7种植物ALAD基因的生物信息学分析

5-氨基乙酰丙酸脱水酶（8-aminoaevulinicaciddehydratase，ALAD）是生物体所有四吡咯化合物生物合成所必需的酶。目前，GenBank共记载了39种绿色植物的ALAD基因。本文采用生物信息学方法对其中常用的模式植物拟南芥、玉米、小麦、大豆、苜蓿以及葡萄、菠菜等植物的5-氨基乙酰丙酸脱水酶基因的核苷酸及其编码的蛋白氨基酸序列、组成成分、导肽、信号肽、跨膜结构域、疏水性／亲水性、蛋白质二级结构、三级结构及功能域等进行预测和分析，并构建了5-氨基乙酰丙酸脱水酶蛋白家族的系统进化树。结果表明，这几种植物的开放阅读框都在1290bp左右，分子量为47kD左右，等电点（pD值为5．5～7．0之间，ALAD蛋白呈中性至微酸性。含量最丰富的氨基酸为Ala、Leu、Val、Arg、Ser、Gly、Pro和Asp。研究还发现这些植物5-氨基乙酰丙酸脱水酶肽链表现出明显的疏水区和亲水区，不存在信号肽，有叶绿体转运肽；可能存在跨膜结构域。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是无规则卷曲和α-螺旋，含有5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性结构域、ALAD-PGBS．aspartate-rich保守结构域、舍夫碱残基结构域和一个镁离子结合位点结构域。核苷酸同源性比对结果显示，拟南芥5-氨基乙酰丙酸脱水酶基因与其它植物的同源性较高；进化分析结果表明这些植物5-氨基乙酰丙酸脱水酶基因被分为六个大类。本工作可为今后深入研究植物5一氨基乙酰丙酸脱水酶的结构特征和功能提供一定的依据。     

几种经济植物UFGT基因的生物信息学分析

本文根据在GenBank中已登录的葡萄、玉米、水稻、草莓、拟南芥和苹果等植物的类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列,应用生物信息学软件预测了其理化性质、疏水性/亲水性、导肽、跨膜结构、卷曲螺旋结构、二级结构、功能结构域及高级结构,并构建了类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶蛋白家族的系统进化树。结果表明这几种植物的UFGT基因核苷酸序列除葡萄存在2个外显子外,其它植物均存在1个外显子。含量最丰富的氨基酸是Leu、Ala、Gly、Val和Ser等,除葡萄、苹果UFGT属于不稳定类蛋白外,其余均属于稳定类蛋白。进一步研究分析表明,这几种植物UFGT蛋白存在明显的疏水区和亲水区、信号肽、跨膜结构以及卷曲螺旋。二级结构组成上比例相似,并且都由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所组成。它们都存在UDPGT、COG1819和MGT等保守域。除了拟南芥外,其它几种植物都能够通过同源建模建立UFGT蛋白的三维结构。进化分析表明,把它们的UFGT基因分成5个类群,其中3个大类群,另外陆地棉和野芭蕉的UFGT基因分别单独成一类。本工作将为深入研究该蛋白在植物花、果实和叶片等器官颜色变化中发挥的功能,开展生物大分子结构模拟以及药物设计提供抛砖引玉的作用。     

Cupriavidus campinensis BJ71菌株2,4-D降解基因tfdA生物信息学分析

本文以2,4-二氯苯氧乙酸高效降解菌Cupriavidus campinensis BJ71菌株中克隆的tfdA基因全序列为研究对象,利用生物信息学方法分析该基因及其推测出的编码蛋白理化性质、蛋白的亲水性或疏水性及亚细胞定位、预测信号肽、跨膜结构域、蛋白二级结构及模体、三级结构等特性。结果表明,BJ71菌株的tfdA基因开放阅读框全长864 bp,系统发育树表明其属于Ⅰ族tfdA基因。TfdA蛋白包含287个氨基酸,分子量为32 kD、理论等电点为6.01,是一种不含信号肽、定位于细胞质中的可溶性亲水蛋白。α螺旋和无规卷曲是该蛋白主要的二级结构元件。用RaptorX进行三级结构建模、Ramachandran评估显示获得了合理可靠的TfdA蛋白结构模型。     

