木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

百合响应非生物胁迫的分子机制研究

非生物胁迫严重影响了百合的生产、生长发育过程,百合有应对高温、寒冷、干旱、高盐或激素ABA等非生物胁迫的能力,百合可以通过胁迫信号感知、信号激活、信号转录和转导,并通过一系列相应胁迫的基因的表达以及生理反应来响应非生物胁迫。百合对非生物胁迫的响应过程比较复杂,响应过程分为胁迫信号的接受与感受,信号的转导,转录调控基因的表达。本研究分别从转录组测序和蛋白质组学方面,对百合响应非生物胁迫的基因表达机理及百合在非生物胁迫分子机制成果进展进行总结阐述,并讨论了培育抗逆性强的百合品种的前景,为百合分子育种提供理论参考。     

木薯MeTPS7基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖生物合成途径中的关键酶,提高TPS基因的表达可以增强植物在干旱、低温等非生物胁迫条件下的抗逆性。为了研究TPS基因在热带作物木薯抗逆中的功能,本研究通过RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆了一个TPS基因,命名为Me TPS7。该基因含有一个2 562 bp的开放阅读框,编码853个氨基酸,含有TPS家族保守结构域,属于TPS第Ⅱ家族成员。系统进化树分析表明,Me TPS7与杞柳和杨树中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别达到90.2%和90.3%。启动子元件分析表明,Me TPS7含有干旱诱导(MBS)、低温和干旱响应(C-repeat/DRE)、热胁迫响应(HSE)、ABA响应(ABRE)、以及光响应(ACE,G-Box,BoxⅠ,Box 4)等元件。实时荧光定量PCR分析表明,Me TPS7在须根中表达最高,叶片和储藏根中表达最低,其表达量仅为须根的34%和38%。而且,Me TPS7基因的表达能被干旱、低温、遮荫和ABA处理显著诱导。这些结果表明Me TPS7可能在转录水平参与ABA介导的木薯干旱、低温和遮荫胁迫响应,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的功能。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

毛竹PheNAC1基因负调控拟南芥对盐胁迫的耐受性

NAC (NAM, ATAF和CUC)转录因子在植物生长发育、衰老及抵御非生物胁迫等过程中具有重要的作用。为探究NAC基因在毛竹(Phyllostachys edulis)生长发育过程中的功能和响应环境胁迫的分子机制,本研究以毛竹为材料,克隆获得PheNAC1基因的全长CDS序列,并对其序列和表达模式进行分析。结果表明,PheNAC1基因编码区为954 bp,编码318个氨基酸。同源性分析表明,PheNAC1与水稻的OMTN3具有较近的亲缘关系(序列相似性为82.28%)。亚细胞定位结果预测PheNAC1定位在细胞核,转录激活活性分析显示其不具有转录激活活性。PheNAC1基因的启动子区含有胁迫响应元件,如：脱落酸(abscisic acid, ABA)有关的脱水胁迫元件(STRE)、厌氧诱导相关元件(ARE)等,表明其可能参与毛竹的胁迫响应。组织特异性表达分析显示,PheNAC1在毛竹叶中表达丰度最高,根和茎中次之;在成熟叶和衰老叶片中的表达显著高于幼叶。在干旱胁迫和盐胁迫后,分别在1和3 h显著上调表达。在笋采后衰老过程中显著上调表达。过表达PheNAC1基因的拟南芥对盐胁迫的耐受...     

马铃薯HD-Zip Ⅰ家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子,在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因,其开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯第1染色体,其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水和高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达,其根中表达量最高。q RT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、Na Cl和ABA诱导,受低温抑制。构建了由组成型表达启动子Ca MV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后,转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P0.05),而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P0.05);转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株;说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

水稻ABA生物合成基因OsNCED3响应干旱胁迫

9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是植物内源脱落酸(ABA)生物合成的限速酶,由NCED基因家族编码,水稻中响应干旱胁迫并以此调节ABA水平的OsNCED基因尚见未报道。本研究发现在水稻已报道的5个OsNCED基因中,OsNCED3的表达受干旱胁迫诱导,复水处理后其表达快速下调,其表达模式与此过程中内源ABA含量变化趋势一致。OsNCED3的RNAi转基因植株表现为干旱敏感,且生物量下降;而过量表达OsNCED3基因增加了水稻的抗旱性。干旱胁迫下过量表达OsNCED3的转基因株系有较高的ABA水平,同时其抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,以及逆境响应基因脱水素蛋白(Dehydrin)和胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)转录表达均高于野生型。下调表达OsNCED3的转基因株系则呈现相反的变化趋势。因此,OsNCED3是水稻干旱胁迫响应基因,调节了干旱环境下ABA水平和抗逆性。     

