RT-PCR技术检测绵羊卵巢内Ghrelin的表达

为了明确Ghrelin在绵羊卵巢有腔卵泡上是否存在表达,本研究利用实时定量RT-PCR技术检测了绵羊卵巢有腔卵泡内的卵母细胞、卵丘细胞和壁层颗粒细胞的Ghrelin蛋白的表达量情况。结果揭示绵羊卵巢有腔卵泡内各类型细胞Ghrelin mRNA的相对表达量大致相同。绵羊卵巢有腔卵泡内各类型细胞Ghrelin蛋白的表达及Ghrelin mRNA的表达模式,尤其是卵母细胞中的表达,揭示这一新型分子在绵羊卵巢上具有潜在的调控作用。     

Ghrelin在绵羊卵母细胞体外成熟过程中对BCL-2、BAX的mRNA表达的影响

为了探讨Ghrelin在绵羊卵母细胞体外成熟过程中与BCL-2、BAX的相关性及Ghrelin在绵羊卵母细胞成熟过程中可能的作用机理,试验在绵羊卵母细胞成熟液中添加500 ng/mL Ghrelin,采用实时荧光定量PCR分别在0,8,16,24小时时检测卵母细胞BCL-2、BAX的表达量。结果表明:试验组添加Ghrelin后8,16小时时卵母细胞BCL-2 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),但成熟后16,24小时时较8小时时有下降趋势;下降到24小时时,其表达量与0小时时没有显著变化(P>0.05);8,16小时时试验组与对照组比较差异显著(P<0.05),0,24小时时差异不显著(P>0.05)。试验组添加Ghrelin后8,16,24小时卵母细胞BAX mRNA相对表达量较0小时时下降,且差异显著(P<0.05),但成熟后16,24小时时与8小时时比较有上升趋势;在8,16小时时试验组较对照组BAX mRNA相对表达量均有所下降,且差异有显著性(P<0.05),而在0,24小时时差异不显著(P>0.05)。说明Ghrelin在绵羊卵母细胞成熟过程中与BCL-2和BAX的表达存在相关性,推测Ghrelin在卵母细胞成熟过程中存在积极调控作用。     

卵巢质量和保存液对牛卵母细胞体外发育能力的研究

为研究卵巢质量和保存液对牛卵母细胞孤雌发育能力的影响,本实验将采集卵巢按其质量分为A、B 2组,于生理盐水中运输到实验室,利用切割法采集卵巢表面卵泡中的卵母细胞培养,成熟后孤雌激活;将采集牛卵巢随机分到D-PBS保存液与生理盐水中,运送到实验室后采集卵母细胞培养。以卵母细胞的成熟率、孤雌胚的卵裂率、囊胚率来评价卵巢质量、保存液对卵母细胞发育能力的影响。结果表明:A组卵巢平均获得的卵母细胞数(2.1枚)显著低于B组卵巢获得的卵母细胞数(5.5枚),从A组卵巢上获得的卵母细胞成熟率(56.98%)、卵裂率(42.86%)及囊胚率(9.52%)显著低于B组卵巢上获得的卵母细胞成熟率(84.38%)、卵裂率(70.17%)及囊胚率(31.50%)(P<0.05);使用含离子丰富的D-PBS溶液,较对照组保存液生理盐水,其卵母细胞的成熟率、卵裂率及囊胚率均没有显著差异(P>0.05)     

Ghrelin及其相关基因mRNA在海兰褐蛋鸡不同产蛋阶段的表达变化

本文旨在探讨海兰褐蛋鸡Ghrelin、Ghrelin受体(GHSR)和Ghrelin酰基转移酶(GOAT)在产蛋周期不同阶段的表达变化规律,为通过诱导Ghrelin表达促进蛋鸡卵泡生长发育以提高产蛋率及延长产蛋周期提供理论依据。应用ELISA检测蛋鸡产蛋周期血浆和卵巢Ghrelin含量,实时定量PCR检测腺胃与卵巢Ghrelin、GHSR和GOAT表达变化。结果表明:不同产蛋阶段外周血Ghrelin的含量和腺胃中Ghrelin、GHSR和GOAT mRNA的表达变化不明显;产蛋高峰期卵巢中Ghrelin mRNA表达水平比产蛋前期升高98.2%(P0.05),而产蛋后期Ghrelin表达水平比产蛋高峰期有所下降(P0.05);GHSR和GOAT的表达模式和Ghrelin基本一致,均表现为产蛋高峰期表达量最高,产蛋后期略有下降,产蛋高峰期GHSR和GOAT mRNA表达水平显著高于产蛋前期和产蛋后期(P0.05),但产蛋前期和后期差异不显著(P0.05)。推测海兰褐蛋鸡卵巢中Ghrelin、GHSR和GOAT的转录表达水平与产蛋周期具有一定的相关性。     

