十字花科植物中低芥酸野生种的发掘和FAE1基因的功能验证

 【目的】发掘低芥酸野生种,并探明这些野生种的低芥酸遗传机理。【方法】本研究采用同源序列法从野生种和甘蓝型油菜中分离FAE1序列。用酵母系统异源表达野生种的FAE1。用气相色谱法分析脂肪酸组成。【结果】比较FAE1序列发现5个野生种的FAE1序列与甘蓝型油菜的FAE1同源性高于85%。分析它们编码的蛋白质序列,发现5个野生种在第282位氨基酸残基处都是丝氨酸,而且与酶活性相关的氨基酸残基（Cys223、His302、His387、His391和His420）都没有发生突变,这些特征与报道的高芥酸油菜品种相同,不同于低芥酸油菜。Western Blot分析发现野生种的FAE1都在酵母系统中获得了表达,转化诸葛菜和荠菜FAE1的酵母并未合成长链脂肪酸,而转化新疆野芥、新疆白芥和菘蓝的FAE1的酵母都有微量长链脂肪酸的合成。【结论】诸葛菜和芥菜确为低芥酸野生种,而且其低芥酸性状源于FAE1编码产物的失活。     

三种乳化增稠剂对花生乳稳定性的研究

主要研究瓜尔豆胶、亚麻籽胶、蔗糖脂肪酸酯三种乳化增稠剂对花生乳稳定性的影响,以不添加稳定剂的花生牛奶为对照组,测定花生乳的稳定系数、黏度、离心沉降率、油脂析出率,通过单因素实验筛选出瓜尔豆胶、亚麻籽胶、蔗糖脂肪酸酯的最适量分别是0.08%、0.1%、0.1%;然后通过三因素三水平的正交实验,以稳定系数、油脂析出率为测试指标,优化出了花生乳复合稳定剂适宜配比为:瓜尔豆胶0.08%、亚麻籽胶0.10%、蔗糖脂肪酸酯0.1%。用此复合稳定剂加工的花生乳稳定性大大增加,稳定系数为97.32%,油脂析出率为2.00%,且无明显的沉淀。本研究的目的是为花生乳的工业化生产所需的安全、高效复合稳定剂的开发提供思路。     

利用甘蓝型油菜高密度SNP遗传图谱定位油酸、 亚麻酸及芥酸含量QTL位点

【目的】菜籽油包括多种脂肪酸组分,提高油酸（C18:1）含量,降低亚麻酸（C18:2）和芥酸（C22:1）含量是油菜育种改良和遗传研究的重要目标。本研究利用刚开发的油菜60K芯片构建的高世代重组自交系群体遗传连锁图谱,对3个不同环境中影响甘蓝型油菜品质的油酸、亚麻酸及芥酸含量进行QTL定位分析,研究结果可对脂肪酸组分QTL位点在不同的群体之间准确比较分析。【方法】以高芥酸亲本GH06为母本和低芥酸亲本P174为父本构建高世代重组自交系,分别于2008年在德国吉森、德国霍亨里特及2009年德国吉森3个不同的环境中设置田间试验,收获自交种子,采用近红外分析方法3次重复对种子的脂肪酸组分进行分析。利用油菜60K芯片对重组自交系群体进行基因型分析,DNA样品预处理及芯片处理严格按照Illumina Inc公司Infinium HD Assay Ultra操作说明进行。取最小阈值LOD 5.0利用MSTmap软件构建遗传图谱。QTL定位所用的遗传图谱包括2 756个SNP位点,覆盖甘蓝型油菜基因组1 832.4 cM。利用Windows QTL Cartographer复合区间作图法对油酸、亚麻酸及芥酸含量进行QTL定位。【结果】在3个环境中,油酸和芥酸含量均表现为极显著负相关,相关系数均达到-0.95,且表现为主基因控制的性状,芥酸和亚麻酸表现负相关,油酸与亚麻酸表现正相关。3个性状在3个环境中共检测到14个QTL,在A08和C03上都检测到油酸和芥酸含量重叠的主效QTL位点。在3个环境中,油酸主效QTL位点解释表型变异19%-31%,芥酸主效QTL位点解释表型变异19%-34%,两者表现加性效应相反。A08和C03染色体上的芥酸主效QTL位点加性效应在3个环境中为7.6到9.6,加性效应来自低油酸、高芥酸亲本GH06。亚麻酸属于典型的数量性状,受环境影响较大,在3个环境中检测到不同的微效QTL位点,解释表型变异3%-12%。遗传图谱与物理图谱比较分析发现,脂肪酸去饱和酶FAD2基因位于亚麻酸QTL qA05C18:3的置信区间,而脂肪酸延长酶FAE1基因位于芥酸QTL qA08C22:1的置信区间。【结论】利用该套油菜60K芯片准确定位了油酸、亚麻酸及芥酸QTL位点,位于A08和C03染色体上的芥酸主效QTL位点同时也是油酸的主效QTL位点,该研究结果有利于不同群体在使用该套SNP芯片分析及对脂肪酸组分定位后准确比较分析。     