玉米A亚族bZIP转录因子基因ZmbZIP81的克隆、表达与功能分析

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)蛋白是真核生物所特有的一类转录因子,对于植物在逆境下的基因表达调控具有重要作用。为丰富对玉米bZIP转录因子功能的认识,本研究以从玉米中克隆到的一个A亚族bZIP转录因子编码基因ZmbZIP81为对象展开。ZmbZIP81基因位于玉米第6染色体,编码区全长2492 bp,由4个外显子和3个内含子组成,编码蛋白含254个氨基酸。研究表明ZmbZIP81基因表达受外源ABA、NaCl和干旱胁迫诱导。过表达该基因的拟南芥植物表现出ABA不敏感和NaCl胁迫抗性增强的表型,推测ZmbZIP81可能作为ABA信号途径的负调控因子参与植物抗逆基因表达调控网络。     

苹果MdPIF4基因克隆、表达与功能验证

温度是影响植物生长发育重要的环境因子之一,光敏色素互作因子PIF4是植物响应温和高温的核心基因,明确MdPIF4在苹果温度响应中的作用具有重要意义。本研究克隆了MdPIF4的编码区和启动子序列,分析了MdPIF4的表达情况,对MdPIF4转录激活活性进行了分析和互作蛋白筛选,并在野生型拟南芥中异源过表达了MdPIF4。结果显示:MdPIF4基因编码区包含1 656 bp的核苷酸,编码551个氨基酸,预测其蛋白质分子质量为60 670.87 Da,等电点为6.63。MdPIF4在苹果叶片中的表达量最高,其次为根、茎、花,在果实中的表达量最低。MdPIF4启动子中含有光响应元件、ABA(脱落酸)响应元件ABRE、SA (水杨酸)响应元件TCA-element、厌氧调节响应元件ARE、干旱响应元件MBS等。MdPIF4受温和高温诱导表达。不同物种间bHLH结构域的蛋白序列保守性较强,MdPIF4序列全长在酵母中具有转录自激活活性,bHLH结构域在酵母中没有自激活活性,其余片段均具有自激活活性。以bHLH结构域为诱饵蛋白,酵母双杂交筛库获得3个互作蛋白,分别为Md WRKY70、MdHAT5和MdRab11D。在野生型拟南芥中过表达MdPIF4促进了拟南芥幼苗下胚轴的生长。上述研究表明MdPIF4参与苹果温和高温响应。     

甜菜ERF转录因子基因克隆及非生物胁迫响应分析

ERF(Ethylene-responsive element binding factors)是调控植物生长发育和响应胁迫的重要转录因子，在植物应对生物及非生物胁迫反应、调控胁迫相关功能基因的表达、提高植物的抗逆性中起着重要的作用。分析甜菜ERF转录因子基因在非生物胁迫下的表达规律，旨在为深入研究ERF转录因子在甜菜逆境胁迫应答中的作用机制提供理论依据。本研究以高糖型甜菜品系‘BS02’为试材，利用RT-PCR方法克隆得到Bv＿ammr基因，并对其进行生物信息学分析。该基因CDS区长906 bp，编码301个氨基酸。蛋白质分子量为33.19 kD，理论等电点为8.61，其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，具有一个AP2保守结构域；氨基酸序列的同源性和进化树分析显示其编码蛋白与马兜铃菌毛所编码的蛋白亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR方法观测非生物胁迫下该基因表达模式，结果表明，Bv＿ammr基因对低温、高温、干旱、盐、ABA等非生物胁迫有不同程度响应。     

