应用PCR技术检测柑桔黄龙病采样方法研究

对柑桔黄龙病病株老叶、老皮、嫩叶、嫩皮和根每月采样检测,结果表明,黄龙病在老叶、老皮、嫩叶、嫩皮和根中的全年检出率分别为91.7%、86.1%、61.9%、52.4%、13.9%,黄龙病检测最佳的取样部位为老叶,全年均适宜取老叶检测。     

利用一步法RT-PCR检测柑橘裂皮病类病毒

 柑橘裂皮病(CEVd) 是限制柑橘产量的一种重要类病毒病害, 国内外已经建立了多种方法检测该病害的病原。本研究初步建立了快速灵敏检测CEVd的一步法RT-PCR技术。经过与生物学鉴定和双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(sPAGE) 方法的比较检测, 表明该RT-PCR方法检测周期短, 灵敏度高, 有利于对类病毒在春季和冬季浓度低时进行快速准确的检测。应用该技术对大量田间寄主进行了检测。     

柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重RT-PCR检测

 建立了一种同时检测柑橘黄龙病病原类细菌(Candidatus L iberibacter asiaticus, HLB) 、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd) 、柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus, CTV) 的多重RT-PCR技术体系。运用根据3 种病原核苷酸保守区序列设计的特异性引物, 成功的对同一样品中的HLB、CEVd、CTV进行多重RT2PCR扩增, 得到1 160 bp、371 bp、273 bp 3条特异性大小与试验设计相符的条带。就影响多重PCR 的主要因素引物浓度和退火温度进行了一系列优化, 建立了能同时检测HLB、CEVd、CTV的多重RT2PCR技术体系。该体系最低能从10 pg总RNA中检测出黄龙病类细菌和柑橘裂皮类病毒, 从1 pg总RNA中检测到柑橘衰退病毒。对采自田间37份材料的实际检测表明: 存在两种或3种病原的复合侵染。     

柑橘砧木评价及应用研究进展

 优良砧木的选用是柑橘优质丰产的基础。总结了多年来对柑橘砧木在抗生物逆境（柑橘衰退病、裂皮病、流胶病、黄龙病、根结线虫）、耐非生物逆境（耐盐、耐缺素、耐旱、抗寒）等方面的评价以及砧木对接穗生长势、果实品质和产量的影响、砧木与接穗的亲和性等方面的研究进展。     

柑桔裂皮类病毒RT-PCR检测体系的建立及优化

柑桔裂皮类病毒(CEVd)是严重危害柑桔生产的一种世界性病害.本研究以感染CEVd的柑桔叶片为材料,提取总RNA,采用RT-PCR进行检测,并对PCR反应体系进行优化.结果表明:rTaqDNA聚合酶和Hotstart TaqDNA聚合酶能有效排除非特异性带的干扰;使用PCR增强剂,能有效解决CEVd非特异性带的干扰,提高了PCR的扩增效率.     

枳属砧木对柑橘黄龙病的抗性评价

柑橘砧木影响着柑橘品种多种园艺学与病理学性状,选育优良砧木是柑橘优质丰产的基础。本研究以13个枳属及其杂交种砧木为研究对象,分别嫁接黄龙病接穗后,通过观察症状表现及黄龙病菌浓度检测评估供试砧木对黄龙病的抗性。结果表明供试的砧木品种嫁接病穗3个月后除LT54、LT52、飞龙枳和枳柚外上均表现出了黄龙病症状,嫁接6个月后所有供试砧木品种均表现出黄龙病症状。黄龙病菌浓度检测结果显示,嫁接3个月后除了8株砧木外结果均为阳性,嫁接后6个月所有砧木检测结果均为阳性,供试接穗嫁接前和嫁接6个月后的病菌平均浓度相当。本研究结果表明供试的砧木品种均不抗黄龙病,为抗柑橘黄龙病砧木的进一步筛选奠定了良好基础。     

柑橘裂皮病如何防治

正柑橘裂皮病是由柑橘裂皮病类病毒引起的重要柑橘病害之一。裂皮病可侵染柑橘类植物的许多种和品种,病状反应有很大差异。其中大多数砧木品种如酸桔、红桔、甜橙、酸橙、粗柠檬等均无可见病状。以枳、枳橙和黎檬作砧的柑橘植株则病状明显,受害严重。带病苗木在苗期无病状表现,田间植株出现     