桃PGIP基因及其启动子的克隆与分析

桃流胶病是一种严重危害桃树的真菌性病害,为研究PGIP基因在桃抗流胶病及抗其它真菌性病害中的作用,本研究以桃抗流胶病品种‘南京白沙’叶片为材料,对其PGIP基因及启动子序列进行克隆与分析。克隆测序获得了‘南京白沙’桃PGIP基因cDNA序列（GenBank登录号：HQ453972）和PGIP基因组DNA序列以及起始密码子上游453bp的启动子序列（GenBank登录号：HQ453974）,并将该PGIP基因命名为PpPGIP2。‘南京白沙’桃PpPGIP2序列分析显示,该DNA序列具有完整的阅读框,无内含子,与GenBank中登录的李属PGIP基因序列同源性在93%～98%之间,与测序完成的桃全基因组中该基因的序列同源性为96%;PpPGIP2编码的氨基酸序列分析显示,该氨基酸序列含有2个典型的亮氨酸重复序列,信号肽为第1～第24个氨基酸残基;PGIP基因的序列聚类图显示,除了科、属、种间的同源性差异外,桃的种内PGIP基因同源性也有较大差异;PpPGIP2启动子序列分析发现3个抗病相关元件,分别为：GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A和WBOXATNPR1,另外还有与激素调控、胁迫有关的调控元件。本研究对‘南京白沙’桃PGIP基因和启动子的克隆与分析,将为进一步研究桃PGIP基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析

参照拟南芥WRKY转录因子基因保守序列设计引物，利用RT-PCR及RACE技术克隆了白菜WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为BcWRKY1 (GenBank登录号为AY836002)。序列分析发现，白菜BcWRKY1基因核苷酸序列长980bp，推导的氨基酸序列编码285个氨基酸残基，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为74%，与拟南芥AtWRKY60同源性为59%；与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southern杂交显示该基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明，用2mmol/L的水杨酸处理后2h~8h，以及用霜霉病菌接种后6h~12h，白菜BcWRKY1基因的表达量最高。     

比利时杜鹃花花青素合成酶基因（RhANS）克隆及其功能分析

花青素合成酶（ANS）是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花（Rhododendron hybridum Hort.）ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录（RT-PCR）和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱（Waters UPLC-Qtof）技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体（pET-28a）上,并在大肠杆菌（BL21）中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱（HPLC）检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1 350 bp,开放阅读框（ORF）序列1 074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官（...     

葡萄风信子二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)的克隆与表达分析

葡萄风信子(Muscari armeniacum)是一类重要的球根花卉,其花色呈现特殊的蓝色。花青素是影响葡萄风信子蓝色形成的重要物质,与植物生长过程及人类/动物饮食密切相关。有关花青素生物合成途径的研究已较为成熟,但由于葡萄风信子基因资源缺乏,其花色形成的机理目前尚不清楚。二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是植物花青素合成中的重要酶。本研究采用RACE技术从葡萄风信子花瓣中克隆到两条DFR基因(MaDFR2a和MaDFR2b),GenBank登录号分别为KJ619963和KJ619964。序列分析表明,MaDFR2a和MaDFR2b全长1 392 bp,包含一个长度为76 bp的5'非翻译区和215 bp的3'非翻译区,均包括一个1 101 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码366个氨基酸,氨基酸相似性为98%,与其他植物的DFR蛋白同源性较高。聚类分析表明,葡萄风信子DFR最先与单子叶植物聚为一类。生物信息学分析表明,两个DFR蛋白可能为亲水性蛋白,均具有两个跨膜区,无信号肽。亚细胞定位分析显示,两个DFR基因均定位于整个细胞中。α-螺旋和无规则卷曲是两个DFR蛋白的主要二级结构元件。MaDFR2a和MaDFR2b编码的蛋白三级结构非常相似,中间形成一个裂沟,可以进行催化反应。花青素含量测定显示,着色的花器官中花青素含量较高,根、茎、叶以及未着色的花蕾中几乎检测不到花青素。荧光定量PCR分析发现,MaDFR2a和MaDFR2b在葡萄风信子花组织中表达较高,根、茎和叶中微量表达;MaDFR2a和MaDFR2b均在未着色的花蕾时期开始表达,随着花色加深,在完全着色的花中表达最高,此后逐渐降低,但MaDFR2b在未着色的花蕾期和完全着色的花中表达相对较高。研究结果表明,DFR可能是影响蓝色葡萄风信子形成的重要基因。     