菜籽油不同加工工艺对脂肪酸组分含量的影响

为了分析不同加工工艺对菜籽油脂肪酸各组分含量的影响,从市场收集到57个品牌食用菜籽油,通过气相色谱法分析了每个油的脂肪酸含量,比较了不同制油方法和不同精炼等级所获得菜籽油中脂肪酸组分含量的差异。研究表明,浸出法处理对脂肪酸的损失较小,油酸、亚油酸和亚麻酸等脂肪酸含量均比压榨法高,而芥酸的含量则低于压榨法。菜籽油的精炼等级越高,油酸和亚油酸含量越高,而亚麻酸和花生烯酸的含量则越低,芥酸含量下降的最为明显,一级菜籽油芥酸含量低于1%。本结果为改进菜籽油加工工艺和提高菜籽油营养保健功能提供了技术参考。     

梅花鹿Galectin-1基因克隆及生物信息学分析

本试验拟克隆梅花鹿半乳糖凝集素-1(Galectin-1)基因,并对其编码产物进行生物信息学预测分析。根据ncbi数据库中已发表的梅花鹿Galectin-1 mRNA序列,设计合成梅花鹿Galectin-1基因扩增引物。提取梅花鹿肝脏组织RNA,反转录为cDNA为模板,利用RT-PCR技术扩增梅花Galectin-1基因序列,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行遗传演化分析,结果显示,梅花鹿Galectin 1基因编码区为408 bp,编码135个氨基酸。Galectin-1编码蛋白理论分子量为14.69 kD,理论等电点为5.1,不稳定系数为14.87,推测该蛋白为稳定蛋白。脂肪系数为81.04,总平均亲水指数为-0.145。Galectin-1编码蛋白不含信号肽,无跨膜区;存在1个潜在的磷酸化位点不含O-和N-糖基化修饰位点;含有7个抗原决定簇区域,抗原倾向指数高。本试验成功克隆了梅花鹿Galectin-1基因,并对其进行了生物信息学分析预测,为深入研究Galectin-1编码蛋白的功能提供依据,进一步阐明了其生物功能。     

油菜籽粒发育过程中脂肪酸累积模式及相关分析

为研究高、低芥酸油菜品种籽粒发育过程中脂肪酸累积模式及相关性,以甘蓝型油菜低芥酸品种绵油88和特高芥酸品种绵油309为材料,调查了油菜在开花后10 d、15 d、20 d、25 d、30 d、40 d、45 d和50 d的油菜籽粒中脂肪酸含量的变化。结果表明:高、低芥酸油菜品种在脂肪酸累计过程中,棕榈酸、亚油酸、亚麻酸累积模式基本一致,油酸、花生烯酸、芥酸的累积方式上差异较大。相关性分析结果表明,棕榈酸含量与油酸、花生烯酸、芥酸含量呈负相关,与亚麻酸含量呈显著正相关;在高芥酸品种中,油酸含量与亚油酸、亚麻酸含量相关性较低;在低芥酸品种中,油酸含量与亚油酸、亚麻酸含量的相关性较高。     

