金银花黄酮合成酶LjFNS基因克隆及序列分析

采用染色体步移的方法,首次从金银花中克隆得到LjFNS的基因组全长序列,并根据基因特异性引物克隆得到LjFNS的编码序列(coding sequence,简称CDS)。LjFNS基因全长为1 701 bp,有2个内含子和3个外显子。编码序列长1 593 bp,编码530个氨基酸。序列同源性分析表明,金银花LjFNS基因编码的CDS序列与拟南芥LOC9307309基因CDS序列相似度达89%。生物信息学分析结果显示,LjFNS基因编码蛋白中含有亚铁血红素配合基结合位点,属于细胞色素P450家族,蛋白含有跨膜结构域。LjFNS基因表达实时荧光定量PCR(q PCR)分析结果显示,LjFNS在金银花中的表达具有组织特异性与时间特异性,在白花中的表达量最高,表明该基因的表达可能与花的发育紧密相关。     

海岛棉GbGPAT2基因的克隆与表达分析

[目的]甘油-3磷酸酰基转移酶(GPAT)是植物三酰甘油合成途径的3个关键酶之一,在油脂品质改良和生物质能源利用方面具有重要的应用价值。[方法]本研究通过同源克隆技术,从多年连续自交的海岛棉材料海资8号中获得了海岛棉甘油-3磷酸酰基转移酶基因,命名为GbGPAT2。[结果]GbGPAT2基因cDNA全长1294 bp,包含1个1113 bp的开放阅读框,编码1条370个氨基酸组成的多肽,预测分子量为42.4 kD,等电点为8.72。该基因编码的蛋白具有2个保守结构域,即典型的溶血磷脂酰基转移酶相似家族保守区(LPLAT-LPCAT1-like,Lysophospholipid Acyltransferases-Lysophospholipid Acyltransferases like)和酰基转移酶超家族保守结构域(NAT-SF,N-Acyltransferase superfamily)。GbGPAT2与小桐子、杨树、大豆和拟南芥的GPATs氨基酸同源性在91.2%～85.4%。跨膜区分析表明,GbGPAT2有2个跨膜结构域,亚细胞定位试验表明,GbGPAT2定位于细胞质膜上。qRT-PCR分析表明,GbGPAT2在胚发育的不同时期表达丰度不同,在开花后25 d的胚中表达量最大。[结论]推测GbGPAT2在海岛棉种子油脂合成中起重要作用。     

小鼠跨膜蛋白68 编码基因的克隆与分析

跨膜蛋白68（TP68）是一个结构和功能未知的蛋白。采用逆转录PCR 的方法克隆了TP68 编码 cDNA 序列,并对其进行了生物信息学分析。研究发现,小鼠TP68 编码cDNA 全长990 bp,编码329 个氨基 酸;结构域分析显示小鼠TP68 具有典型的甘油磷脂酰基转移酶结构域,并含有2 个跨膜结构域,很可能是内 质网上的一种膜蛋白;序列比对和三维建模表明其具有典型的甘油磷脂酰基转移酶的底物结合位点和催化 位点以及空间构象。这些结果首次鉴定了小鼠TP68 的编码cDNA 序列,为进一步研究其结构和功能奠定了 基础。     

雨生红球藻HaeDGAT2-3的分子克隆和生物信息学分析

雨生红球藻被认为是天然虾青素的理想来源,虾青素主要储存于富含虾青素酯和三酰甘油(TAGs)的油体中,而二酰甘油酰基转移酶(DGAT)作为三酰甘油及虾青素酯生物合成的限速酶,在雨生红球藻中尚未见报道。试验通过同源克隆与RACE扩增技术相结合的方法获得了2型二酰甘油酰基转移酶(DGAT2-3)的c DNA序列全长,其中,HaeDGAT2-3序列编码区全长为1 149 bp,共编码383个氨基酸;BLASTp分析结果显示,Hae DGAT2-3与衣藻来源的DGAT2相似性达到54.02%;保守功能域分析表明,Hae DGAT2-3蛋白包含DGAT2家族典型的LPLAT超基因家族;多序列比对及系统进化分析结果表明,Hae DGAT2-3蛋白中包括7个保守的功能基序,说明其可能属于DGAT2家族。研究首次从雨生红球藻中克隆得到编码DGAT2的基因序列,生物信息学分析结果对进一步了解雨生红球藻虾青素酯化机制具有重要意义。     

