甘蔗PsbR亚基应答SCMV侵染及其与SCMV-6K2的互作

光系统II (Photosystem II, PSII)的PsbR亚基对于放氧复合体(oxygen-evolving complex)的组装和稳定具有至关重要的作用。本课题组前期克隆了甘蔗(Saccharum spp. hybrid)的PsbR亚基编码基因,命名为ScPsbR,并利用酵母双杂交技术(yeast two hybrid, Y2H)验证了ScPsbR与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)编码蛋白6K2的互作。本研究通过生物信息学分析表明,ScPsbR具有典型的PsbR亚基结构域,无信号肽,具有1个跨膜结构域,为稳定的疏水性蛋白。系统进化树分析表明,该蛋白在C3和C4植物中存在明显的分化。亚细胞定位试验表明, ScPsbR定位于叶绿体且与SCMV-6K2共定位。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)试验进一步验证了ScPsbR与SCMV-6K2的互作。实时荧光定量PCR检测表明,ScPsbR基因表达具有显著的组织特异性,在根和茎中表达极少,未成熟叶片和初衰叶中次之,成熟叶片中相对表达量最高;SCMV侵染显著影响ScPsbR基因表达,ScPsbR基因在侵染0～12 h显著上调,侵染1～5 d下调至略低于对照的水平,但差异不显著,侵染7～15 d显著下调。     

甘蔗NAD(P)H脱氢酶复合体O亚基基因克隆及其与甘蔗花叶病毒VPg互作

NAD(P)H脱氢酶(NDH)复合体介导循环电子传递,对于维持叶绿体高效的光合作用具有重要作用。甘蔗(Saccharum spp. hybrid)中NDH复合体应答及参与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)的侵染尚未见报道。本研究克隆了甘蔗NDH复合体的O亚基,命名为ScNdhO,其开放读码框(open reading frame, ORF)长度为471 bp,编码长度为156 aa的蛋白。生物信息学分析表明,ScNdhO为稳定的亲水性蛋白,不存在信号肽,无跨膜结构域;蛋白二级结构元件多为无规则卷曲,具有典型的NDH复合体O亚基结构域;系统进化树分析表明,该蛋白属于NDH复合体O亚基蛋白家族。实时荧光定量PCR分析发现,ScNdhO基因的表达具有明显的组织特异性,在成熟甘蔗叶片中的表达量最高,在茎中的表达量最低,在根中几乎不表达;ScNdhO基因在SCMV侵染早期上调表达,后期下调表达。亚细胞定位分析表明, ScNdhO定位于叶绿体。酵母双杂交(yeast two hybrid, Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescencecomplementation,BiFC)实验表明,ScNdhO与SCMV-VPg互作。推测ScNdhO被SCMV选择性利用,可能参与SCMV基因组复制及花叶病症状的产生。     

甘蔗类泛素蛋白UBL5应答SCMV侵染及其与SCMV-6K2的互作

泛素化修饰在蛋白功能调控、生长发育和逆境应答中具有重要作用。类泛素蛋白(ubiquitin-likeproteins,UBLs)是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的重要组分。本课题组前期利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)技术从甘蔗(Saccharumspp.hybrid)中分离鉴定了1个与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)编码蛋白6K2互作的类泛素蛋白UBL5,命名为Sc UBL5,长度为73aa。本研究利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验进一步证实了Sc UBL5与SCMV-6K2互作;生物信息学分析表明, Sc UBL5为稳定的亲水性非分泌蛋白,无信号肽和跨膜结构。系统进化树分析表明, Sc UBL5具有明显的种属特异性。亚细胞定位分析表明,Sc UBL5定位于细胞质和细胞核。实时荧光定量PCR分析发现,Sc UBL5基因的表达具有明显的组织特异性,在完成形态建成的正一叶、第7叶、根和第8节间...     

甘蔗VAMP相关蛋白ScPVA12与甘蔗花叶病毒P3N-PIPO的互作研究

植物囊泡膜蛋白相关蛋白PVA12 (plant vesicle-associated membrane protein (VAMP)-associated proteins homolog12)属于VAP27家族蛋白,在细胞中介导内质网囊泡运输以及膜融合。甘蔗(Saccharumspp.hybrid)PVA12应答甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)侵染尚未见报道。本研究从栽培种新台糖22号(ROC22)中克隆了PVA12基因,命名为ScPVA12。该基因开放读码框(open reading frame, ORF)的长度为735 bp,其编码长度为244 aa的蛋白。生物信息学分析表明,ScPVA12是一种不稳定的亲水性脂溶蛋白,C端具有跨膜结构域;二级结构中无规则卷曲占比最高;进化树分析表明,该蛋白在单子叶和双子叶植物中存在明显分化。酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)试验表明, ScPVA12与SCMV-P3N-PI...     

