小麦抗逆相关基因 TaGB1的克隆及其表达特性分析

为了解小麦的 TaGB1基因特性、表达情况及其与双子叶植物同源基因的进化关系,以小麦品种济麦22为研究对象,采用同源克隆的方法获得小麦G蛋白β亚基编码区序列, TaGB1编码区全长1 143 bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41 kD,基因组序列中包含6个外显子和5个内含子,分别位于小麦基因组的4A、4B、4D染色体上,不同拷贝的氨基酸同源性高达99.91%。 TaGB1基因结构中包含7个WD40保守域,表达产物位于胞质和质膜上。经系统发育进化关系分析,单子叶植物与双子叶植物的G蛋白β亚基分化形成两大分支; TaGB1在进化关系上与单子叶植物较近,而与拟南芥等双子叶植物较远。 TaGB1在ABA、盐、热和干旱胁迫条件下上调表达,植物的根、茎、叶等部位均有表达,叶片中表达量较高,说明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦EPF/EPFL基因家族的全基因组鉴定及 TaEPF1-2B与气孔性状的关系分析

表皮模式因子EPF/EPFL基因家族编码一类植物中特有的分泌类蛋白,在植物生长发育特别是形态建成过程中发挥着重要作用。为挖掘和利用小麦EPF/EPFL家族基因,对小麦该家族基因进行了系统鉴定,并利用生物信息学技术对其基因结构、蛋白质结构域、系统进化及表达特性进行分析。结果表明,在小麦全基因组水平共鉴定到35个TaEPF/EPFL基因家族成员,含有1~4个外显子,分布在除1A、5B外的19条染色体上,全基因组复制事件是导致该基因家族扩张的主要原因。蛋白结构分析显示,其编码蛋白的C端包含6个相对保守的半胱氨酸残基,N端存在信号肽剪切位点,且亚细胞定位在胞外基质中,属于一类胞外分泌蛋白。系统进化分析发现,TaEPF/EPFL基因在单子叶和双子叶植物分化之前就已形成。表达模式分析发现,大多数TaEPF/EPFL基因在小麦幼嫩组织和穗部表达量较高,部分TaEPF/EPFL基因响应干旱、高温等非生物胁迫。进一步分析 TaEPF1-2B不同单倍型与气孔性状的相关性,发现TaEPF1-2B不同单倍型的气孔密度、气孔长度、气孔宽度和气孔面积均存在极显著差异,净光合速率存在显著差异,其中单倍型Hap A具有较低的气孔密度和较高的光合速率,是优势单倍型。本研究结果为进一步改良小麦的抗旱性和光合效率提供了候选基因。     

酸性蛋白酶pepB基因植物表达载体的构建及在玉米中的转化

以黑曲霉基因组DNA为模板, 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了酸性蛋白酶pepB基因序列,并将其克隆到pMD18-T Vector上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析并测序。DNA序列分析表明：克隆片段长为1 340 bp,与已发表的pepB基因序列同源性达99.85%。将pepB基因片段插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH上,构建了无抗生素选择标记的重组质粒pB-pepB-35S,从而得到了植物表达载体,该载体利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株,并得到了转化植株的种子。     

玉米株型相关基因ZmDwarf4的克隆及表达分析

以松散型玉米自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆与水稻Dwarf4基因同源的玉米Dwarf4基因。序列分析发现,该基因cDNA序列全长1 626 bp,开放阅读框1 521 bp,编码506个氨基酸,与高粱、水稻、拟南芥的氨基酸同源性分别为95%、89%和71%。Real-Time PCR分析表明,ZmDwarf4基因的表达量为3～11叶期表达量逐渐增加,9～11叶期达到最大量,12～19叶期表达量逐渐降低,推测ZmDwarf4基因正向调控玉米叶夹角的大小。ZmDwarf4基因的表达量在叶片中最高,在叶枕中最低。不同激素处理的结果表明,用植物激素（IAA）处理的样品ZmDwarf4基因的表达量始终高于对照;用Brassinolide（BR）处理的样品6叶期ZmDwarf4基因的表达量高于对照,7～10叶期该基因的表达趋势与对照基本一致,但始终低于对照;用IAA+BR处理的样品,该基因的表达趋势与对照基本一致,但高于对照。ZmDwarf4参与玉米BR生物合成途径,进而调控其相关株型建成。     

转BcBCP1基因耐盐碱玉米对田间节肢动物群落的影响分析

利用陷阱调查法跟踪调查全生育期转BcBCP1基因耐盐碱玉米田间地上主要节肢动物群落的种类和数量。结果表明,转BcBCP1基因玉米及其受体玉米自交系黄早四主要害虫、捕食性天敌、地上跳虫的种类和数量上差异不显著,推断耐盐碱转基因玉米的种植对田间节肢动物群落短期内无显著影响。     