牛冻卵体外受精产犊

近年来牛冻胚己商业化应用,如果牛卵母细胞能冷冻保存,则对建立胚胎库及提高遗传改良技术将是很有利的。本试验的目的是建立一种卵母细胞冷冻方法,即一步加入或除去高渗冷冻保护剂来冷冻保存未成熟牛卵母细胞。1 卵母细胞冷冻1.1 未成熟卵母细胞冷冻从屠宰场取回牛卵巢,用生理盐水保存,2小时内带到实验室。从卵巢吸出卵母细胞,用改进的磷酸盐缓冲液(m-PBS)洗两次,在含有 Hepes 缓冲液的 TCM199+10%超排     

湘西黄牛超数排卵和冲胚效果与卵巢Figla基因表达水平之间的关系

利用real-time PCR和原位杂交技术分析了Figla(factor in the germline alpha)基因在湘西黄牛卵巢中的相对表达量与定位表达情况。结果显示:能冲出较多优质胚胎的湘西黄牛个体,卵巢组织中Figla基因mRNA水平的表达量要显著高于对照组(P0.05)。Figla基因mRNA在牛卵巢组织中的初级卵泡、次级卵泡和成熟的有腔卵泡都有表达。而且Figla基因在有腔卵泡的卵母细胞中的胞质中表达,但在细胞核中没有表达。结果说明:湘西黄牛超数排卵和冲胚效果与卵巢Figla基因表达水平之间存在一定的关系,Figla基因可能是卵泡和早期胚胎发育的双重关键基因。     

Ghrelin在马鹿器官组织中的表达

为研究Ghrelin在马鹿体内可能表达的器官,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法检测马鹿的舌、食管、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肝、胰、颌下腺、腮腺、气管、肺、肾、输尿管、膀胱、卵巢、输卵管、子宫、阴道、大脑、下丘脑、垂体、松果体、甲状腺、肾上腺、心肌、心内膜、脾、淋巴结和骨骼肌中Ghrelin表达情况。结果显示,Ghrelin在皱胃内的表达量明显高于其他器官(P0.05);胰、子宫、卵巢、十二指肠和食管次之,与其余30种器官的表达量相比差异也显著(P0.05);其余器官内的表达量相对较少。结论:Ghrelin在所检测的36种器官内均有表达。     

Ghrelin对绵羊卵母细胞体外受精的影响

为了研究Ghrelin是否参与影响体外受精(IVF)过程,试验运用体外成熟及体外受精技术,向体外受精培养体系中外源性地添加Ghrelin(0μg/L、300μg/L、600μg/L、900μg/L、1 200μg/L)及已被多项研究作为GHS-R的颉颃剂D-Lys3-GHRP-6(0μg/L、10μg/L、100μg/L、1 000μg/L)的方法,对Ghrelin及其受体颉颃剂D-Lys3-GHRP-6对绵羊卵母细胞体外受精情况进行检测,初步确定Ghrelin在绵羊体外受精过程中可能扮演的角色。结果表明:外源性添加的Ghrelin在绵羊卵母细胞体外受精过程中并没有发挥明显的生理作用,说明Ghrelin能促进卵母细胞的体外成熟而不能促进体外受精。     

梅花鹿体内脑肠肽的表达及细胞定位分析

为了明确脑肠肽Ghrelin(又名胃饥饿素)在梅花鹿体内的表达及定位,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组织化学技术检测了梅花鹿食管、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、肝、胰、甲状腺、垂体前叶、肺、肾、脾及卵巢等器官中Ghrelin mRNA的相对表达量和Ghrelin蛋白的定位分布情况。RT-qPCR结果显示:Ghrelin mRNA在上述器官中均有表达,其中皱胃内的表达量显著高于其他器官(P0.05);免疫组织化学染色结果表明Ghrelin蛋白在这些器官中均有表达,在消化管内的分布最为广泛。梅花鹿体内Ghrelin mRNA和Ghrelin蛋白的特定表达模式,揭示这一新型分子在梅花鹿的生长发育过程中可能存有广泛的生物学作用,尤其在胃肠道功能方面可能作为一种重要的调节方式而存在。     

不同生理状态乳牛卵巢卵母细胞基因的差异表达

为了研究不同生理状态下的卵巢卵母细胞基因的表达情况，采集乳牛的卵巢，分离了卵母细胞，以单个卵母细胞的mRNA作为模板，用设计的随机引物和锚定引物，采用一步法RT-PCR扩增了卵母细胞基因。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，发现有功能黄体和无黄体卵巢卵母细胞基因的电泳条带之间无明显差异，对一条明显差异条带进行回收、纯化，将纯化的PCR产物连接到T载体，阳性克隆经鉴定后，进行测序和同源性比较。结果显示，与体外培养的牛早期胚胎的一条序列具有很高的同源性。     

