小麦品质具有重要意义。利用SDS-PAGE对中国春、钱尼、簇毛麦、6个中国春-簇毛麦二体附加系、普通小麦-簇毛麦3V异代换系进行HMW-GS组成分析,进一步确定簇毛麦HMW-GS基因位于1V染色体。根据已发表的普通小麦HMW-GS基因序列同源性比较结果,设计了3对分别扩增普通小麦x-型亚基基因、y-型亚基基因以及所有HMW-GS基因的特异引物。经过对簇毛麦HMW-GS基因进行扩增发现,这3个AS-PCR标记都能很好地鉴别簇毛麦HMW-GS编码基因,并从分子水平上把簇毛麦HMW-GS基因定位于簇毛麦1V染色体上。     

簇毛麦和中间偃麦草rRNA基因位点双色荧光原位杂交分析

簇毛麦和中间偃麦草是小麦改良的重要抗源，为了对导入的外源染色体及片段进行有效鉴定，应用分带和双色荧光原位杂交，将25S－5．8S－18S rRNA、5S rDNA基因分别定于簇毛麦染色体1V短臂和5V短臂上。分别在中间偃麦草的3对、4对染色体上观察到25S－5．8S－18S rRNA和5S rRNA基因，其中有2对染色体在其短臂上有两种核糖体RNA基因。     

基于改进的多色荧光原位杂交技术的染色体分析

为了提高多色荧光原位杂交(M-FISH)技术的鉴定效率,简化M-FISH操作程序,探索和建立新的M-FISH实验及观察体系,本研究以‘荆辉1号’（普通小麦辉县红-荆州黑麦双二倍体）、‘南农9918’（普通小麦-簇毛麦整臂易位系T6VS.6AL）、‘扬麦22’（普通小麦-簇毛麦整臂易位系T6VS.6DL）以及‘ST5V#4S-1’（普通小麦-簇毛麦小片段易位系）等为试验材料,以2个寡核苷酸探针[(GAA)₁₀、pAs1-1]和物种基因组DNA探针作混合探针进行M-FISH分析。结果表明在一次原位杂交中同时使用3种探针,既可以识别出小麦背景中所有的外源染色体或染色体片段,又可以根据(GAA)₁₀和pAs1-1在染色体上的杂交信号分布精确鉴定出小麦和外源染色体（片段）的具体身份。这种改进的M-FISH技术可有效用于小麦及其近缘植物染色体的鉴定,并有助于快速构建物种基于FISH的分子核型。     

一个花粉辐射诱导的小麦-簇毛麦相互易位染色体系的分子细胞遗传学研究

利用⁶⁰Co-γ-射线处理小麦-簇毛麦6V单体添加系花粉，并给中国春授粉，在一个M1单株减数分裂中期Ⅰ检测到一个由2条小麦-簇毛麦易位染色体和一条完整小麦染色体构成的三价体，说明参与易位的2个小麦片段均来自同一条小麦染色体，推测两条易位染色体由相互易位产生。将其中涉及外源大片段的易位染色体称为外源大片段易位（large alien segment translocation, LAST），涉及外源小片段的称为外源小片段易位(small alien segment translocation, SAST)。对后代中两个易位染色体均纯合的植株（LAST’’+SAST’’, 2n = 44）进行顺次C-分带和GISH研究，结果表明外源大片段易位染色体为T7BS-6VS•6VL，外源小片段易位染色体为T6VS-7BS•7BL，易位断点分别位于7B染色体短臂约FL0.60处及6V染色体短臂约FL0.70处。在M2代群体中检测到7种染色体组成类型，比例为3(LAST’’+SAST’’)∶20(LAST’+SAST’)∶2(LAST’’+SAST’)∶1(LAST’+SAST’’)∶1LAST’∶2SAST’∶22(0型)，其中外源大片段和外源小片段易位染色体往往相伴出现。抗病鉴定结果显示抗白粉病基因位于外源大片段易位染色体T7BS-6VS•6VL上。对LAST’+SAST’型（2n = 43）M₂代单株花粉母细胞减数分裂的GISH研究结果显示，88.5%的后期Ｉ或末期Ｉ细胞中出现T6VS-7BS•7BL和T7BS-6VS•6VL的共分离。此外，在个别后期Ｉ细胞中观察到外源大片段易位染色体T7BS-6VS•6VL发生落后和着丝粒断裂现象，并在LAST’型单株（2n =42）的自交后代中筛选到一个通过着丝粒断裂-融合产生的外源小片段插入易位T7BL•6VS-7BS，这为利用外源大片段易位进一步创制携带抗病基因的小片段插入易位提供了新的思路。还分别获得了T7BS-6VS•6VL和T6VS-7BS•7BL的纯合易位系。     