拒盐型盐生植物小花碱茅肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

本研究根据其它植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物，以拒盐型盐生植物小花碱茅根部总RNA为模板，采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T载体，阳性克隆经PCR检测后进行测序，在GenBank中注册；序列分析结果表明：该片段长约600bp，编码198个氨基酸；所得序列与GenBank中注册的其它植物Actin基因序列同源性均在84％以上，与其它肌动蛋白的氨基酸序列同源性达94％以上。     

旱生植物梭梭actin基因片段的克隆及表达模式分析

本研究根据其它植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以3周龄梭梭整株总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析结果表明：该片段长约598 bp,编码198个氨基酸;该序列与GenBank中现有的植物Actin比对发现,同源性均高达84%,同时,翻译得到的氨基酸序列与其它植物的氨基酸序列同源性高达99%。表达实验分析表明在不同胁迫条件下该基因在梭梭不同组织中表达量恒定,可作为内参基因。梭梭actin基因片段的克隆可为研究重要抗逆功能基因在梭梭中的表达和调控机制奠定基础。     

西农萨能羊47kD尾部相互作用蛋白基因(TIP47)的cDNA克隆、序列结构分析与组织表达

47kD尾部相互作用蛋白基因(tail-interacting protein47,TIP47)是影响脂滴形成和代谢的重要基因。本实验以西农萨能羊(Capra hircus)的乳腺组织为研究材料,采用RT-PCR和RACE,克隆了山羊TIP47基因的cDNA全长序列。结果得到TIP47基因cDNA序列全长1906bp(GenBank收录号为:HQ846827),包括5'UTR82bp,完整编码区1314bp及3'UTR510bp,编码蛋白质的氨基酸数为437,分子量47.36kD,等电点(pI)5.14。对TIP47基因的核苷酸和氨基酸序列分析发现,山羊的TIP47与GenBank中牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和猪(Sus scrofa)的TIP47相似性较高。蛋白质结构分析显示,TIP47不存在信号肽序列和跨膜结构;疏水性分析发现,其N端疏水性较强,中间靠近C端部分亲水性较强;三级结构分析发现,其C端呈大写的L形;该基因的遗传距离分析发现,山羊与牛的亲缘关系最近,其次是猪和人。通过RT-qPCR技术对TIP47基因进行了组织表达分析,发现所检测...     

沪油15中两个AP2/ERF-B1亚族转录因子的克隆与分析

利用油菜EST数据库,以拟南芥ERF-B1亚族转录因子序列为探针,电子克隆拼接得到2个cDNA序列（BnaERFB1-1和BnaERFB1-2）,通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜沪油15的DNA和cDNA中克隆了上述基因。克隆转录因子BnaERFB1-1-Hy15和BnaERFB1-2-Hy15与电子克隆的序列差异很小,分别只有2个和6个氨基酸位点不同,且都没有内含子。从cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、进化树、序列比对、功能域、二级和三级结构等方面进行了分析,结果显示,BnaERFB1-1-Hy15和BnaERFB1-2-Hy15转录因子属于AP2/ERF家族中的ERF-B1亚族,是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与拟南芥atERF7相似。EST丰度分析显示,BnaERFB1-1的表达主要集中在种子中,而BnaERFB1-2的表达则主要集中在分生组织中。     