花生GAIP-B基因的生物信息学分析及表达研究

为研究DELLA蛋白在花生生长、育种过程中的功能,利用RT-PCR技术从花生栽培种品系花2014中克隆得到一个花生DELLA蛋白编码基因AhGAIP-B(GenBank登录号:XP_016191184)。序列分析结果表明,AhGAIP-B开放阅读框(ORF)全长1 812 bp,只有一个外显子,可编码603个氨基酸。生物信息学分析发现,AhGAIP-B编码的产物是一类典型DELLA蛋白,其三级结构与拟南芥GAI相似,亲缘关系与大豆GmGAI1最近。进一步qRT-PCR结果显示,AhGAIP-B基因呈组成型表达,其中在茎中表达量最高;同时,本研究还发现,外源GA_3可以诱导AhGAIP-B基因上调表达,其表达量在处理后12 h最高。本结果将为进一步的花生DELLA功能研究提供理论基础。     

油菜脂肪酸延长酶基因fae1片段的克隆与SNP分析

 脂肪酸延长酶基因fae1是调控油菜芥酸合成的关键基因。本研究利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物，通过多聚酶链式反应（PCR）从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜（包括2个人工合成种）的12个不同品种中扩增出长1 007bp的fae1基因片段。PCR产物经与克隆载体pGEM-T vector连接和序列测定，获得12个品种的fae1基因片段的DNA 序列。对来自12个不同品种的fae1基因序列进行比较分析表明：fae1基因具有高度序列保守性，扩增长度均为1 007 bp，核苷酸序列相似度达98%以上，氨基酸序列的保守性更高。在1007 bp的区间内共发现23个SNP(single nucleotide polymorphism)位点，其中有11个单核苷酸变异导致了编码氨基酸的改变。人工甘蓝型油菜和天然甘蓝型油菜的fae1基因片段未发现明显差异。发现了高芥酸品种与低芥酸品种的fae1基因、以及A基因组与C基因组的fae1基因特有SNP位点。     

高低芥酸油菜品种发育籽粒脂肪酸积累模式的研究

以甘蓝型油菜低芥酸品种绵油14和高芥酸品种绵油322为试验材料,对油菜籽粒成熟过程中主要脂肪酸的积累模式进行了研究。结果表明:在高、低芥酸品种间,籽粒棕榈酸、亚油酸、亚麻酸的累积模式基本一致,且在低芥酸品种中的含量高于高芥酸品种中的;而油酸、花生烯酸、芥酸的累积模式差异较大,且在高芥酸品种中的含量高于低芥酸品种中的。     

紫苏PfPDCT基因序列特征及表达分析

采用生物信息学技术和在线分析软件对紫苏PfPDCT基因序列及所编码的蛋白质进行分析,并且利用实时荧光定量PCR技术研究该基因在晋紫苏1号种子发育不同时期的表达特性,旨在探究磷脂酰胆碱甘油二脂转磷酸胆碱酶(PDCT)在植物脂肪酸代谢过程的作用。结果表明,紫苏PfPDCT基因c DNA全长序列为2 098 bp,开放阅读框为1 683 bp,编码560个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,PfPDCT蛋白分子量约为59.315 ku,等电点为9.48,不稳定系数为35.00,推测其为稳定蛋白,与已知赤藓PDCT蛋白高度同源。通过荧光定量PCR分析可知,紫苏PfPDCT基因在不同发育时期的种子中均有表达,其中,在开花后20 d表达量最高,为开花后10 d的1.92倍。研究结果可为进一步阐明紫苏PfPDCT基因的功能及作用机制奠定基础。     

紫苏脂肪酸去饱和酶基因PfFAD2的生物信息学及表达特性分析

为研究脂肪酸去饱和酶基因FAD2在紫苏脂肪酸合成机制中发挥的重要作用,对紫苏FAD2基因及其编码的蛋白质序列进行了详细的生物信息学分析。结果表明,紫苏FAD2基因cDNA全长序列为1 545 bp,ORF为1 149 bp,共编码382个氨基酸残基;紫苏FAD2蛋白属于亲水性蛋白,具有6个典型的跨膜螺旋区,含有PLN02505保守结构域,属于Membrane-FADS-like超蛋白家族;系统进化树分析结果表明,紫苏与芡欧鼠尾草的亲缘关系较近,与红花较远。利用荧光定量PCR技术分析紫苏不同组织以及不同发育时期的种子中FAD2基因的表达特性,结果表明,紫苏FAD2在开花后20 d的种子中表达量最高。研究结果可为进一步阐明紫苏脂肪酸代谢机制奠定理论基础。     