未成熟牛卵母细胞与成熟牛卵母细胞冷冻保存的比较

试验以OPS玻璃化冷冻为方法,以成熟和未成熟牛卵母细胞为材料,研究冷冻保存效果与卵母细胞成熟度的关系.一组将牛卵母细胞从牛卵巢内取出后直接进行冷冻,另一组将牛卵母细胞从牛卵巢内取出后先置于TCM199 FSH的培养液中培养20～22 h,即进行体外成熟后再进行两步法冷冻,两步法解冻后检测卵母细胞的存活率.结果表明,牛体外成熟卵母细胞冷冻效果较未成熟卵母细胞冷冻效果好,卵母细胞的存活率为48.1%,未成熟牛卵母细胞冷冻效果较成熟卵母细胞冷冻效果差,卵母细胞的存活率为35.1%.     

牛有腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究

试验从屠宰场收集了 4 8头青年黄牛、34头青年水牛的卵巢共 16 4个 ,共回收可用卵母细胞 86 4枚。水牛平均每个卵巢可回收 3.2 2枚可用卵母细胞 ,相当于黄牛 (6 .72枚 )的一半。试验结果表明 :水牛卵巢生长卵泡少 ,卵母细胞产量少、质量差 ;3种采集黄牛卵泡卵母细胞的方法 ,用抽吸加切割法平均从每个卵巢回收的可用卵数 (7.71枚 )都极显著高于抽吸法 (6 .19枚 )和切割法 (6 .4 4枚 ) (P <0 .0 1) ,但是该法手续繁杂 ,适于一次且只能收集少量卵巢时使用 ;在黄牛和水牛卵母细胞成熟培养液中用 0 .3%PVP代替 10 %FBS ,牛卵母细胞的体外成熟率无显著差异 (P >0 .0 5 )。     

超低温冷冻对牛卵母细胞组蛋白乙酰化和膜蛋白CD9表达的影响

本试验旨在探讨玻璃化冷冻对牛体外成熟卵母细胞(MⅡ期)组蛋白乙酰化和膜蛋白CD9表达的影响。牛MⅡ期卵母细胞采用OPS法冷冻,即卵母细胞于10%EG+10%DMSO溶液中预处理30s,然后再移入玻璃化溶液EDFSF30中处理25s,以OPS为承载器投入液氮中。毒性组卵母细胞未投入液氮,其他过程与冷冻组相同,新鲜牛MⅡ期卵母细胞为对照组。卵母细胞解冻后,利用免疫荧光染色法检测存活细胞DNA组蛋白乙酰化;qRT-PCR和Western blot检测CD9mRNA蛋白的表达。结果表明:冷冻组卵母细胞形态正常率(93.8%)和存活率(92.7%)显著低于毒性组(100.0%,97.2%)和对照组(100.0%,98.5%)(P<0.05),而毒性组与对照组之间无显著差异。超低温冷冻后,卵母细胞DNA组蛋白乙酰化水平显著上升(P<0.05),CD9mRNA与蛋白表达显著降低(P<0.05)。以上显示,玻璃化冷冻不但降低了牛体外成熟卵母细胞的存活率,而且改变了DNA组蛋白乙酰化和膜蛋白CD9表达水平。     

新生儿卵巢同源盒基因在猪卵巢中的表达研究

新生儿卵巢同源盒基因(newborn ovary homeobox gene,NOBOX)是母源基因的一种,在早期卵子发生中起重要作用。为了明确NOBOX基因在猪卵巢等组织中的表达情况,本研究首先采用实时荧光定量PCR方法检测了NOBOX基因在猪不同组织中的表达,然后构建了NOBOX基因的原位杂交探针,采用原位杂交技术检测NOBOX基因在猪卵巢中的表达定位情况。结果显示,NOBOX基因在猪卵巢中的表达最高,极显著高于肾脏、肝脏、乳腺、肌肉及肾上腺等组织(P<0.01),而在肾脏、肝脏、乳腺、肌肉和肾上腺中,NOBOX基因表达差异不显著(P>0.05)。在猪卵巢中NOBOX基因的表达定位于卵母细胞胞质中,在颗粒细胞中未检测NOBOX基因的表达。以上结果表明,NOBOX基因仅在猪的卵母细胞胞质中高表达,预示NOBOX基因很可能在卵母细胞发生和胚胎的早期发育过程中发挥调节作用。     

1例利用瘘管进行牛活体取卵的研究

试验探索1种利用瘘管进行牛活体取卵的方法,通过瘘管将卵巢拉出体外,获取卵母细胞。结果显示,试验牛两侧卵巢均位于骨盆腔内,离瘘管口较远,且均有不同程度的囊肿。在未进行超排处理的前提下,右侧卵巢吸取3针,获得1个卵母细胞;左侧卵巢吸取6针,获得2个卵母细胞。研究表明,通过安装瘘管的形式可以获取卵母细胞,但易引起卵巢囊肿。     