多年生簇毛麦a-醇溶蛋白基因的分离与序列分析

以多年生簇毛麦(Dasypyrum breviaristatum)基因组DNA为模板, 用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增。扩增产物经克隆测序, 获得999~1 018 bp的7个序列(GenBank登录号为EU186102–EU186108), 分别编码283~290个氨基酸。序列比对结果表明, 它们具有a-醇溶蛋白基因的保守特征, 是a-醇溶蛋白基因家系成员。该7个序列与乳糜泻(celiac disease)病人毒性抗原相关序列的比对结果表明, 有5个序列在C末端具有Glia-a-2型抗原序列的特征。根据a-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树, 发现来自多年生簇毛麦的a-醇溶蛋白基因序列单独聚为一类, 不能与普通小麦A、B或D染色体组的相关序列聚在一起。在序列分析的基础上设计了簇毛麦基因组a-醇溶蛋白基因的特异引物AS-V-gli-F和AS-V-gli-R, 通过特异PCR扩增, AS-V-gli-F和AS-V-gli-R仅能对多年生簇毛麦、小麦-多年生簇毛麦部分双二倍体进行特异性扩增, 而不能对小麦和其他小麦族物种进行扩增。因此, AS-V-gli-F和AS-V-gli-R可作为检测多年生簇毛麦a-醇溶蛋白基因向栽培小麦转移的分子标记。     

Development and identification of wheat–Haynaldia villosa T6DL.6VS chromosome translocation lines conferring resistance to powdery mildew

Three lines conferring resistance to powdery mildew, Pm97033, Pm97034 and Pm97035, were developed from the cross of Triticum durum-Haynaldia villosa amphidiploid TH3 and wheat cv.'Wan7107' via backcrosses, immature embryo and anther culture. Genomic in situ hybridization analysis showed that these lines were disomic translocation lines. Cytogenetic analysis indicated that the F1 plants of crosses between the three translocation lines and 'Wan7107' and crosses between the three translocation lines and substitution line 6V(6D) formed 21 bivalents at meiotic metaphase I. Aneuploid analysis with 'Chinese Spring' double ditelocentric stocks indicated that the translocated chromosomes were related to chromosome 6D. Biochemical and restriction fragment-length polymorphism (RFLP) analyses showed that the translocation lines lacked a specific band of 6VL of H. villosa compared with the substitution and addition lines but possessed specific markers on the short arm of the 6V chromosome of H. villosa. The three translocation lines lacked specific biochemical loci and RFLP markers located on chromosome 6DS. The results confirmed that Pm97033, Pm97034 and Pm97035 were T6DL.6VS translocation lines.     

Comparative analysis of genetic effects of wheat‐Dasypyrum villosum translocations T6V#2S·6AL and T6V#4S·6DL

Wheat‐Dasypyrum villosum translocations T6V#2S·6AL and T6V#4S·6DL, carriers of Pm21 and PmV, respectively, confer high resistance to wheat powdery mildew. For better understanding of the difference in genetic effect between them, a RIL population was constructed based on the cross between “Yangmai 18” carrying T6V#2S·6AL and “Yangmai 22” carrying T6V#4S·6DL. Analysis of distribution of the translocations showed that T6V#2S·6AL is much more transmittable than T6V#4S·6DL. By comparing their effects on main agronomic traits, we firstly found that T6V#2S·6AL contributes greatly to top spikelet fecundity, but causes a decrease of 6.7%–10.5% of spike number. No stable effects of T6V#4S·6DL on agronomic traits were found, except for positive effect on plant height. Excitingly, a new recombinant, T6V#4S‐6V#2S·6AL carrying PmV, was screened and proved to have a higher transmission rate than the original translocation T6V#4S·6DL, which will greatly promote the utilization of PmV. The above conclusions of this research will provide important guidance for utilization of Pm21 and PmV more effectively, in wheat powdery mildew resistance breeding.     