甘蔗Rieske Fe/S蛋白前体基因ScPetC的克隆及表达分析

细胞色素b6f复合体还原型铁硫蛋白前体(Cytochrome b6f complex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)是由细胞核PetC基因编码的蛋白,其成熟蛋白参与构成细胞色素b6f复合体,是电子传递的重要元件。基于前期构建的受高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)侵染的甘蔗转录组数据库,从主栽甘蔗品种‘新台糖22号’叶片中成功克隆到该基因,并命名为ScPetC (GenBank登录号为MH333037.1)。生物信息学分析发现, ScPetC基因cDNA全长824bp,包含了一个678bp的开放阅读框,编码226个氨基酸。ScPetC属于PRK13473超家族,其C末端具有典型的Rieske保守结构域;蛋白理论等电点为8.19,属于稳定的、亲水性蛋白;二级结构多为无规则卷曲,三级结构预测其比其他植物PetC多出一段α螺旋结构。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScPetC定位于叶绿体、细胞质和细胞膜。尽管前人研究表明, ScPetC的表达量会受SrMV侵染的影响,不同于半夏(Pinellia ternata) PetC与大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV) P1蛋白之间的互作, ScPetC不能与SrMV-P1蛋白互作,但能与甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV) P0蛋白互作。实时荧光定量PCR分析表明, ScPetC基因在甘蔗不同组织中均有表达,但在叶片中的表达量最高。甘蔗受脱落酸胁迫3 h时, ScPetC表达量显著上调,但是随着处理时间的延长,表达受到抑制;在茉莉酸甲酯、水杨酸、氯化铜、氯化镉和氯化钠胁迫下,ScPetC表达量均显著下调。本研究通过对ScPetC生物学功能、环境外源激素与重金属等胁迫下的表达模式及其与甘蔗病原病毒蛋白互作的初步探究,增加了对甘蔗PetC的了解,也为深入研究其在甘蔗受黄叶病毒侵染中的作用奠定基础。     

甘蔗E3泛素连接酶基因PRT1的生物信息学及表达模式分析

为探究甘蔗PROTEOLYSIS 1(PRT1)基因与黑穗病菌的互作关系，以甘蔗割手密种和栽培品种为研究对象，通过RT-PCR技术对ScPRT1(GenBank登录号：MT747433)基因进行克隆，生物信息学分析、定量PCR、亚细胞定位和基因共表达网络分析。生物信息学分析表明，该基因的cDNA全长为1 621 bp,包含一个长度为1 260 bp,编码419个氨基酸的完整开放读码框；其编码蛋白的分子量为46.56 ku,为酸性、不稳定的亲水蛋白，无信号肽，具有核定位信号；该蛋白包含2个RING结构域和1个ZZ结构域；ScPRT1蛋白的高级结构元件多为无规则卷曲。定量PCR结果显示，ScPRT1在皮、叶片、芽中的表达量相差不大，在蔗髓中表达量最高。同时该基因的表达受脱落酸胁迫后显著上调；受黑穗病菌胁迫后，在甘蔗抗黑穗病品种中上调表达，在感黑穗病品种中下调表达，都达到了显著水平。亚细胞定位结果揭示，ScPRT1定位于细胞核。寄主甘蔗和病原黑穗病菌的基因共表达网络中，与甘蔗ScPRT1共表达的黑穗病菌基因中，有3个为N端具有芳香族氨基酸残基的黑穗病菌效应蛋白，这暗示它们之间存在直接的相互作...     

甘蔗新基因ShHXT4克隆亚细胞定位及表达特征

以甘蔗品种新台糖22号为材料,利用同源克隆技术从甘蔗中分离出ShHXT4基因,以GADPH基因为内参,并采用实时定量RT-PCR分析该基因在甘蔗组织中的表达,同时构建亚细胞定位载体,通过农杆菌侵染洋葱表皮的方法对ShHXT4编码的蛋白进行亚细胞定位。研究分析发现该基因CDS序列长度为1 632 bp,编码540个氨基酸,蛋白的等电点(p I)为9.16,理论分子量为56.64 k D,命名为ShHXT4,基因编码多肽链中包含信号肽和12次跨膜结构域,且亚细胞定位于质膜,编码一种转运蛋白。洋葱表皮瞬时表达该基因GFP融合载体表明,ShHXT4定位于细胞膜,组织表达分析显示ShHXT4基因在根、茎和叶中均有表达,叶片中的表达量较高,暗示ShHXT4基因可能在甘蔗叶片糖分转运过程中扮演重要角色,研究结果为进一步研究ShHXT4基因的功能及应用提供帮助。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