花生叶提取物对电子束辐照后脂肪酶活性的保护作用

[目的]研究不同剂量电子束辐照对脂肪酸的影响。[方法]通过不同花生叶提取物处理辐照下脂肪酶,探明花生叶提取物在脂肪酶活性中的保护作用。[结果]当5个电子束辐照剂量辐照脂肪酶,脂肪酶活力下降。当加入花生叶提取物后,不同类型花生叶提取物对辐照处理后的鲈鱼脂肪酶酶活性起到了一个促进作用,进一步SDS-PAGE分析发现,不同花生叶提取物对辐照后脂肪酶活性保护作用不相同。[结论]查询相关文献可知心型、脑型脂肪酸结合蛋白在鲈鱼脂肪酶中含量较高,说明该研究脂肪酸结合蛋白,主要集中在线粒体以及过氧化物酶体β氧化过程,此研究结果表明花生叶提取物对鲈鱼脂肪酶活性起到了一定保护作用。     

绵羊ELOVL5基因的生物信息学分析

极长链脂肪酸延伸酶蛋白家族（elongation of very-long-chain fatty acids, ELOVLs）是一类催化脂肪酸合成的限速酶,主要调控血脂、血糖及一些代谢疾病的发生。为探究绵羊ELOVL5基因的结构和功能,本研究对该基因及其编码产物进行了生物信息学分析。结果显示,绵羊ELOVL5基因编码737个氨基酸,其编码蛋白分子式为C₁₆₅₆H₂₄₄₈N₄₁₆O₄₁₅S₁₆,其分子质量为35 335.39 Daltions,理论等电点为9.47,估计半衰期为30 h,不稳定性指数为33.35。亚细胞定位主要位于内质网中（55.6%）,ELOVL5基因编码蛋白没有信号肽序列,不属于分泌蛋白。该蛋白存在多个跨膜区域,属于跨膜蛋白,存在7个保守结构域,并且为亲水性蛋白,二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,三级结构主要由α螺旋缠绕折叠而成。     

高油酸花生种子萌发期耐寒性筛选及脂肪酸含量变化研究

冻害是影响花生发芽生长的重要指标之一,而目前仍缺乏萌发期耐寒的高油酸花生种质,并且低温情况下,高油酸花生脂肪酸含量变化还有待研究。本试验以高油酸花生种质为材料,经田间早播进行评价,筛选出2份耐寒高油酸种质;利用筛选的耐寒与不耐寒花生材料,于常温及低温萌发条件下,在萌发后6个时间点进行脂肪酸含量测定,具有耐寒特性花生材料的脂肪酸含量均比不耐寒性花生材料的脂肪酸含量高,在萌发后18~24 h间表现明显;不耐寒花生材料在常温萌发条件下4 d内脂肪酸含量变化幅度不明显。本研究可为抗寒高油酸花生品种的选育提供参考。     

花生自然风干种子芥酸含量近红外分析模型构建

采集67份自然风干花生种子的近红外光谱,并进行芥酸含量色谱测定。采用交叉检验,构建了多粒自然风干花生种子样品芥酸含量的近红外定量分析模型。经优化,最佳光谱预处理方法为"消除常量偏移法",芥酸含量谱区范围为4 242.8～11 980.2 cm~(-1),维数为10,模型的决定系数(R~2)为80.08,交叉检验根均方差(RMSECV)为0.0238。此模型可以很好地预测花生种子芥酸含量,为花生脂肪酸遗传改良提供快速的选择手段。     

菜籽油中主要脂肪酸成分的检测分析

建立SP-2560脂肪酸专用柱和ZB-WAXplus毛细管柱对菜籽油中主要脂肪酸成分分析的气相色谱法。对来源及品牌商标不同的60个菜籽油(其中低芥酸菜籽油41个,高芥酸菜籽油19个)样品进行主要脂肪酸含量的检测分析,总合格率为58%,其中低芥酸和高芥酸菜籽油中合格率分别为66%和58%,并总结出在质量不合格的菜籽油中大豆油是主要掺假种类之一,为食用油的健康管理提供一定的技术参考。     

不同油菜品种脂肪及脂肪酸组成积累变化差异的初步研究

我国油菜面积占全国油料作物总面积的40%以上,产量占30%以上,近年来又有新的发展。但现有生产的品种,含油量偏低,芥酸偏高,还含有有害物质硫葡萄糖甙,急待研究改良。本专题的研究内容及预期目的是:(一)研究高油份与低油份、高芥酸与低芥酸油菜品种间脂肪及脂肪酸组成的积累变化差异,为品质育种的亲本选配提供依据:(二)观察油菜发育胚中脂肪形成规律及脂肪酸组成中油酸与芥酸、花生烯酸积累的相互关系。     