若干小麦抗白粉病品系的有效抗病基因的测定

采用具有不同毒性基因的白粉菌菌株进行苗期接种，通过与已知抗病基因材料抗谱的相似性比较，对１７个抗白粉病育种品系的有效抗病基因进行了分析，其中３个阿拉拉特小麦杂种后代品系、４个Ｖ．Ｐ．Ｍ系统的杂种后代品系及另外１个杂交组合的后代品系含主效抗病基因Ｐｍ２；４个具有Ｖ．Ｐ．Ｍ或Ｃ３９血缘的品系及另外１个品系含主效抗病基因Ｐｍ４ ｂ；１个品系含Ｐｍ２＋６；２个普通小麦－黑麦６Ｄ／６Ｒ代换系的抗谱相似，且不     

SSR标记定位一个新的小麦白粉病抗性基因

来源于簇毛麦与普通小麦杂交后代的稳定小麦品系101-3含有1个新的抗白粉病显性基因,暂命名为PmX,用单体分析的方法已定位于染色体6B上.以感白粉病小麦品种中国春与101-3杂交后代F2 为材料,用65对6B染色体上和9对6A染色体上小麦微卫星引物,进行连锁分析,发现小麦微卫星标记Xgwm570与基因的遗传距离为(9.72±2.40) cM,该结果表明,该基因位于小麦染色体6BL上,同时也为分子标记辅助育种上利用该基因提供了初步的选择标记.     

普通小麦–簇毛麦种质对菲利普孢囊线虫的抗性分析

菲利普孢囊线虫(Heterodera filipjevi)是在我国新发现的一种小麦病原线虫, 已严重威胁我国小麦的安全生产。小麦近缘种属具有改良小麦所需的许多目标性状, 是丰富小麦遗传变异、选育抗病品种的重要基因资源。采用室内接种鉴定法, 从20份小麦近缘属种材料中发现簇毛麦(Dasypyrum villosum)高抗H. filipjevi。分别对3套普通小麦–簇毛麦染色体附加系和6VS易位系进行接虫抗性鉴定, 结果6V染色体附加系高抗H. filipjevi;含6VS的易位系则表现感病。据此推测, 簇毛麦6V染色体上可能含有抗H. filipjevi基因, 且可能位于6VL上。     

利用SNP芯片和BSA分析规模化定位小麦抗白粉病基因

规模化定位小麦品种携带的抗白粉病基因对于抗病性种质创新和新品种选育具有重要的意义。本研究采用Illumina Infinium iSelect 90k SNP芯片结合集群分离分析法(bulked segregate analysis,BSA)对36个河南省小麦新品系携带的抗白粉病基因进行了定位。SNP芯片检测表明,在24个小麦品系构建的抗、感池DNA间可检测到一个明显富集的SNP峰,表明其可能携带单一主效抗白粉病基因;在其他12个小麦品系构建的抗、感池DNA间可检测到多个SNP峰,推测其可能含多个抗白粉病基因。有26个小麦品系在2AL染色体上检测到的SNP数目最多,推测其携带位于2AL染色体上的Pm4b抗白粉病基因。开发出与2AL染色体上抗白粉病基因紧密连锁的分子标记Xwggc116,可用于这些小麦品系中抗白粉病基因的分子检测。研究结果表明高通量SNP分析技术平台可以用来规模化定位小麦品种中的抗白粉病基因,明确了河南省抗白粉病小麦品系中携带Pm2、Pm4b、Pm21和新1BL/1RS易位等有限的抗白粉病基因,抗病基因资源非常狭窄,亟需引进新的多样化抗病基因资源,拓宽遗传基础,培育抗病小麦新品种。     

小麦抗白粉病基因的分子标记检测及其抗性评价

为了解小麦抗白粉病基因的组成类型以及分布状况,以加快小麦育种进程.本研究收集260份小麦作为亲本材料,根据已开发的小麦白粉病抗性基因Pm2、Pm4、Pm13和Pm21J的分子标记对其进行辅助标记鉴定.统计结果显示,260份亲本材料中,有124份材料含有Pm2单基因(占47.690/01;1份材料含有Pm13单基因(占0.38%);10份材料含有Pm2+Pm4聚合基因(占3.84%);7份材料含有Pm2+Pm13聚合基因(占2.69%);4份材料含有Pm2+Pm21聚合基因(占1.54%1;其余114份材料经上述4种标记检测没有发现相应的带型.结合田间自然诱发鉴定的结果表明:含有Pm2单基因的材料抗性不稳定,含有Pm2、Pm4、Pm13和Pm21聚合基因的材料抗性稳定,其余没有检测出上述相应标记带型的材料中也存在抗性优异的材料,但其抗病机理还需进一步研究,以期为小麦抗病育种提供新的抗源.