R2R3-MYB转录因子CitMYB21对柑橘类黄酮生物合成的影响

以‘巴西酸橙’（Citrus aurantium L.）、‘本地早橘’（C. reticulata Blanco）、‘桂花蒂南丰蜜橘’（C. reticulata Blanco）、‘北碚447锦橙’[C. sinensis(L.)Osbeck]等30份柑橘种质为试材，挖掘与柑橘类黄酮生物合成相关的R2R3-MYB转录因子。通过比较转录组分析发现ERF、MYB以及Dof转录因子家族与果实发育过程中类黄酮的代谢密切相关，其中两个R2R3-MYB转录因子基因CitMYB21(Ciclev10021699m)和CitMYB33(Ciclev10012152m)的表达水平与类黄酮生物合成途径中的关键结构基因CitCHS2的表达量明显负相关。系统发育分析显示，这两个基因分别属于R2R3-MYB中的第2和第1亚族。从‘北碚447锦橙’中克隆得到了CitMYB21编码区的全长序列，共804 bp，编码267个氨基酸。CitMYB21的表达有显著的组织特异性及明显的种质特异性，并与类黄酮的含量呈显著负相关。CitMYB21沉默的柑橘植株叶片中类黄酮含量显著增加，而瞬时过表达的果皮中类黄酮的含量明显降低。...     

柑橘4CL基因家族的结构及其功能分析

植物中编码类黄酮和木质素生物合成关键酶,4–香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)的基因通常是家族基因。通过生物信息分析,从克里曼丁橘(Citrus clementina)基因组数据库中筛选出若干条拟为4CL基因的序列。通过对其蛋白结构进行分析,发现其中仅有3个基因具有典型的4CL家族基因的特性。聚类分析结果表明柑橘Cit4CL1聚到ClassⅠ,Cit4CL2和Cit4CL3聚到ClassⅡ。利用荧光定量PCR(q PCR)对北京柠檬不同组织和发育过程中的果实Cit4CL的表达进行分析,发现各成员的表达存在明显的差异,其中Cit4CL1的表达水平与类黄酮含量呈显著正相关,说明该基因对调控柑橘类黄酮的生物合成具有重要作用。Cit4CL2和Cit CL3的表达与类黄酮的含量相关性不显著,但其表达的组织特异性和木质素生物合成较为活跃的组织明显相关,表明这两个基因是与木质素生物合成相关的基因。     

红仁核桃自然杂交后代不同表型叶片差异表达CHS基因的鉴定及生物信息学分析

【目的】查尔酮合成酶(CHS)是植物黄酮类化合物合成途径中的第一个关键酶,探究关键CHS基因在红仁核桃花青苷生物合成过程中的功能,为探明红仁核桃花青苷合成的分子机制提供理论基础。【方法】以红仁核桃自然杂交后代不同表型(红叶和绿叶)株系3个发育时期的叶片为试材,观察颜色表型变化并测定其花青素含量,进一步通过转录组测序结果构建核桃CHSs基因表达图谱,筛选获得4个显著差异表达的JrCHS基因JrCHS1～JrCHS4,并利用生物信息学方法对相关序列、理化性质及结构功能进行预测分析。【结果】两种叶片在不同发育时期的颜色表型及花青素含量均存在显著差异;4个JrCHS基因在不同表型叶片的各发育时期均有表达,且均在时期1红叶中的表达量显著高于绿叶,与颜色表型变化及花青素含量呈正相关。生物信息分析表明,4个JrCHS基因分别位于不同染色体上,均只含有1个内含子结构,分布差异较小;各基因编码蛋白主要分布于细胞质中,蛋白保守结构域数量及位置、CHS功能结构域数量均相同,属于亲水酸性蛋白质,不存在跨膜结构;二级、三级结构预测显示该蛋白以α螺旋为主;通过与其他物种花青苷合成相关CHS蛋白进化分析发现,JrCHS1和JrCHS2与金花茶CnCHS、杜鹃花RsCHS及蓝莓VaCHS亲缘关系较近,JrCHS3与毛果杨PtCHS、荔枝LcCHS以及龙眼DlCHS亲缘关系较近,JrCHS4与木薯MeCHS及石榴PgCHS1、PgCHS2亲缘关系较近,表明其功能也较为相似;分析启动子顺式作用元件发现,4个JrCHS基因启动子序列中均包含多个MYB、MYC转录因子结合位点。【结论】4个JrCHS基因及其编码蛋白的结构与功能等较为相似,可能为红仁核桃自然杂交后代不同表型叶片花青苷代谢相关差异表达基因。     

茄子查尔酮合酶基因的克隆与生物信息学分析

以“杭茄1号”紫茄子苗为试材，采用RT-PCR方法克隆CHS基因，利用DNAMAN、MEGA 7.0.26及一些在线网站研究了CHS基因所编码蛋白的结构与功能，以期为研究查尔酮合酶CHS基因在茄子的生长发育中的意义及植物类黄酮的生物合成及其分子机制提供参考依据，同时丰富了双子叶植物CHS超家族的相关研究。结果表明：获得CHS基因全长为1 170 bp,预测该基因编码的蛋白很有可能定位于细胞质中。系统进化分析表明，紫茄子与番茄、芒果、咖啡、短茄在同一个分支，亲缘关系最近，均属于茄科植物。     