刺五加GAPDH 基因全长cDNA 的克隆与生物信息学分析

采用cDNA末端RACE技术,从刺五加叶片中克隆到GAPDH基因cDNA的全长序列,并运用生物信息学方法对该基因的cDNA序列、保守区、氨基酸序列、亲缘关系等特征进行分析,并预测其编码蛋白质的结构和功能.研究结果表明,刺五加GA PGH基因的cDNA全长为1 437 bp,开放阅读框全长为1 023 bp,编码一个具有340个氨基酸残基的蛋白,蛋白分子质量为37.070 ku,理论等电点(pI)为7.71.刺五加GAPDH蛋白不存在跨膜结构域,定位于细胞质中,属于亲水蛋白.     

麻风树油质蛋白JcOle16.6基因克隆及序列分析

分离克隆麻风树油质蛋白基因家族成员Jc Ole16.6基因的DNA序列(Gen Bank序列号为JX073622.1)。Jc Ole16.6基因全长601 bp,没有内含子,转录的Jc Ole16.6 mRNA具有468 bp的完整开放阅读框,编码含155个氨基酸残基、分子量为16.6 ku、等电点为9.99的Jc Ole16.6蛋白(Gen Bank序列号为AFP19884),属于植物油体结合蛋白油质蛋白家族的新成员。Jc Ole16.6属于稳定的两性蛋白质,具有3个结构域,即N端约30个氨基酸残基组成的含1个α-螺旋的亲水性结构域,肽链中间约78个氨基酸残基组成的含3个α-螺旋的高度疏水性跨膜结构域,C端约47个氨基酸组成的含1个α-螺旋的两亲性结构域。N端亲水性结构域和C端两亲性结构域分布于油体朝向胞浆一面,中间疏水跨膜结构域分布于油体半单位膜内,存在于中间疏水跨膜结构域中的由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的Pro-Knot高度保守结构域在Jc Ole16.6蛋白与油体半单位膜准确定位和稳定维持油体结构方面起着重要作用。研究结果为Jc Ole16.6基因表达调控和生理功能等研究奠定了基础。     

甘蓝型油菜DGAT1重复基因的克隆与表达分析

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT1)是十字花科植物种子三酰甘油积累主要的贡献者。甘蓝型油菜为异源四倍体,存在多个DGAT1重复基因,目前还缺乏对这些基因的系统研究。以甘蓝型油菜为试验材料,根据TAIR已公布的拟南芥DGAT1基因序列在BRAD数据库中进行BLAST比对,根据比对得到的2个白菜型油菜与2个甘蓝的DGAT1基因序列设计引物,利用RT-PCR技术获得4个甘蓝型油菜DGAT1包含完整编码区的基因片段,并对所得到片段进行测序和生物信息学分析。结果表明:克隆得到的基因片段分别为BnDGAT1-1,1 509bp;BnDGAT1-2,1 533bp;BnDGAT1-3,1 515bp;BnDGAT1-4,1 506bp。这4个基因具有极高的相似性,BnDGAT1-1与BnDGAT1-2、BnDGAT1-3与BnDGAT1-4的2个基因相似度均高达97%以上。跨膜结构分析表明BnDGAT1-1与BnDGAT1-2这1对基因所编码的蛋白质含有9个跨膜结构域,而BnDGAT1-3与BnDGAT1-4这对基因所编码的蛋白质含有8个跨膜结构域。包含有BnDGAT1-1与BnDGAT1-3的基因对BnDGAT1-a与包含有BnDGAT1-2与BnDGAT1-4的基因对BnDGAT1-b在含油量不同的各种甘蓝型油菜种子中表达无明显差异,表明这2对DGAT1基因的表达差异并不是影响所选材料种子含油量的决定因素。     