甘蔗ScbHLH13基因的RT-PCR克隆与功能分析

bHLH转录因子是植物体内重要的调节因子,对植物的生长发育、次生代谢以及花青素生物合成等方面具有调节作用。本研究以高粱bHLH13(XM＿002440799.2)为探针序列,从甘蔗中通过RT-PCR克隆获得一个ScbHLH13基因,并对其在不同胁迫响应转录组数据中进行表达模式分析,同时对该基因及其所编码蛋白进行了理化性质预测以及系统进化、原生质体亚细胞定位和实时荧光定量PCR表达量分析。结果显示,ScbHLH13所编码蛋白包含586个氨基酸残基,以无规则卷曲和α螺旋为主,亲水且不稳定,呈弱碱性;具有典型核定位信号,无跨膜结构;其序列内包括bHLH-MYC、HLH 2个典型保守结构域,属于bHLH超家族成员。在系统进化中ScbHLH13属于Ⅲ (d+e)类组,与高粱亲缘关系最近。在转录组数据中, ScbHLH13的表达在甘蔗品种ROC22上受低氮胁迫和黑穗病菌侵染抑制,轻微受高粱花叶病毒侵染诱导;而在Badila受低氮、在YC05-179受甘蔗黑穗病菌侵染诱导。亚细胞定位结果显示,在烟草表皮细胞中瞬时表达ScbHLH13定位于细胞核和细胞膜,在甘蔗原生质体瞬时表达ScbHLH13则定位于...     

甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一, 在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库, 从新台糖22 (ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因, 命名为ScWRKY4 (GenBank登录号为MG852087)。序列分析发现, ScWRKY4基因cDNA全长1265 bp, 包含1个741 bp的完整开放读码框, 编码246个氨基酸, 该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域, 属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现, ScWRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白, 不存在信号肽和跨膜结构域, 蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScWRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示, ScWRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明, ScWRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异, 在蔗肉中的表达量最高, 为对照蔗根的18.38倍; 黑穗病菌侵染0~72 h, ScWRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达, 在感病品种ROC22中表达较稳定; 受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后, ScWRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明, ScWRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用, 但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。     

甘蔗ScCRT1基因克隆及其应答SCMV侵染分子机制的研究

Calreticulin (CRT) is widely expressed in eukaryotes. As a molecular chaperone and a Ca²⁺ binding protein, CRT is involved in many biological pathways such as the regulation of calcium homeostasis, calcium-dependent signaling, endoplasmic reticulum quality control, plant growth and development, immunity and response to stress. However, the response of CRT of sugarcane (Saccharum spp. hybrid) challenged by Sugarcane mosaic virus (SCMV) has not been reported. In this study, a CRT gene was cloned from the noble cane cultivar Badila (S. officinarum) and designed as ScCRT1. ScCRT1 had an open reading frame (ORF) length of 1281 bp and encoded 426 amino acids. Bioinformatics analysis showed that ScCRT1 was a stable hydrophilic protein and possesses a signal peptide at the N-terminal, a typical transmembrane domain, and a typical endoplasmic reticulum location signal at the C-terminal. The secondary structure of ScCRT1 was composed of mostly random coils. Phylogenetic tree analysis indicated that ScCRT1 belonged to the CRT1/CRT2 subtype and was divergent between monocotyledons and dicotyledons. Subcellular location assays showed that ScCRT1 was mainly located in the endoplasmic reticulum. Real-time quantitative PCR analysis showed that ScCRT1 gene was extensively expressed in different tissues of sugarcane, with the highest expression in leaf roll and the lowest expression in the 8th internode. ScCRT1 gene was up regulated in the early stage of SCMV infection, but down regulated with time going. ScCRT1 interacted with the 6K2 from SCMV as confirmed by yeast two hybrid and bimolecular fluorescence complementation assays. Based on these foundlings, we speculated SCMV interfered the calcium homeostasis by the interaction of 6K2 with ScCRT1, thereby facilitating viral infection of sugarcane.     

甘蔗PsbS亚基应答甘蔗花叶病毒侵染及其与6K2蛋白的互作研究

Non-photochemical quenching (NPQ) is the main mechanism of photoprotective regulation in higher plants. The PsbS subunit of Photosystem II (PSII) plays a key role in NPQ. The involvement of PSII PsbS subunit in Sugarcane mosaic virus (SCMV) infection of sugarcane (Saccharum spp. hybrid) has not been reported. In the previous research, we cloned the coding sequence of the PsbS subunit from sugarcane and designated it as ScPsbS. ScPsbS had an open reading frame (ORF) length of 798 bp and encoded a protein of 265 aa. Bioinformatics analysis showed that ScPsbS was a stable hydrophobic protein with chloroplast localization signals and four transmembrane domains. The ScPsbS protein possesses a typical domain of PsbS protein. Phylogenetic tree analysis showed that ScPsbS was divergent between monocotyledons and dicotyledons, or C₃ plants and C₄ plants. Subcellular localization analysis showed that ScPsbS was located in chloroplasts and partially colocalized with SCMV-6k2 in chloroplasts. The interaction of ScPsbS with the SCMV-6K2 was further confirmed by bimolecular fluorescence complementation assays (BiFC). ScPsbS gene showed obvious tissue specificity in sugarcane tested by real-time quantitative PCR analysis. ScPsbS gene had highest expression in mature leaves, followed by immature leaves and leaves beginning to senesce, and hardly expressed in stems and roots. The expression of ScPsbS gene was significantly affected by SCMV infection, with significant upregulation in the early stage of SCMV infection, and no significant affection in the later stage of SCMV infection.     