延缓叶片衰老ZmIPT2基因的玉米遗传转化及功能验证

从玉米自交系郑58中克隆Zm IPT2基因并构建单子叶植物表达载体,通过农杆菌侵染萌动胚方法将其转入玉米自交系K10中,对转基因后代进行分子检测和功能验证。结果表明,Zm IPT2基因c DNA全长969 bp,成功构建其单子叶植物表达载体p CAMBIA5300-ubi-Zm IPT2。农杆菌侵染萌动胚法共转化K10种子5 163粒,获得T0代PCR阳性幼苗48株,其中13株结实收获种子;获得的3个T2代株系PCR阳性率符合3∶1的分离比,且RT-PCR检测呈阳性;2个T2代转基因株系的成熟期叶绿素含量和细胞分裂素含量极显著高于对照,相对绿叶面积和叶面积持绿期极显著或显著高于对照,百粒重和小区产量显著高于对照。结果初步证明,Zm IPT2基因在玉米中的过表达可延缓叶片衰老,提高玉米产量。     

小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1的鉴定及其等位变异分析

为解析小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1的生物学功能,本研究通过同源克隆的方法从普通小麦中克隆了小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1(TaNRT1.1-1A、 TaNRT1.1-1B和 TaNRT1.1-1D)。生物信息学分析表明,这三个同源基因编码的蛋白均为疏水蛋白,含有丰富的α-螺旋和无未见则卷曲,主要定位于质膜上。小麦不同组织qRT-PCR分析表明, TaNRT1.1-1A和 TaNRT1.1-1B基因在根中表达量最高,其次是叶和茎, TaNRT1.1-1D基因在茎中表达量最高,其次是叶和根。因此,推测 TaNRT1.1-1A和 TaNRT1.1-1B基因在硝酸盐吸收过程中发挥了重要作用, TaNRT1.1-1D基因在硝酸盐转运过程中发挥了重要作用。通过对小麦 TaNRT1.1基因多态性筛选发现,在 TaNRT1.1-1A基因启动子上游1 120 bp的位置有一个8 bp(TGCATGCA)的插入位点,该位点可能与小麦氮利用效率相关。不同氮利用效率小麦品种qRT-PCR分析结果表明,氮高效小麦品种（基因型为 TaNRT1.1-1A-b）苗期根中 TaNRT1.1-1A基因的相对表达量显著高于氮低效小麦品种（基因型为 TaNRT1.1-1A-a）。     

人工改造基因Cry1Abm的合成、原核表达及其抗虫鉴定

根据植物密码子的偏好性及使用频率,对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab野生型基因的编码区序列进行优化和改造,改造后的Cry1Abm基因序列与原始序列同源性为66.2%,G+C含量由37.3%提高到62.7%。人工合成Cry1Abm基因,并将人工合成的改造后的Cry1Abm基因构建到原核表达载体pET28b中,构建原核表达载体pETAbm。将原核表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,用诱导表达的蛋白进行饲虫（玉米螟）实验。结果表明,该蛋白对幼虫具有很强毒性,幼虫的死亡率高达86.63%,同时,存活幼虫的生长发育也受到明显抑制。该基因可以作为杀虫工程及培育转基因抗虫作物的候选基因。     

玉米氮胁迫响应NRT基因的鉴定及ZmNRT2.5的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白(Nitrate Transporters,NRTs)在植物根系NO₃^-吸收或转运中发挥重要作用。为探究玉米NRTs基因在氮素吸收中的功能,从前期转录组数据中鉴定出7个响应氮素处理的差异表达ZmNRTs基因。启动子顺式作用元件分析表明,这些ZmNRTs基因的启动子均含有多个植物逆境或激素应答元件,推测他们可能与玉米非生物胁迫应答或植物激素调控氮素吸收相关。从玉米根系中克隆了对氮素处理响应最大的ZmNRT2.5,该基因CDs全长为1 563 bp,编码520个氨基酸。进化树分析结果表明,ZmNRT2.5与AtNRT2.5同源性最高,含有保守的硝酸盐转运结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,含11个跨膜结构域。实时荧光定量PCR分析表明,ZmNRT2.5主要在根、老叶和叶鞘中表达。低氮处理显著诱导ZmNRT2.5在根中的表达,植物激素脱落酸、赤霉素和乙烯均参与调控ZmNRT2.5的表达。同时,ZmNRT2.5基因的表达受到盐胁迫的显著抑制。     