大青杨纤维素合成酶PuCesA6基因cDNA的克隆及序列分析

以大青杨总RNA为模板,通过反转录PCR获得纤维素合成酶PuCesA6基因的全长cDNA序列。序列分析结果表明：其cDNA序列全长3778bp,开放读码框序列3264bp,共编码1087个氨基酸。PuCesA6基因编码的氨基酸序列具备被子植物纤维素合酶基因的特征：锌指结构域、高变区I（HVR—I）、高变区II（HVR—II）与β-糖苷转移酶有关的保守结构域以及8个跨膜区。通过多氨基酸序列比对发现,与光皮桦B1CesA5相似度最高,为89％;其次是玉米ZmCesA8,相似度为80％,且8类CesA的锌指结构与c末端氨基酸序列高度保守。34种CesA蛋白序列的分子进化分析表明,大青杨PuCesA6蛋白与欧洲颤杨PtrCesA6蛋白亲缘关系最近,相似度达99％;和光皮桦BICe．sA5、大桉EgCesA6蛋白同聚为一类。     

小麦Ta-UBXl基因的电子克隆和生物信息学分析

用电子克隆方法获得了1个小麦U - box蛋白基因Ta- UBXI,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析.结果表明:小麦Ta - UBXl基因全长2059 bp,具有完整的ORF编码框,编码553个氨基酸;在N端存在1个显著的UBX保守结构域,该蛋白序列不存在跨膜区或信号肽;生物信息学分析表明,在序列组成、高级结构及活性位点等方面,与其他禾本科植物的同类U - box蛋白具有高度的相似性.     

山茶花翻译控制肿瘤蛋白CjTCTP基因的电子克隆及生物信息学分析

采用电子克隆方法从山茶花的EST数据库中获得了一条TCTP基因,并命名为CjTCTP,使用生物信息学方法对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、信号肽、亚细胞定位、高级结构及功能域和进化树等方面进行了预测和分析。结果表明:山茶花CjTCTP基因全长706bp,包含507bp的完整开放阅读框,编码168个氨基酸;编码蛋白含有TCTP1及TCTP2保守域,是TCTP superfamily家族;从信号肽的预测可知,该蛋白不存在信号肽,可能为可溶性蛋白;亚细胞定位显示其可能位于细胞质中;同源性分析表明,该蛋白序列与拟南芥、橡胶树、玉米等物种TCTP蛋白序列的相似度达80%以上。     

甜荞花同源异型基因FeMADS1的克隆和序列结构分析

采用同源克隆方法,并结合RACE技术,从甜荞花芽分离得到1个A类MADS-box基因FeMADS1的cDNA全长,GenBank登录号为KM386627,其cDNA全长1 107bp,包括1个编码234个氨基酸、长为705bp的开放阅读框。序列同源比对和分子系统发生分析表明,其蛋白与拟南芥AGL8(FUL)的相似性最高,属A类MADS-box基因亚家族中的euFUL进化系,含MADS、I、K和C末端4个明显的结构域,并且K结构域包含K1、K2和K3共3个保守的富含疏水氨基酸残基的亚结构域,C末端结构域含FUL型基因2个特有的模体:FUL motif和paleoAP1motfi。     

犬弓首蛔虫MUC-1基因的克隆及序列分析

为研究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)黏蛋白1基因(Tc-MUC-1)的分子特征,该试验根据犬弓首蛔虫基因组数据库中的Tc-MUC-1基因序列设计引物,通过PCR技术克隆Tc-MUC-1全长基因,并进行多重序列比对和种系发育进化树分析.结果发现该基因全长为531 bp,编码176个氨基酸.功能结构域分析发现Tc-MUC-1蛋白包含1个由11个STSSSSA重复序列构成的Mucin结构域和2个ShKT结构域; GO分析显示具有蛋白质结合和金属离子结合功能;多重序列比对发现Tc-MUC-1与T.canis的其余4个黏蛋白(Tc-MUC-2-Tc-MUC-5)均含有2个由36个氨基酸组成的ShKT结构域;种系发育进化树分析显示Tc-MUC-1与双胃线虫(Pristionchus pacificus; GenBank No. PDM76930)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans; GenBank No. NP491509)进化关系较近.     