UV-B辐射增强对水稻蛋白质及核酸的影响研究

盆栽试验研究UV B辐射增强对水稻蛋白质及核酸的影响结果表明 ,UV B辐射增强抑制水稻生长 ,降低水稻生物量和水稻叶片可溶性蛋白质及核酸含量。随UV B辐射的增强 ,水稻叶片蛋白水解酶和核糖核酸酶活性上升 ,硝酸还原酶活性下降 ,叶片总游离氨基酸含量增加。     

Detection and quantification of protein residues in food grade amino acids and nucleic acids using a dot-blot fluorescent staining method

Food allergies represent an important health problem in industrialized countries, such that detection and quantitative analysis of the protein considered to be the main allergen is crucial. A dot-blot fluorescent staining method for the detection and quantitative analysis of protein residues in food grade amino acids and nucleic acids is presented. This method combines fluorescence staining with dot-blotting onto PVDF membrane. Several standard proteins, such as bovine serum albumin (66 kDa), lysozyme (14 kDa), ubiquitin (8.6 kDa), bovine insulin (5.7 kDa), and oxidized insulin B chain (3.5 kDa), were detectable at 0.1 ppm using SYPRO Ruby blot stain. Twenty-five different amino acids and two different nucleic acids of food grade were analyzed using this method combined with an internal standard addition method using BSA as an internal standard. All amino acids and nucleic acids were dissolved in 3.6% aqueous HCl and dot-blotted onto PVDF membrane before a large amount of amino acids and nucleic acid were removed. Protein residues and the internal standard protein immobilized on the membrane were stained using SYPRO ruby blot stain. The internal standard in all samples was detectable at 0.1 ppm. Samples were dissolved at 120 or 70 mg/mL, according to their solubility under acidic conditions. The detection limit of protein residues per weight was 0.8-1.4 ppm in amino acids and nucleic acids; residual protein was not detected in any sample.     

黄冠梨几丁质酶基因家族cDNA全长序列克隆与分析

根据已知植物几丁质酶基因序列的保守区域,设计特异性引物,以梨黄冠品种叶片为材料,提取RNA,进行反转录,克隆获得5个几丁质酶基因cDNA片段,进一步通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,依次命名为PyChi1、 PyChi2、 PyChi3、 PyChi4、 PyChi5,序列提交GenBanK,登录号为：FJ589783、 FJ589784、 FJ589785 、 FJ589786、FJ589787。序列分析结果表明,所获得5个几丁质酶基因,都具有完整的ORF和Poly(A)结构,与其他植物几丁质酶基因具有较高的相似性;5个基因的核酸序列的同源性约在35%~53%之间,PyChi1和PyChi4的氨基酸同源性最高,约85%,而与PyChi5约77%;在几丁质酶基因家族,分别属于Chitinase ClassesⅠ-Ⅴ,为5个不同类型的成员;不同类型的几丁质酶基因在核酸和氨基酸序列以及功能结构方面都存在着存在着显著的差异,主要表现在肽链特性和基因结构等方面。这为进一步研究梨几丁质酶的结构和功能奠定了基础。     

Comparative analysis of <Emphasis Type="Italic">Argonaute</Emphasis> gene sequences in bananas (<Emphasis Type="Italic">Musa</Emphasis> sp.) shows conserved species-specific Ago-7 PIWI domains

The Argonaute proteins are key components in the effector complex of RNA silencing pathways which interact with small RNAs to mediate sequence specific silencing of nucleic acid targets. In plants, these proteins are involved in a diversity of biological roles such as antiviral defence, heterochromatin regulation and in the regulation of growth and development. This report describes the study of Argonaute gene sequences in bananas which are an important food staple for many developing nations. This study successfully isolated AGO7-specific PIWI domain genomic sequences from 12 diploid Musa species of three Musa sections and also from Ensete. The Musa AGO7-specific PIWI domain sequences showed the highest similarity to rice AGO7/SHOOTLESS4 with an average amino acid identity of 78%. Phylogenetic analysis of the Musa sequences revealed phylogenetic grouping that agrees fairly well with the present knowledge of the taxonomic classification of Musa species. In addition, this study estimated that there are at least 15 Argonaute genes or loci containing PIWI domain sequences in the genome of Musa acuminata ssp. malaccensis.     