大豆GmHDL57基因的克隆及抗盐功能鉴定

HD-Zip I类转录因子在植物抵御非生物胁迫过程中发挥重要功能, 本研究克隆得到1个大豆HD-Zip I类基因GmHDL57 (Glycine max homeodomain-leucine zipper protein 57)。序列分析表明, GmHDL57基因包含1个1038 bp的开放读码框, 编码345个氨基酸, 具有HD-Zip类家族蛋白典型的保守结构域。基因时空表达分析表明, 大豆GmHDL57基因在大豆植株的各个不同时期及不同器官中均有表达, 在花中表达量最高。采用实时荧光定量PCR技术分析了4种非生物胁迫(脱落酸、NaCl、PEG、冷)对幼苗期大豆根中GmHDL57基因表达的影响。结果表明, 该基因表达量受高盐胁迫诱导显著升高, 在脱落酸及干旱胁迫下上升幅度较小, 但在冷胁迫下呈下降趋势。盐胁迫前后GmHDL57基因在根中的表达量明显高于茎和叶, 在盐胁迫48 h时达到峰值, 72 h和96 h时表达量缓慢下降。此外, 构建GmHDL57基因的植物超表达载体, 利用根癌农杆菌转化法获得转基因百脉根, 200 mmol L ^-1 NaCl处理条件下, 转基因百脉根的株高、根长、叶绿素含量、根系活力以及阳离子K ⁺、Ca ²⁺含量显著高于野生型, 而丙二醛含量、相对质膜透性以及Na ⁺的含量明显低于野生型。以上研究结果表明, GmHDL57基因参与了大豆对非生物胁迫的应答过程, 过量表达GmHDL57基因能够显著提高百脉根的抗盐能力。     

玉米干旱诱导表达基因ZmCKS2的克隆与表达分析

在本实验室前期研究的干旱胁迫相关的抑制差减文库(SSH)中,发现一个玉米干旱胁迫诱导表达的EST序列,与拟南芥AtCKS2和AtCKS1基因有较高的同源性。应用生物信息学手段和同源克隆的方法,分离得到该基因,命名为ZmCKS2。序列分析表明该基因开放阅读框区267bp,编码88个氨基酸。ZmCKS2蛋白含有真核生物中高度保守的CKS(cyclin-dependent kinase regulatory subunit)结构域。应用在线分析软件预测该基因上游2kb序列表明,该序列具有启动子的核心序列和增强子序列,同时还具有与干旱等多种逆境胁迫相关的调控序列。应用实时荧光定量PCR分析表明该基因在幼穗中表达量最高,且受干旱和MeJA诱导上调表达,受低温和外源ABA诱导下调表达。     

银杏GbASR基因的克隆、生物信息学及表达分析

为了明确银杏ASR(ABA-stress-ripening)在应答非生物逆境胁迫中的作用,以便为ASR基因功能、环境胁迫研究提供材料。本研究以银杏(Ginkgo biloba)为材料,利用分子生物学技术对ASR基因进行了克隆,构建pCAMBIA1300-ASR-GFP融合表达载体,进行亚细胞定位分析。采用序列比对方法分析GbASR蛋白结构域及系统进化;利用qRT-PCR方法进行组织特异性表达及非生物逆境胁迫下的基因表达分析。结果表明,银杏ASR基因编码区全长546 bp,共编码182个氨基酸;蛋白质等电点为5.33,分子量大小为20111.24 Da,为亲水性稳定蛋白;GbASR蛋白含有1个高度保守的ABA/WDS结构域,且与火炬松PtASR蛋白同源性较高;GbASR蛋白定位于细胞核。此外,GbASR基因在银杏幼苗根、茎、叶各组织中均有表达,且在叶部有较高的表达;在高盐、干旱和高温胁迫下,GbASR基因均受诱导,且在不同胁迫处理时间0 h、6 h、24 h和48 h的表达存在显著的差异。以上分析说明GbASR基因参与响应高盐、干旱和高温等非生物胁迫,这为植物的育种及解释ASR基因功能提供依据。     