迟熟蕉柑茎尖嫁接及其病毒鉴定

采用田间结果树上的芽作为接穗进行茎尖嫁接，最终获得7株茎尖嫁接苗。对所获得的茎尖嫁接苗，应用指示植物腊斯克枳橙、墨西哥来檬和伊特洛格香橼亚利桑那861-S-1分别鉴定柑橘碎叶病、衰退病和裂皮病，用PCR检测技术鉴定柑桔黄龙病。结果表明：1、3、4、5、6号迟熟蕉柑单株不带碎叶病、衰退病、裂皮病和黄龙病，可用作繁殖无病毒苗木的备选材料。     

高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立

针对柑橘老熟组织中富含多糖、多酚、色素和其它次生代谢产物的特点,以柑橘老叶老皮为试材,在传统CTAB提取法的基础上通过添加增效剂并优化配方,建立了一种快速、简便的提取植物老熟组织及其内部病原总核酸的CTAB-Triton提取法。新的提取液对细胞的裂解能力更强,且解决了传统CTAB溶液因低温析出而致DNA得率损失的弊端。比较了该法和微量葡聚糖柱纯化法制备模板时韧皮部杆菌的检出率,并用该法制备模板,分析了韧皮部杆菌在柚子叶片中的分布情况,及对其它几种柑橘病原菌进行PCR/RT-PCR检测。结果表明,CTAB-Triton方法能有效提取柑橘老熟叶片的DNA,所得DNA质量高,产量比商品化试剂盒大,提高了韧皮部杆菌的检出率,且可用于柑橘其他病原真菌、细菌,以及DNA或RNA病毒病害的PCR/RT-PCR检测,也可用于定量PCR检测和病原种群多态性分析。     

柑橘裂皮病如何防治

正柑橘裂皮病是由柑橘裂皮病类病毒引起的重要柑橘病害之一。裂皮病可侵染柑橘类植物的许多种和品种,病状反应有很大差异。其中大多数砧木品种如酸桔、红桔、甜橙、酸橙、粗柠檬等均无可见病状。以枳、枳橙和黎檬作砧的柑橘植株则病状明显,受害严重。带病苗木在苗期无病状表现,田间植株出现树皮开裂所需的时间一般是在定植后4～8年。     

葡萄卷叶病毒Ⅲ RT-PCR检测技术研究

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,对葡萄卷叶病毒株系Ⅲ进行了检测。采用的技术流程为:通过提取葡萄叶片或韧皮部总ＲＮＡ,获得病毒的ＲＮＡ,反转录合成ｃＤＮＡ,经ＰＣＲ扩增,获得病毒ｃＤＮＡ的特征片段,并进行了序列分析。对提取的总ＲＮＡ进行了完整性和纯度检测,确定了良好的ＲＮＡ获得方法。结果表明,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增的片段序列与病毒源序列的同源性高达９９．３%,说明采用本研究确定的方法检测葡萄卷叶病毒株系Ⅲ结果可靠。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

马铃薯S病毒PVSO株系RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立一种马铃薯S病毒普通株系PVSO快速、灵敏的RT-LAMP可视化检测方法。根据马铃薯S病毒普通株系的CP核苷酸序列设计4条引物,以感染PVS的马铃薯叶片总RNA为模板,采用一步法RT-LAMP,在62 ℃下反应60 min,扩增产物利用琼脂糖电泳分析和钙黄绿素染料显色判断结果,同时对其特异性和灵敏性进行测定。结果表明,建立的RT-LAMP方法可特异地对PVSO进行检测,检测灵敏度为RT-PCR的100倍。对33份马铃薯样品检测表明,RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果基本一致。因此建立的PVSO的 RT-LAMP可视化检测方法简便,特异性强,灵敏度高,适合PVSO的快速检测。     

库尔勒香梨上ACLSV的RT—PCR检测

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料通过改进提取方法提取总RNA,获得了较完整的RNA,在此基础上进行了反转录和PCR扩增。并进行了库尔勒香梨上ACLSV(Apple chlorotic leaf sopt virus)的RT-PCR检测,建立了该病毒的RT-PCR检测体系。用此体系扩增得到了ACLSV一个长约为358bp的片段。     

以dsRNA为模板的梨脉黄病毒RT-PCR检测技术研究

用已知带梨脉病毒(Pearveinyellowvirus,PVYV)的库尔勒香梨植株和库尔勒香梨无病毒实生苗为供试材料,分别选用新鲜幼嫩叶片、4℃条件下保存2～4d的幼嫩叶片、冷冻的幼嫩叶片和皮层为试材,进行dsRNA的分离提取实验,得到了与PVYV基因组RNA长度9306bp相当大小的dsRNA谱带,并以dsRNA为模板,利用设计的特异引物,研究建立了梨脉黄病毒(PVYV)的RT-PCR检测技术体系,能有效地扩增出PVYV的一条长为316bp的特异片段,该技术可广泛用于果树病毒的分子检测。     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。