大麦醇溶蛋白启动子HorD的克隆及其种子特异性表达分析

种子特异性启动子的克隆和功能分析不仅有助于阐明作物种子发育和胚乳特异性基因的表达调控机制，也是进行作物品质改良和种子生物反应器在内的植物基因工程改造的基础。本研究从大麦品种Golden pormise中克隆到大麦胚乳特异性启动子HorD，生物信息学分析表明，其具备启动子的基本元件，如A-box、TATA-box、CAAT-box等，此外还含有胚乳特异性表达所需要的元件Prolamin-box。为验证HorD启动子的表达特性，以pU1300载体为骨架，将HorD启动子和新型冠状病毒（SARA-CoV-2）刺突蛋白基因LPS通过双酶切连接的方式构建表达载体phorD-LPS，并利用农杆菌介导的遗传转化试验验证其种子表达特性。结果表明，HorD启动子能驱动LPS基因在转基因大麦各组织中表达，但在根、茎、叶及颖壳中表达量较低，在种子中表达量较高。这说明HorD启动子可以驱动外源目的基因在大麦种子中特异高效表达。     

玉米体细胞胚胎功能基因转化研究

22A基因属于TCB1家族,编码GTPase激活因子,与体细胞胚胎的发生密切相关,且只在发育的胚中特异性表达。本研究从玉米体胚中克隆Zm22A基因,并对玉米自交系Y423进行遗传转化。结果表明,以玉米自交系Y423体细胞胚胎为受体,利用Zm22A基因的干扰载体侵染,获得阳性苗。     

玉米耐冷基因ZmCOLD1的结构和表达模式分析

低温冷害是影响玉米生产的重要环境因素之一。基于水稻中调控耐低温的OsCOLD1基因编码序列,通过Blast比对获得高度同源的玉米ZmCOLD1基因编码序列,进而对ZmCOLD1基因的分子特征和编码蛋白的亚细胞定位进行分析,并进行ZmCOLD1基因过表达遗传转化载体的构建。结果表明,ZmCOLD1基因编码区长度为1 647 bp,编码548个氨基酸,理论等电点(pI)4.95,估计分子量为137 457.13 Da,属疏水蛋白。利用ClustalX进行蛋白质序列的比对,进行ZmCOLD1基因系统进化树分析,ZmCOLD1氨基酸序列与水稻的亲缘关系较近。通过构建目的蛋白与GFP融合的表达载体pCAMBIA1302-GFP-ZmCOLD1并注射烟草,发现ZmCOLD1蛋白主要集中在细胞质膜中。     

过氧化物酶基因TaPRX-2A调控小麦穗部性状的功能分析

为研究过氧化物酶基因 TaPRX-2A在调控小麦穗部性状中的功能,以苏麦3号为材料,通过Ensemblplants数据库获得 TaPRX-2A全长cDNA序列,利用PCR方法克隆获得该基因编码区全长序列。生物信息学分析结果表明,该基因包含一个1 026 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸。进一步构建基因过表达载体 TaPRX-2A-PC186,通过基因枪介导的遗传转化方法将 TaPRX-2A-PC186转入小麦KN199中,创建过表达 TaPRX-2A转基因株系,调查 TaPRX-2A基因对转基因株系穗部性状的影响。结果表明,过表达 TaPRX-2A转基因株系的穗长显著变短,穗粒数显著减少,说明 TaPRX-2A在调控小麦穗部发育过程中具有重要的作用。     

玉米ZmNRT关键基因挖掘以及氮响应基因共表达网络构建

以玉米自交系B73（V4版本）作为参考基因组,利用生物信息学方法鉴定玉米ZmNRT基因家族成员,从系统发育关系、GO（Gene Ontology）富集、基因结构和玉米不同时期及组织下的表达谱等方面全面解析玉米ZmNRT基因家族。基于qPCR实验和共表达网络分析,对玉米ZmNRT家族基因在氮响应中的作用进行系统的研究。结果表明,在玉米全基因组水平上共鉴定到 162 个 ZmNRT 基因,主要分为 ZmNRT1（62 个）和 ZmNRT2（100 个） 两大类群。GO富集发现,仅46个基因参与硝态氮转运过程,这些基因被不均等分成7个亚家族,每个家族1～15个基因。基因表达模式分析结果显示,不同生育期和组织下ZmNRT基因表达是差异的。在氮诱导下,qPCR鉴定结果显示,12个ZmNRT基因是氮响应基因,9个基因表达上调,3个基因表达下调。共表达网络结果发现,其中10个ZmNRT基因与已知的氮代谢基因存在显著共表达关系（|r|>0.8 p-value<0.05）,推测这10个基因可能是调控玉米氮代谢的关键基因。     