红麻海藻糖生物合成关键酶基因HcTPPJ的克隆及响应逆境的表达分析

Trehalose biosynthesis key enzyme gene TPP plays an important role in plant response to various abiotic stresses. In this study, in order to clarify the role of TPP gene in response to abiotic stress in kenaf, a specific primer was designed according to the sequence of CL541.contig2unigene, and the full-length cDNA sequence of TPP gene was obtained by PCR. Bioinformatics analysis showed that TPP had an open reading frame (ORF) length of 1128 bp, and encoded a protein containing 375 amino acids. The results of amino acid sequence consistency indicated that the agreement between the amino acid sequence of protein and that of TPPJ from other species was 71.18%, so the gene named as HcTPPJ. HcTPPJ was expressed in roots, stems and leaves. Under salt or drought stress, HcTPPJ was up-regulated significantly with the extension of stress treatment, indicating that the gene was involved in the response process of salt or drought stress in kenaf. Under the same conditions, HcNCED3 and HcAOC was significantly up-regulated, while the change of HcTPPJ expression was not obvious under ABA stress; HcTPPJ was significantly down-regulated, under the stress of MeJA for six hours. Therefore it was speculated that the HcTPPJ gene expression may be not regulated by the signal molecule of ABA, but negatively regulated by methyl jasmonate signal molecule. This study will lay a solid foundation for further elucidating the role of the gene in response to salt and drought stress in kenaf.     

大豆TRK-HKT家族基因结构及逆境胁迫响应机制

植物TRK-HKT家族基因广泛介导植物Na+/K+运输,参与植物耐逆境胁迫调控。本研究以6个大豆钾利用效率差异品种为材料,利用in silico技术克隆到4个大豆TRK-HKT家族成员(Gm HKT1;1、Gm HKT1;2、Gm HKT1;3和Gm HKT1;4),采用q RT-PCR技术解析这些基因在低钾及逆境胁迫下的表达机制。结果表明,Gm HKT1;2在大豆幼苗根中对低钾胁迫的响应明显高于其他3个基因,且钾高效大豆品种这种响应更明显;同时Gm HKT1;2对不同逆境胁迫(低温、干旱、高盐和ABA)也有较强的响应。蛋白结构分析表明,仅Gm HKT1;2具有4个MPM结构域,4个保守的氨基酸残基空间上形成一个"漏斗样"结构,充当K+/Na+转运通道,通过邻近的ATP结合结构域,为K+/Na+转运提供能量。基因结构分析显示,这些基因均含3个外显子和2个内含子,不同基因间的第一个外显子和内含子片段大小差异显著,导致各基因的基因组DNA(g DNA)大小各异。启动子分析揭示,大豆TRK-HKT家族成员包含参与种子功能定位和各种激素及逆境胁迫应激反应的重要顺式作用元件;进化上该家族基因位于第一进化分支,含保守的Ser–Gly–Gly–Gly基序。     

谷子丙酮酸磷酸双激酶基因(SiPPDK1)对非生物逆境的响应

通过序列比对在谷子基因组中鉴定出一个PPDK基因,命名为Si PPDK1。为揭示该基因对逆境胁迫的响应,本研究通过对Si PPDK1的基因结构、蛋白特征、功能、启动子区域顺势元件、亚细胞定位、进化特征等进行了系统的分析和预测。荧光实时定量PCR检测了该基因在苗期不同逆境、关键生育期干旱以及不同光照条件下的表达。结果表明该基因位于谷子9号染色体,含有17个内含子,有2个可变剪切。功能域分析和多序列比对发现Si PPDK1蛋白具有非常保守的序列结构,并且与其它植物PPDK蛋白非常相似。q RT-PCR表达谱分析表明Si PPDK1基因在苗期被PEG、ABA、Na Cl和低温胁迫强烈诱导。进一步研究表明Si PPDK1基因在拔节、抽穗和灌浆期干旱和不同光照强度条件下均参与了对干旱和光照的胁迫响应,推测该基因参与了谷子对非生物逆境的应答,尤其在抽穗期干旱和光照胁迫应答中起重要作用。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

水稻品种对几种逆境的多重耐性及与ABA的关系

从一些耐旱和耐冷品种中筛选出几个具多重耐性的品种,其中大黄谷耐渗透胁迫和盐胁迫,芝麻糯耐盐和冷胁迫,桂溪和湘中籼2号耐渗透胁迫,也较耐冷胁迫.以大黄谷、芝麻糯和桂溪为材料,研究了多重耐性与ABA积累的关系.在渗透胁迫、盐胁迫和冷胁迫下,各水稻品种内源游离ABA含量迅速积累,耐性品种积累的ABA量都较敏感品种高,