陆地棉GhBI-1基因在拟南芥中的异位表达及耐盐性研究

前期工作中,我们从陆地棉基因组中分离了GhBI-1基因全长cDNA,构建了GhBI-1过量表达载体并转化拟南芥。本研究在此基础上,利用卡那初步筛选获得转基因拟南芥,通过PCR进一步验证,得到具有卡那抗性并且遗传稳定的T3代纯合株系。利用不同浓度NaCl处理野生型和转GhBI-1基因拟南芥,结果表明,转基因拟南芥在200 mmol/L NaCl胁迫后,萌发率和生长情况要好于野生型拟南芥,过量表达GhBI-1基因能够提高拟南芥耐受盐胁迫的能力。     

陆地棉两个GhBI-1基因的生物信息学分析

BI-1基因是广泛存在于真核生物、原核生物和病毒中的一个保守性基因,具有抑制细胞凋亡的作用。本研究对克隆到的两个陆地棉BI-1基因——GhBI-1a和GhBI-1b进行生物信息学分析,发现其与拟南芥BI-1有很高的同源性,尤其羧基尾极为相似。GhBI-1a有6个跨膜区域,GhBI-1b有7个跨膜区域,它们的二级结构也与其他物种的BI-1相似,跨膜区域基本都是α螺旋。     

棉花E3泛素连接酶基因GhRING1-like的克隆及功能分析

[目的]RING(really interesting new gene) finger E3泛素连接酶在植物生长发育和抵御环境胁迫中具有重要作用。克隆棉花RING finger E3泛素连接酶基因GhRING1-like并分析其表达特征和功能,为该基因分子作用机制研究和育种应用奠定基础。[方法]根据棉花表达谱分析,选取并克隆干旱胁迫处理上调表达基因GhRING1-like,qRT-PCR分析GhRING1-like的组织表达特性及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式;采用瞬时表达对GhRING1-like-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析;通过获得病毒介导的基因沉默(VIGS)棉花和过表达拟南芥植株,分析沉默或过表达GhRING1-like对植株生长发育及其抗旱性的影响。[结果]GhRING1-like基因序列全长996 bp,编码332个氨基酸,其C端含有RING-H_2(C3H_2C3)结构域。GhRING1-like定位于内质网上。GhRING1-like在叶片中优势表达; 200 g·L~(-1)PEG6000诱导处理1 h后瞬时显著上调表达12倍; GhRING1-like对Na Cl、ABA和SA的响应时间都在处理后3 h,上调表达均在5倍左右。干旱胁迫处理后,VIGS沉默GhRING1-like棉花叶片相对含水量和叶绿素荧光参数Fv/Fm分别较未沉默对照降低17.1%和30.6%,而电解质渗透率和丙二醛含量分别较对照提高70.8%和100%。过表达GhRING1-like显著提高了拟南芥种子萌发和幼苗期对于甘露醇引起的渗透胁迫的耐受性;可使营养生长中后期阶段的拟南芥在水分亏缺处理下的存活率提高2.4倍;转基因拟南芥叶片气孔开度降低51.2%,失水率明显降低。干旱胁迫下,过表达GhRING1-like使依赖于ABA诱导表达的At AREB1、At ERD15、AtRD29A上调表达,而对不依赖ABA的干旱胁迫诱导基因At DREB和脯氨酸合成基因At PLD没有影响。[结论]棉花GhRING1-like参与了植物非生物胁迫抗性的调控,主要通过依赖于ABA通路正向调控植物的抗旱反应。     

植物OST1基因功能研究进展

植物在生长过程中会遭受各种逆境胁迫,环境胁迫会引起植物体内一系列的信号反应,其中脱落酸(ABA)信号途径是一条重要的胁迫应答途径。作为ABA信号通路中的蛋白质激酶之一,气孔开放因子1(Stomatal opening factor 1,OST1)在植物逆境应答反应中扮演重要角色。因此,研究OST1基因在植物逆境应答中的功能有助于阐述植物耐逆分子机制。从OST1的相互作用因子及其在信号通路中的调控作用等方面进行阐述,对其介导的逆境应答机制进行了系统总结。     