玉米抗甘蔗花叶病毒的遗传分析

选用2个抗病自交系（黄早四、Pa405）与2个感病自交系（掖107、Mo17）配制4套杂交组合,通过对双亲、F1、F2及回交群体苗期植株叶片危害度和成株期植株病级的调查分析,研究了玉米抗甘蔗花叶病毒的遗传规律。结果表明,苗期和成株期玉米杂交组合F1的抗感程度与遗传背景有关,抗性遗传不符合加性-显性模型。掖107组配的两个组     

抗甘蔗花叶病毒的无标记反向重复转基因玉米

构建了无标记基因的源自玉米矮花叶病的主要病原——甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus, SCMV)复制酶基因的反向重复序列表达载体,通过农杆菌介导法以该表达载体和除草剂标记基因表达载体共转化玉米自交系综3的幼胚,用除草剂梯度筛选,获得了可育的再生株。对T₁和T₂代群体作PCR和DNA点杂交,结合温室和田间人工接种病毒进行抗病性鉴定,获得了比较稳定的对SCMV高抗的无标记转基因玉米株系。     

反义外壳蛋白基因介导的抗SCMV转基因玉米研究

玉米矮花叶病（MDM）是一种世界性病害，在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)所致。为探索一条高效、安全的抗SCMV转基因途径，构建了无标记基因的SCMV反义外壳蛋白基因（cp）表达载体pACP。通过冻融法将该载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农杆菌LBA4404,然后共转化玉米自交系综3的幼胚。通过除草剂梯度筛选，从抗性愈伤组织分化获得了35株再生苗。PCR检测证明，其中26株带有抗除草剂标记基因（bar），14株带有SCMV反义cp基因。这14株带有目的基因的玉米植株自交，其种子在田间种植成株行（T₁代）。玉米T₁代幼苗人工接种SCMV，筛选出2个抗病株率高于70%的株行。ELISA检测表明，抗病株SCMV含量极低，抗性达高抗水平。PCR检测表明，抗病性是反义cp基因作用的结果，并且获得了2株cp基因阳性而标记基因阴性的抗病株。     

复合侵染甘蔗的病原病毒RT-PCR检测

根据甘蔗花叶病毒（sugarcane mosaic virus,SCMV）、高粱花叶病毒（sorghum mosaic virus,SrMV）和甘蔗黄叶病毒（sugarcane yellow leaf virus,SCYLV）外壳蛋白（CP）基因序列分别设计合成3对特异引物SCMV–F/R、SrMV-F/R和SCYLV-F/R,以表现花叶和黄叶复合症状的甘蔗叶片总RNA为模板,分别进行3种病毒单一RT-PCR检测,在SrMV和SCYLV特异引物RT-PCR反应体系中分别扩增到约850 bp和630 bp特异性片段。序列测定及同源性比对结果显示,850 bp片段测序所得序列与浙江象山、临平和余杭SrMV分离物（GenBank登录号分别为AJ310194、AJ310195和AJ310198）对应序列同源性95%,630 bp片段测序所得序列与广东、广西、福建SCYLV分离物（GenBank登录号分别为GU190165、GU190162、GU190159）对应序列同源性99%,表明该样品同时感染SrMV和SCYLV。在此基础上建立同时检测SrMV和SCYLV的一步双重RT-PCR体系,可检测10-6 g病叶组织中的病毒,田间样品检测效果良好。     

甘蔗乙烯信号转导途径关键基因CTR1的克隆与表达分析

为了研究CTR1基因与甘蔗糖分积累的关系,本研究利用同源克隆的方法,以甘蔗品种‘桂糖28’(GT28)幼嫩叶片的cDNA为模板,成功克隆得到2103 bp的甘蔗CTR1基因(ScCTR1;GenBank登录号为MK158246)。ScCTR1基因的开放阅读框(ORF)序列长1656 bp,编码551个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为62.78 kD。ScCTR1蛋白具有CTR1同源蛋白典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,ScCTR1基因在茎和叶中都有表达,在茎中其表达量呈先增加后降低的趋势,在未成熟叶、成熟叶和老叶中,其基因表达呈降低的趋势。本研究结果对阐明乙烯调控甘蔗茎糖分积累和叶发育的机理提供了重要的参考依据。