耐除草剂转基因玉米CM8401的获得及功能性状鉴定

耐草甘膦和耐草铵膦是转基因作物育种重要的目标性状。将耐草甘膦基因MC1-EPSPS构建到含有bar基因的植物表达载体pTF101.1中，通过农杆菌介导法转入玉米材料Hi-II中，从而获得兼具耐受草甘膦和草铵膦性状的转基因玉米材料 CM8401。目的基因PCR检测显示，MC1-EPSPS和bar基因稳定整合到玉米基因组中。目的蛋白试纸条检测结果显示，MC1-EPSPS蛋白和PAT蛋白在转基因玉米世代间中表达稳定。田间除草剂耐受性鉴定试验表明，转基因玉米CM8401对草甘膦和草铵膦都具有良好耐受性，可耐受4倍推荐中剂量的草甘膦和草铵膦。     

抑制ZmCol3基因表达调控玉米开花期

采用ZmCol3基因RNAi载体构建、农杆菌介导玉米遗传转化、转基因材料开花期表型鉴定等研究方法,评估抑制ZmCol3基因表达对玉米开花期的影响。转基因玉米基因组PCR结果证实,人工合成RNAi片段已成功整合到玉米基因组中。qRT-PCR结果表明,在不同转基因玉米株系中ZmCol3基因表达受到不同程度的抑制。温室转基因玉米开花期相关性状调查结果表明,抑制ZmCol3表达,可以将玉米抽雄、散粉和吐丝时间提前2~3 d。研究结果证实,ZmCol3具有调控开花期的生物学功能,抑制该基因表达进而缩短玉米开花期可以作为行之有效的方法应用到玉米熟期改良研究中。     

小麦隐性核不育保持系表达载体的构建及拟南芥遗传转化

利用小麦杂种优势能够创制稳定的雄性不育系。相比于细胞质雄性不育系和光温敏雄性不育系,细胞核雄性不育具有育性稳定、易恢复、不受环境影响等特点。小麦隐性核不育基因 ms1的克隆以及杂交制种技术（hybrid seed production technology,SPT）的开发,为雄性不育的保持和杂种优势利用奠定了基础。本研究将小麦花粉育性恢复基因 Ms1、花粉致死基因 ZmAA1、红色荧光蛋白基因 DsRed2及其特异性启动子和终止子连接到表达载体pGEII上,转化野生型拟南芥,得到6株转基因拟南芥。通过荧光显微镜观察拟南芥种子,发现野生型拟南芥种子表面平滑,不能发出红色荧光;而转基因种子表面呈现颗粒状,能够发出红色荧光。这说明表达载体构建成功,并能够在拟南芥中成功表达。这为创制人工小麦隐性核不育系奠定了理论和材料基础。     

玉米ZmCOL3pro217启动子的克隆及功能分析

ZmCOL3是玉米开花期光周期调控网络中一个重要的功能基因,研究发现自然群体中该基因的启动子存在遗传变异,推测这些变异可能参与玉米开花调控。研究从热带血缘玉米材料CIMBL119中克隆了ZmCOL3启动子,命名为ZmCOL3pro217。序列比对发现,该启动子序列与温带血缘玉米B73序列存在1个217 bp大片段置换。生物信息学分析表明,ZmCOL3pro217含有分生组织特异性、光响应、胁迫响应等多个顺势作用元件,预测ZmCOL3pro217可能具有组织特异性,并通过响应光和胁迫反应参与玉米开花调控。进一步构建ZmCOL3pro217驱动gus报告基因表达载体,转化玉米,实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附剂测定、GUS组织化学染色等研究结果发现,转基因植株中ZmCOL3pro217驱动gus基因在根和叶器官中高表达,而在茎、花丝和子粒中几乎不表达,证实ZmCOL3pro217是1个新的组织特异性表达启动子。     

玉米隐性核不育保持系表达载体构建

在Genebank中搜索花粉致死基因Zm AA1、花粉育性恢复基因Ms45、粉质胚乳突变基因Mucronate及各基因特异调控因子和终止子序列,并在目的片段的上下游设计增加同尾酶Spe I(Nhe I、Xba I)和酶切后具有各种类型的DNA片段的Esp3I酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,命名为puc-Zm AA1、puc-Ms45、puc-Mc。采用传统酶切连接的方法将目的片段构建到植物表达载体p CAMBIA3300上,并用热击法将重组质粒导入农杆菌LBA4404及EHA105中,酶切、PCR检测及核苷酸序列测定证明,植物表达载体构建成功。