陆地棉GhNAC1基因的克隆及抗黄萎病功能分析

黄萎病是造成棉花品质与产量下降的重要原因之一，探索棉花抗病机制对推动生态农业的可持续发展具有深远意义。在黄萎病菌胁迫的陆地棉ND601根组织全长cDNA文库中，筛选到1个与黄萎病胁迫相关的植物特异NAC转录因子基因，将其命名为GhNAC1。该基因cDNA序列全长1 213 bp，开放阅读框840 bp，编码279个氨基酸。GhNAC1没有信号肽和跨膜结构，定位在细胞核。qRT-PCR分析结果表明，GhNAC1受黄萎病菌胁迫后在根部特异表达，显著上调，表达量在抗性品种中显著高于感病品种。GhNAC1沉默后棉花对黄萎病抗性降低，水杨酸路径标志基因（PAD4、NDR1、NPR1和PR1）表达量降低，以上结果表明GhNAC1可能通过调控水杨酸信号通道参与棉花黄萎病抗性。     

干旱胁迫下油菜素内酯浸种对棉花种子萌发期NAC转录因子表达的影响

【目的】研究干旱胁迫下油菜素内酯浸种棉花种子萌发期NAC转录因子的表达变化,分析NAC转录因子在油菜素内酯(brassinolide,BR)调控棉花抗旱中的作用。【方法】根据陆地棉转录因子NAC家族的基因序列,扩增获得棉花新陆早17号NAC家族中的6个NAC基因(Gh NAC1-6)。实时荧光定量PCR检测干旱胁迫下不同油菜素内酯浸种后,棉花种子萌发期子叶和胚根NAC基因的表达变化。【结果】棉花子叶中的Gh NAC1在干旱胁迫下受不同浓度油菜素内酯的抑制,Gh NAC2和Gh NAC3受0.25 mg/L油菜素内酯诱导表达,Gh NAC5只受0.5 mg/L油菜素内酯诱导表达,而Gh NAC4和Gh NAC6表达无显著变化。在棉花胚根中,Gh NAC1同样受不同浓度油菜素内酯的抑制,Gh NAC2和Gh NAC3受0.25 mg/L油菜素内酯诱导,同时Gh NAC3在2 mg/L油菜素内酯浸种也呈现高表达,Gh NAC5无显著变化,Gh NAC4和Gh NAC6则受高浓度油菜素内酯诱导表达。【结论】棉花种子萌发期在干旱胁迫下,棉花种子萌发期子叶和胚根的Gh NAC1的表达受油菜素内酯抑制,Gh NAC2和Gh NAC3受低浓度油菜素内酯的表达诱导,油菜素内酯能够影响Gh NAC的表达响应干旱胁迫。     

棉花中一个新的类DREB转录因子(GhDREB2B)的克隆、序列特征及表达分析

棉花是盐碱地改良的重要作物。文章利用盐胁迫处理棉花耐盐品种‘中棉所49’,筛选棉花EST数据库并对目标EST序列进行整合与分析,利用RT-PCR的方法,克隆了一个新的棉花类DREB转录因子,命名为GhDREB2B(GenBank登录号为GQ848094)。该基因编码351个氨基酸残基,分子量约39 kD,推导的氨基酸序列与杨树、番茄、大豆、拟南芥等物种中的DREB基因家族成员之间存在一定程度的同源性,均含AP2/ERF保守结构域,推测该基因在棉花中是一个新的DREB类转录因子。利用荧光定量RT-PCR对该转录因子表达特征的分析表明：GhDREB2B在棉花苗期经盐胁迫诱导后表达量迅速升高,在0.7%的NaCl胁迫诱导下,表达量达到最高值,但该转录因子并不受ABA的诱导。推测GhDREB2B在棉花受到干旱和盐胁迫条件下发挥重要功能。     

非生物胁迫诱导拟南芥中防御基因表达的分子机制

以缺水处理、低温胁迫和盐胁迫的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物作为试验材料,采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR),检测水杨酸(SA)途径调控基因AtACD6和下游防御基因AtPR5的表达水平。分析结果证实了非生物胁迫处理的植物中这些防御基因的表达水平明显增加。亚硫酸盐测序结果证明非生物胁迫诱导AtACD6基因启动子区域的DNA去甲基化,导致该基因的转录激活。进一步研究证实,沉默抑制因子1(ROS1)介导的DNA去甲基化,在低温诱导AtACD6基因表达的过程中起重要作用。揭示了植物水杨酸途径防御基因应答非生物胁迫相关的分子机制中ROS1起重要作用,为探索植物适应不利环境的表观调控机制提供参考。     