杏自交不亲和相关S-RNase基因的克隆及表达

摘要: 从巴旦水杏(Prunus aremeniaca L. cv. Badanshui)、红玉杏(P. aremeniaca L. cv. Hongyu)和凯特杏(P. aremeniaca L. cv.Katy)3个品种中通过RT-PCR和RACE克隆出3个S-RNase片段， 分别被定名为PA1、PA2、PA3，片段大小分别为576、601和591 bp。3个基因的氨基酸的相似性达80.6%。将这3个基因与蔷薇科中其它树种的S- RNase比较表明，蔷薇科S-RNase的氨基酸序列变异很大，亚科内的相似性高于亚科间的，在所编码的187个氨基酸中只有14个氨基酸残基是完全保守的，高度变异（RHV）区PA1有H、M两个残基和PA3有N、S、A　3个残基不同于其它的S-RNase，这表明不同的残基可能起着S-等位基因专一性识别的作用。从蔷薇科、茄科及一些S-like RNase 的系统树分析可看出，苹果和梨分属于苹果亚科类，樱桃、扁桃和杏分属于李亚科类，同时也证明了实验中所得到的3个氨基酸序列是S-RNase的一个分支而不是S-like RNase的分支。 Northern 杂交分析表明凯特杏表达的PA3只在花柱中专一表达，在根、茎和叶中未表达，杂交斑的分子量为0.9 kb。序列分析及在基因库中搜索结果证明，本研究所得到的3个基因是S-RNase表达的基因。     

Mechanism of production of troponin T fragments during postmortem aging of porcine muscle

Troponin T (TnT) is one of the myofibrillar proteins that is easily degraded during postmortem aging of pork. In this study, we determined the N-terminal amino acid sequences of TnT degradation fragments produced during postmortem aging and by m-calpain hydrolysis. The N-terminal amino acid sequences of TnT fragments produced during postmortem aging were EVHEPEEKPRPKLTAP, EKPRPKLTAPKIPEG, and APKIPEGEKVDF. On the other hand, the N-terminal amino acid sequences of TnT fragments produced by the action of m-calpain were APPPPAEV, EVHEPEEK, and APK. These sequences of degradation fragments could be mapped on fast type TnT isoform 2. The peptide bonds of His37-Glu38 and Thr51-Ala52 in fTnT2 were cleaved during postmortem aging as well as by the calpain hydrolysis; therefore, calpain was concluded to have an important role in TnT degradation during postmortem aging. It was also found that the sourness-suppressing peptide APPPPAEVHEVHEEVH (Okumura et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004, 68, 1657-1662) derived from TnT degradation could be produced by the action of calpains on Glu21-Ala22 and His37-Glu38 sites.     

Extraction and analysis of nitrogen,phosphorus and carbon fractions in plant material

A method is described for the extraction and analysis of various nitrogen‐, phosphorus‐ and carbon‐containing fractions from plant material. Lipids were extracted with chloroform/methanol and chloroform/methanol/water. Soluble nitrogen (nitrate, ammonia, and amino acid), phosphorus (inorganic and sugar phosphate) and carbon (sugar and tannin) fractions were extracted with cold trichloracetic acid. Hot soluble nitrogen and phosphorus (nucleic acid) and carbon (starch and tannin) fractions were extracted with hot trichloracetic acid. Protein remained in the residue. A detailed automated scheme is described for the analysis of each of the above fractions. Also included are methods for analyzing triglyceride, hydrolyzable ester phosphate and phytic acid.