蔓花生AP2基因家族的生物信息学分析

AP2作为一类植物转录因子,在花的发育和营养器官的形成过程中都起着非常重要的作用。旨在对蔓花生(Arachis duranensis)AP2蛋白的理化性质及分子进化关系等进行详细的生物信息学分析。结果表明,蔓花生AP2基因家族成员编码蛋白亚细胞定位预测均在细胞核中,有11个成员的理论等电点小于7,推测该家族蛋白多为酸性蛋白,有8个成员存在2个保守结构域;该家族成员均无信号肽;除了Aradu.SE6Q0与Aradu.42K79成员中存在跨膜现象外,其他成员鲜少出现跨膜现象。亲疏水性预测结果表明,蔓花生AP2基因家族编码蛋白的亲疏水性系数均小于0,推测其为亲水蛋白;磷酸化位点主要集中在丝氨酸上;其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。研究还得出,蔓花生AP2基因家族编码蛋白的主要保守基序是Motif1、Motif2和Motif4;Motif3、Motif4都含有YRG结构域,Motif5含有RAYD结构域;构建的系统发育树也有力地说明了AP2基因家族的进化程度。     

花生长链酰基辅酶A合成酶6基因(LACS6)的克隆、鉴定与组织表达

长链酰基辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase:LACS)是油脂代谢的重要催化酶。为揭示花生脂肪酸代谢机理,采用RT-PCR技术,首次从花生Arachis hypogaea L.克隆到LACS6(GenBank登录号:KU301860),分析该基因的结构组成,预测编码氨基酸与其他植物的同源性,采用Real-Time PCR技术对LACS6的组织表达进行研究。结果显示,花生LACS6基因全长2 116bp,包含2 088bp的ORF,编码695个氨基酸,有23个外显子和22个内含子。氨基酸序列比对显示花生LACS6有真核生物酰基辅酶A合成酶保守结构域,并含有保守的激活位点和绑定位点。同源性分析发现花生LACS6与鹰嘴豆、绿豆、大豆、梅等13种物种的氨基酸一致性在79%~87%,进化树分析显示,花生LACS6与鹰嘴豆等豆科植物亲缘较近。实时荧光PCR分析表明,花生LACS6在花生根、茎、叶、子房柄、仁和花等组织均有表达,且差异明显。子房柄和花的表达量极高,与根、茎、叶和仁等组织有极显著差异,花生LACS6组织的表达量大小排序为花子房柄叶仁茎根。本研究结果为揭示花生脂肪酸代谢和品质改良提供理论依据。     

亚麻荠FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的生物信息学分析

△-12脂肪酸脱氢酶FAD2(fatty acid desaturase 2)和△-15脂肪酸脱氢酶FAD3(fatty acid desaturase 3)是控制亚油酸(18∶2;ω-6)和亚麻酸(18∶3;ω-3)合成的限速酶,亦在植物抵御低温等环境胁迫反应中起重要作用。本文利用生物信息学工具分析了亚麻荠(Camelina sativa)FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的理化性质、二硫键、磷酸化位点、高级结构、保守域和功能系统进化等特征。结果表明,FAD2-1和FAD3-1编码蛋白理论pI相近(分别为8.39和8.42),然而前者不稳定系数(40.04)显著高于后者(29.46)。FAD2-1蛋白的磷酸化位点为23个,多于FAD3磷酸化位点(18个),预示FAD2-1更易受翻译后调控。这两种蛋白均含有3个保守的组氨酸富集区(Hisbox),且在C端含有内质网滞留信号,赋予其定位于内质网和催化双键形成的活性。FAD2-1的a-螺旋比例(45.31%)高于FAD3-1(33.16%),然而后者无规则卷曲比例(51.93%)大于前者(44.53%)。3D结构模拟显示,FAD2-1和FAD3-1功能域大小和构象存在差异,这可能影响到底物选择性和催化效率。这些结果为全面解析亚麻荠种子油脂合成和ω-3族脂肪酸富集的分子机理提供了科学参考。