续随子ElDGAT1基因的克隆、序列分析及表达特性

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是植物三酰甘油(TAG)合成最后一步反应的关键酶和限速酶,属于酰基转移酶超家族。为探究续随子(Euphorbia lathyris L.)中二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)对于调控种子油脂合成的作用机理,依据续随子转录组数据,采用RT-PCR技术分离和鉴定出一个 DGAT1基因(命名为 ElDGAT1),运用生物信息学方法对获得的序列进行分析,通过qPCR技术研究 ElDGAT1基因在续随子不同器官中的表达特性。结果表明:从续随子中克隆获得 ElDGAT1基因的cDNA序列,编码区长为1 530 bp,共编码509个氨基酸;预测ElDGAT1蛋白定位于内质网上,且为疏水性膜结合蛋白;其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,编码的蛋白含有9个典型的跨膜螺旋区。基于DGAT1蛋白的系统发育分析表明:续随子与乌桕的亲缘关系最近,与橡胶树和木薯的同源性次之。qPCR检测结果发现, ElDGAT1基因在续随子根中表达量最低,种子中的表达量相对较高,在花后15 d、30 d、45 d的表达量呈递增趋势。研究结果为进一步分析续随子种子油脂合成积累的调控机理及 ElDGAT1 基因的生物学功能提供依据。     

犬弓首蛔虫abcg-5基因的克隆及序列分析

研究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABC)亚家族G5基因(abcg-5)的分子特征.根据犬弓首蛔虫基因组数据库中的Tc-abcg-5基因序列设计引物,通过PCR技术克隆Tc-abcg-5全长基因,并进行多重序列比对和种系发育进化树分析.结果表明:该基因全长为1 902 bp,编码633个氨基酸.功能结构域分析发现TcABCG5蛋白包含1个ABC转运蛋白结构域和6个跨膜区,同时发现了高度保守的Walker A和Walker B模体. GO分析显示ABCG5具有ATP结合和ATP酶活性.种系发育进化树分析显示TcABCG5与猪蛔虫进化关系较近,与哺乳动物进化关系较远.     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。     

毛竹PePsbS1基因的分子特征及其原核表达

PsbS蛋白在植物非光化学淬灭(NPQ)中发挥着重要作用。采用同源比对方法从毛竹(Phyllostachys edulis)全长cDNA文库中得到1个PsbS同源基因序列(FP091683),命名为PePsbS1。该基因全长1 069 bp,具有多种光应答元件和参与光应答的顺式作用元件。PePsbS1的开放阅读框为807 bp,编码一个268 aa的蛋白。蛋白结构分析表明,该蛋白由转导肽(53 aa)和成熟蛋白(215 aa)组成,成熟蛋白包含1个叶绿素a/b结合蛋白功能域、4个跨膜区;疏水性分析表明该蛋白组成氨基酸以疏水性氨基酸为主,占42.5%;Blastp分析发现该蛋白与玉米的一致性最高,达80.3%。构建含有PePsbS1编码成熟蛋白序列的原核表达载体pET23a-PePsbS1-mature,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,分离纯化获得目的蛋白的分子量约为28 kD,与预测PePsbS1编码成熟蛋白的大小相符。这将有助于对竹子PsbS蛋白结构与功能的深入研究。     