棉花GhSEDEG38基因调控棉花耐盐性的功能分析

基于棉花体细胞胚胎再生不同时期表达谱中筛选出一系列差异表达转录因子,通过RT-PCR和qRT-PCR分析这些转录因子在不同逆境处理下的表达,发现GhSEDEG38基因(somatic embryogenesis differencially expressed gene 38)的表达受盐胁迫诱导明显上调;序列分析发现GhSEDEG38编码bZIP型转录因子,与拟南芥bZIP53基因同源。为进一步验证该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,通过分子检测获得了表达量显著降低的转基因棉花株系。通过对萌发期和三叶期转基因材料和对照材料进行盐处理发现,干涉GhSEDEG38基因降低棉花在萌发期及苗期对盐胁迫的抗性,盐处理后转基因植株的MDA含量和活性氧含量显著高于对照材料,而可溶性糖含量显著低于对照材料。综上,GhSEDEG38参与棉花对盐胁迫的应答。     

马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。     

MdCYP707A1异位表达拟南芥参与非生物胁迫和ABA应答

ABA能够增强植物在逆境条件下的抗性,使植物减少逆境伤害。作为主要的植物调节激素,ABA可以通过信号途径和生物合成降解途径参与植物生理过程的调控,为了探索和完善ABA调节途径,我们克隆了MdCYP707A1,并将其通过农杆菌介导的遗传转化的方法,在拟南芥中异位表达,通过GUS染色和抗性研究实验分析MdCYP707A1的功能,组织表达定位发现其在各个组织中广泛表达;将MdCYP707A1的过表达拟南芥在PEG、ABA等抗性培养基上处理10 d,表型分析发现,过表达MdCYP707A1降低对ABA敏感性,以及渗透胁迫和盐胁迫的抗性,但增强对镉胁迫的抗性,此外,我们发现,在镉处理条件下谷胱甘肽还原酶(AtGR1)和超氧化物歧化酶(AtFeSOD)基因的表达也显著提高,说明ABA参与不同抗性的调控。     

bZIP转录因子在植物激素介导的抗病抗逆途径中的作用

植物体内有一套复杂精细且交叉调控的激素信号网络,在植物应对不良环境胁迫的过程中起着至关重要的作用。bZIP转录因子作为基因表达的关键调控因子,在植物抗病抗逆相关基因的表达中行使着重要的功能。文章首先介绍了bZIP转录因子的结构和功能,阐述了其在几种主要的激素抗性调控途径中的作用机理,之后对各种激素信号通路之间的交叉调控途径及其关键调控节点蛋白进行了概括,以期阐明植物激素介导的抗性调控网络,并为新的抗性相关基因的挖掘和利用提供理论依据。     

紫花苜蓿NAC类转录因子基因MsNAC2的克隆及其功能分析

【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因MsNAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解MsNAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿MsNAC2全长序列,并进行生物信息学分析。应用real-time PCR技术分析该基因在非生物胁迫下的时空表达特征。构建MsNAC2-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。同时构建pBI121-MsNAC2植物超表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶盘,比较逆境胁迫条件下野生型烟草和转基因株系的表型和生理指标,鉴定超表达MsNAC2对烟草耐逆能力的调控效应。【结果】MsNAC2全长1 358 bp,开放阅读框长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,编码蛋白质分子量为39.4 kD,其N端含有典型的NAC保守结构域,C端高度变异。进化树聚类分析表明,该基因与脐橙CsNAC亲缘关系较近,属于NAC蛋白的ATAF亚家族。洋葱亚细胞定位分析表明MsNAC2定位于细胞核。转录水平表达分析表明MsNAC2受250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000、0.1 mmol·L^-1 ABA和4℃胁迫诱导而显著升高,并且MsNAC2在根中的表达量要明显高于在叶中的表达量。抗性试验结果显示,在NaCl、PEG和4℃冷害胁迫下,转基因烟草苗高、根长、鲜重和干重等生长指标均高于野生型。生理指标检测结果表明,在250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000和4℃处理24 h后,转基因烟草叶片丙二醛含量明显低于野生型烟草,分别为野生型的82.6%、73.2%和77.8%。脯氨酸含量高于野生型烟草,分别达1.52倍、1.72倍和2.24倍,且SOD和POD的活性均高于野生型烟草,分别为野生型的1.101倍、1.105倍、1.33倍和1.12倍、1.08倍及1.19倍。【结论】从紫花苜蓿中克隆了一个新的NAC转录因子基因MsNAC2,该基因能够对盐、冷害和干旱胁迫产生响应,与野生型烟草相比,过量表达MsNAC₂烟草具有较强的耐盐、抗旱和抵御寒冷的能力,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。     