Kisspeptin在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达和功能研究

Kisspeptin(Kp)是KiSS-1基因编码的产物,为明确Kp在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达和功能,本文首先利用免疫荧光技术研究了Kp在牛卵母细胞体外成熟0、6、12、18、24 h的表达规律,随后利用体外培养技术研究了添加Kp对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:Kp在牛卵母细胞体外成熟0、6、12、18、24 h均有表达,且0~12 h表达量呈递增趋势,12~24 h下降并达到最低;在TCM-199溶液中添加10 nmol/L的Kp可使卵母细胞的成熟率达到80.3%,与同时添加FSH和FBS处理组的结果差异不显著。研究结果提示,Kp在牛卵母细胞中有表达,且在体外成熟过程中呈现规律性变化,其可提高牛卵母细胞体外成熟效率。     

不同浓度CO2对牛卵母细胞体外成熟和受精的影响

对牛卵巢卵泡内卵母细胞在不同浓度的CO2培养箱内体外成熟、体外受精后的卵裂率及胚胎体外发育进行了研究。结果显示,含5%小牛血清(CS)的TCM-199内的卵母细胞在2%CO2条件下培养20h后,达到第二次减数分裂期(MⅡ期)的卵子数明显高于在5%CO2条件下培养的卵母细胞数(P<0.05)。两种浓度的CO2条件下培养的牛卵母细胞体外受精后的卵裂率无明显差异,2%CO2浓度下培养的卵母细胞的囊胚发育率高于5%CO2浓度下培养的卵母细胞。     

大鼠Ghrelin基因的克隆及其在发情周期不同阶段卵巢中的表达

该试验的目的是克隆大鼠Ghrelin基因eDNA片段进行序列分析，同时研究该基因在发情周期不同阶段卵巢中的表达。该试验是在成年大鼠胃组织提取总RNA，从Genbank里检索到大鼠Ghreline DNA序列后设计并合成引物，采用RT—PCR技术扩增出大鼠Ghreline DNA序列，获得了362bp的片段。将该片段回收并克隆到pMD18-T载体上，经PCR和限制性内切酶初步鉴定后测序，最终证明扩增出来的片段确实是GhrelineDNA序列。用相同的引物检测发情周期不同阶段大鼠卵巢中Ghrelin mRNA表达情况，发现发情前期、发情期、发情后期和休情期卵巢中都有Ghrelin mRNA的表达。     

水牛p21基因在卵母细胞体外成熟过程中的表达及其真核表达载体构建

旨在检测p21基因在水牛卵母细胞体外成熟过程中的表达变化,并克隆摩拉水牛p21基因CDs序列,构建真核表达载体。收集体外成熟培养不同时期(0、6、12、24h)和不同形态[有第1极体(first polar body,PB1)PB1和无PB1]的水牛卵母细胞,通过RT-qPCR检测其p21mRNA相对表达量。同时利用RTPCR技术从摩拉水牛卵巢颗粒细胞中扩增出p21基因编码序列,插入pEGFP-N1真核表达载体中,构建出重组质粒。将重组质粒pEGFP-N1-p21转染水牛颗粒细胞,并于培养24h和48h后观察转染细胞的荧光表达情况。收集转染48h后的颗粒细胞,通过RT-qPCR检测p21mRNA相对表达量。结果显示,成熟培养6h的卵母细胞p21mRNA表达量显著高于成熟培养0、12、24h的表达量(P0.05),有PB1的卵母细胞中p21mRNA的表达量显著高于无PB1的卵母细胞(P0.05);重组质粒pEGFP-N1-p21转染颗粒细胞后,有绿色荧光蛋白表达,且与转染pEGFP-N1和空白组相比,pEGFP-N1-p21转染组的p21mRNA表达量显著升高。结果表明,在体外成熟培养过程中均能检测到水牛卵母细胞p21mRNA表达量,成功构建了摩拉水牛p21基因真核表达载体,为下一步研究p21基因在水牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中的功能和调控奠定了基础。     

季节和方法对牛、绵羊卵母细胞回收及体外成熟的影响

利用屠宰牛、绵羊卵巢,研究了季节和方法对卵母细胞回收及体外成熟的影响。结果表明,季节对牛卵母细胞的回收和利用没有影响;抽吸法是合适的牛卵巢卵母细胞采集方法;季节对绵羊卵母细胞的回收和利用有显著影响,绵羊在非繁殖季节卵母细胞的回收率和可用率显著高于繁殖季节（P<0.05）,而体外成熟率极显著低于繁殖季节（P<0.01）;切割法回收的绵羊卵母细胞可用率（P<0.01）和体外成熟率（P<0.05）显著高于抽吸法,适合绵羊卵母细胞的回收。