疣粒野生稻半胱氨酸蛋白酶基因ME085的cDNA全长克隆及序列分析

为了发掘疣粒野生稻抗性基因,从受白叶枯菌诱导的疣粒野生稻叶片抑制差减文库(SSH文库)中选择抗病相关的EST序列,运用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得一个基因全长,命名为ME085。通过生物信息学分析表明该基因全长1 171bp,具有一个750bp的开放阅读框,编码249个氨基酸,其理论等电点为5.76,相对分子质量为27 580.1,存在一个明显的半胱氨酸蛋白酶结构域。推测该基因是一个半胱氨酸蛋白酶基因。     

偏肿革裥菌漆酶基因克隆及启动子序列分析

以优化后的漆酶培养基为基础,通过RT-PCR和RACE技术相结合,从偏肿革裥菌 Lenzites gibbosa 菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列,Genomic DNA大小为2 165 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和Genomic DNA的全长序列,发现该基因包含11个外显子和10个内含子.cDNA序列的全长为1 873 bp,其中包含一个完整的ORF,长度为1 563 bp,编码520个氨基酸.序列在氨基酸水平上与彩绒革盖菌 Trametes versicolor 的相似性评价最高,相似性达83%.通过SEFA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长986 bp的启动子序列.分析表明,该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box以及AP2等基本的转录起始元件外,还存在有多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括7个MRE元件、2个STRE元件、1个HSEs元件、7个氮因子结合位点等.这些结果表明,不同的外源诱导物可以调节偏肿革裥菌漆酶基因的表达.     

凡纳滨对虾繁育相关基因Allatostatin-AR的克隆与表达分析

咽侧体抑制素主要抑制昆虫咽侧体保幼激素的分泌,是昆虫体内重要的神经肽,在甲壳动物体内可能参与繁殖发育的调节。本研究利用RACE PCR技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)A型咽侧体抑制素受体(Allatostatin-A receptor,AST-AR)基因进行克隆,获得全长为2 650 bp的cDNA,包括1 425 bp的开放阅读框,1 170 bp 5''非编码区,55 bp 3''非编码区,编码474个氨基酸,形成具有7个跨膜区的不稳定亲水性蛋白。同源性和系统发育分析结果表明凡纳滨对虾AST-AR基因与斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示AST-AR氨基酸TM7后C末端精氨酸在不同物种之间高度保守。实时荧光定量PCR结果显示,AST-AR基因在雌、雄凡纳滨对虾多个组织(眼柄、脑、胃、肝胰腺、鳃、性腺、肠、肌肉)中均有表达,除脑组织外AST-AR基因在雌性凡纳滨对虾中相对表达量高于雄性。在幼体发育中,AST-AR基因的相对表达量随发育阶段上升,同时该基因在不同群体仔虾生长对比实验中表达量差异显著。据此推测AST-AR基因参与凡纳滨对虾的繁殖、幼体发育、幼虾生长到成虾,基因表达基本贯穿凡纳滨对虾的一生。     

山葡萄无色花色素双加氧酶基因（LDOX）cDNA的克隆与表达

为获得山葡萄LDOX基因的全长序列,采用RT-PCR与SMART RACE技术克隆LDOX基因,并对该基因进行生物信息学分析。结果显示,山葡萄LDOX基因全长1 353bp,其中开放阅读框(ORF)为1 068bp,编码355个氨基酸,氨基酸序列的分子质量为40.19ku,等电点为5.61;VAmLDOX基因(GenBank登陆号:FJ645769)属于双加氧酶基因家族,不含信号肽,VAmLDOX蛋白属于不稳定亲水蛋白,二级结构中随机卷曲含量最高;山葡萄VAmLDOX氨基酸序列与欧亚种葡萄、苹果、大豆、三花龙胆和紫苏等的同源性系数分别为99%、81%、80%、77%和75%;半定量RT-PCR分析显示,在山葡萄果实着色过程中,VAmLDOX在不同时期的果皮中均有表达,在转色期的叶片、茎、果肉中也均有表达,且表达量相近。