白桦BpPAT1基因的表达模式及耐盐性分析

  目的  GRAS家族是植物特有的具有高度保守羧基末端的转录因子家族,已有研究表明GRAS转录因子是植物胁迫反应中关键的转录调节因子之一。本研究拟对白桦中GRAS转录因子基因BpPAT1基因是否具有耐盐能力进行分析,为阐明白桦GRAS转录因子响应盐胁迫的分子调控机制奠定基础,进一步丰富木本植物GRAS转录因子响应逆境胁迫分子机制的研究。  方法  从盐胁迫白桦转录组数据中筛选并获得了1条GRAS转录因子基因,将其命名为BpPAT1。利用蛋白多序列比对及系统进化树来分析BpPAT1与其他GRAS家族蛋白的亲缘关系。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析盐胁迫及非胁迫条件下白桦根、茎和叶组织中BpPAT1的表达模式,初步鉴定其是否响应盐胁迫。为了进一步分析BpPAT1的抗逆功能,构建其植物过表达载体（pROKII-BpPAT1）与抑制表达载体（pFGC5941-BpPAT1）,利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系,获得BpPAT1基因瞬时过表达、抑制表达及对照白桦植株。在盐胁迫下分别对BpPAT1瞬时表达及对照植株的耐盐相关生理指标进行测定,鉴定BpPAT1是否能调控白桦的耐盐能力。  结果  多序列比对及系统进化树分析结果表明BpPAT1蛋白具有GRAS家族的序列特征,且与拟南芥中AtPAT1蛋白的亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明:在盐胁迫6 h后,BpPAT1在白桦植株中的表达量显著上升（P < 0.05）,说明该基因能响应盐胁迫。抗逆生理指标的测定结果表明:在白桦中过表达BpPAT1能够使过氧化物酶（POD）及超氧化物歧化酶（SOD）活性显著增强（P < 0.05）,同时增加了白桦组织中的脯氨酸含量,降低了电解质渗透率及丙二醛含量。  结论  白桦BpPAT1基因能响应盐胁迫,过表达BpPAT1显著增加了白桦POD、SOD酶活性和脯氨酸含量,降低了电解质渗透率及丙二醛含量,进而提高了ROS清除能力,有效增强了白桦的耐盐能力。      

海岛棉GbWRKY53基因的克隆与表达分析

黄萎病被称为棉花的"癌症",挖掘和鉴定抗病相关基因是棉花抗黄萎病分子育种的基础。WRKY转录因子在植物对生物和非生物胁迫应答过程中起重要调控作用。从高抗黄萎病品种海岛棉Pima90-53中克隆了WRKY转录因子Gb WRKY53,其开放阅读框(open reading frame,ORF)为999 bp,编码332个氨基酸,含有1个WRKY结构域及HXC型锌指结构,属于WRKY转录因子家族的第Ⅲ组。基因结构分析表明,Gb WRKY53基因有3个外显子和2个内含子。系统进化分析表明,Gb WRKY53与雷蒙德氏棉(Gossypiumr aimindii)Gr WRKY53的亲缘关系最近。当黄萎病菌诱导后,Gb WRKY53基因表达量呈先增加后降低的变化趋势,处理后12 h其表达量达到最大;水杨酸(SA)诱导后,Gb WRKY53表达量在8 h明显增加,且一直持续增高到24 h;而茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,Gb WRKY53表达量在12 h达到最高值随后下降,且其表达水平明显低于同时间水杨酸诱导后的表达量。1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)诱导后,Gb WRKY53基因表达量仅微量上调。由此推断,Gb WRKY53基因可能参与了复杂的植物信号途径并在棉花抗黄萎病菌胁迫应答中起重要作用。     

水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析

TCP转录因子家族是植物特异的一类调控生长发育和逆境胁迫的重要转录因子。本文揭示了水曲柳FmTCP4在非生物胁迫及激素信号诱导调控的表达特征,为该基因在水曲柳中调控生长发育以及逆境胁迫响应功能的研究奠定基础。通过前期研究克隆获得了水曲柳TCP4基因序列,并命名为FmTCP4,应用生物信息学软件对水曲柳FmTCP4基因的分子结构特征进行了分析,利用4 ℃低温、盐(NaCl)以及干旱(PEG6000)进行非生物胁迫处理,利用脱落酸(ABA)和赤霉素(GA₃)进行激素信号诱导,分析FmTCP4基因的表达特征。生物信息学分析表明该基因全长1 251 bp,具有完整的开放阅读框,编码416个氨基酸。FmTCP4具有螺旋-环-螺旋结构,为亲水性的不稳定蛋白,不存在信号肽,具有跨膜能力,亚细胞定位预测存在于细胞核中,并在细胞质到细胞核的调控中起作用。同源序列比对结果表明,FmTCP4与芝麻、烟草等物种的同源蛋白序列相比具有很高的同源性。非生物胁迫处理后,FmTCP4的表达量随处理时间而改变,但其变化趋势不同,表明FmTCP4明显响应了这3种非生物胁迫。激素信号诱导结果表明,外源植物激素调控了FmTCP4基因的表达,基因表达量相对于对照组具有显著性差异。非生物胁迫和激素信号诱导下的基因表达分析表明,FmTCP4响应了寒冷、盐、干旱等非生物胁迫以及激素信号,说明其参与了植物的生长发育和逆境胁迫的平衡。      

SLB9基因沉默对番茄抗旱性的影响

SLB9基因是BES1转录因子家族中的一员,BES1在调控油菜素内酯(BR)基因响应中发挥关键作用。研究证明BES1基因受多种胁迫诱导,介导BR信号,调节植物耐旱等抗逆性。采用基因沉默(VIGS)技术,通过农杆菌介导法构建SLB9基因沉默植株,干旱胁迫处理沉默植株,通过观察沉默植株与对照植株表型差异及生理生化指标变化,研究SLB9基因表达变化对番茄抗旱性的影响。结果表明,SLB9基因沉默植株抗旱性明显低于对照植株,推测SLB9基因下调表达降低番茄抗旱性。     

绿僵菌菌株MAX-2在应答胁迫过程中Hog1基因的表达

【目的】通过分析在逆境胁迫过程中绿僵菌菌株MAX-2的Hog1基因的转录表达,为揭示该菌株耐逆特性的分子机理提供理论依据。【方法】将具有不同耐逆能力的3个绿僵菌菌株MAX-2、BUM2495和BUM723的分生孢子分别用盐处理(0.4、0.8 mol/L Na Cl)和紫外线照射(5、15 min),测定孢子萌发率,并提取RNA,通过半定量RT-PCR方法分析其Hog1基因的转录表达差异。【结果】从盐和紫外线逆境条件下菌株的孢子萌发率可以看出:这3个菌株的耐逆性能为MAX-2BUM2495BUM723,菌株间的差异都达到了极显著水平(P0.01)。盐处理和紫外线辐射都能诱导绿僵菌Hog1基因的表达上调,不同菌株表达差异较大,MAX-2表达水平最高,BUM723表达水平最低。在较低程度的胁迫条件下(0.4 mol/L Na Cl和紫外线照射5 min),MAX-2的表达水平略高于BUM2495,而在较高程度的胁迫条件下(0.8 mol/L Na Cl和紫外线照射15 min)MAX-2的表达水平明显高于BUM2495,表明Hog1基因在较高程度压力条件下的高效表达与MAX-2的耐逆能力密切相关。【结论】绿僵菌菌株MAX-2较高的耐逆能力与其Hog1基因的高水平转录表达相关。     

转GhGST基因的棉花植株的获得

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)受黄萎病菌诱导表达,对黄萎病具有抗性。为明确该基因在棉花中抗黄萎病功能,本研究在前期工作基础上,以陆地棉Coker312为受体,利用农杆菌介导的茎尖转化法对GhGST基因进行遗传转化,共获得132株卡那霉素抗性植株,利用PCR检测以及胶回收测序进一步确定了11株稳定的转基因阳性棉植株。转基因植株的获得为后续GhGST基因功能研究及棉花新品种培育提供了基础材料。