杧果查尔酮合成酶基因(CHS1)的克隆与表达分析

【目的】克隆鉴定杧果CHS基因,分析其功能,明确杧果不同组织器官中CHS基因表达情况。【方法】以海南种植的6个杧果种的叶片总DNA和c DNA为模板,进行同源性PCR扩增,然后克隆到p MD18-T载体上,进行测序;通过生物学软件预测分析CHS基因编码的蛋白质;运用半定量PCR分析CHS基因表达情况。【结果】测序得到6个杧果种CHS基因c DNA全长为1 173 bp,CHS基因含有2个外显子和1个内含子。基于c DNA序列的NJ系统发育树显示,其与普通杧果(Mangifera indica)CHS1基因同源性最高。CHS1基因半定量表达显示杧果不同器官均表达CHS1基因,但在叶片和花中的表达量较高。【结论】克隆了杧果查尔酮合成酶1(CHS1)基因,半定量分析了杧果不同器官中CHS1基因的表达差异,为下一步研究提高CHS1基因的表达量奠定了基础。     

柑橘中类黄酮的组成与代谢研究进展

柑橘是人类膳食中类黄酮的主要来源之一。类黄酮对人体健康有多方面的生理功能,且其抗癌、抗病毒、抗炎及抑菌效果可能基于其强抗氧化活性。柑橘中的类黄酮类物质分为黄烷酮、黄酮、黄酮醇、二氢黄酮醇和花色苷等几类,且以黄烷酮糖苷类含量最为丰富。柑橘中类黄酮组成和含量因种质和组织部位而异,柚果实中含有大量苦味的新橘皮糖苷类,而甜橙和橘果实中以无苦味的柚皮芸香糖苷类为主。目前,对类黄酮代谢途径的认识主要局限于其主通路上,但对类黄酮糖基化、酰基化以及甲基化等相关的基因和酶类研究较少。随着柑橘类黄酮代谢研究的深入,其积累和分布的遗传机理将逐渐得以揭示,这将会为培育功能性柑橘新种质提供理论依据。     

苹果果实发育期果皮色泽与色素变化及其相关性分析

以不同色泽野生种质"东北黄海棠Malus.prunifolia(Willd.)Borkh.""冬红果M.prunifolia(Willd.)Borkh.""早白海棠M.asiatica Nakai"果实为试材,对果实发育不同时期果皮色泽、果皮中叶绿素、类胡萝卜素、花青苷、类黄酮和总酚等色素的相对含量进行测定,分析果皮色素、色差的变化及其相关性。结果表明,3个种质苹果发育过程中果皮类胡萝卜素、叶绿素、总酚和类黄酮整体呈下降趋势,类胡萝卜素、叶绿素在东北黄海棠近成熟期含量略有上升,总酚和类黄酮在东北黄海棠花后50d到成熟期含量逐渐上升;冬红果近成熟期果实果皮花青苷含量增加,其他2个种质花青苷含量变化呈略微下降趋势;类胡萝卜素与叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、花青苷、类黄酮、总酚以及L*值都有显著或极显著相关性;叶绿素与类黄酮、总酚有显著或极显著相关性;L*值与花青苷、总酚、类黄酮、类胡萝卜素、叶绿素显著或极显著相关;不同种质苹果皮色差值、各色素之间的相关性不完全一致。     

欧洲葡萄VvMYB6正向调控花青素合成

从欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’中克隆到1个MYB转录因子基因VvMYB6。VvMYB6蛋白定位在细胞核,其N端包含1个保守的R2R3结构域。在葡萄中,VvMYB6主要在在根、花器官及果实发育早期表达。在烟草中异位表达VvMYB6,显著促进花瓣和雄蕊中花青素的积累;代谢组分析发现,相比野生型,转基因植株花中累积高含量的飞燕草色素和矢车菊色素。转基因烟草植株中查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮4–还原酶(DFR)、花青素合酶(ANS)和UDP葡萄糖–类黄酮–O–葡萄糖基转移酶(UFGT)基因表达显著上调。结果表明VvMYB6正向调控花青素合成。     

银杏查尔酮合成酶基因启动子（GbCHSP）调控元件及功能分析

通过染色体步移方法从银杏（Ginkgo biloba L.）基因组中克隆到查尔酮合成酶基因（CHS）翻译起始位点上游1 711 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在多个顺式作用元件,包括紫外/蓝光响应单元、植物激素响应单元、真菌诱导元件、MYB结合位点、TATA-box和CAAT-box等。亚克隆了CHS转录起始位点上游1 402 bp序列,将其与GUS基因构建融合表达载体pBI121 + CHSP,以pBI121-35S作为负对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法分别转入烟草。结果表明,银杏CHS启动子序列能驱动GUS基因在烟草中的表达,表达具有组织特异性。GbCHSP的功能研究将有助于揭示银杏叶黄酮的积累与GbCHS基因表达的分子机理。     

葡萄CHS基因家族鉴定与表达分析

【目的】明确葡萄查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因家族响应外源激素和非生物胁迫的表达模式。【方法】利用生物信息学方法对葡萄CHS基因家族成员进行理化性质、系统进化、共线性、顺式作用元件等分析。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测VvCHS基因在外源激素和非生物胁迫下的表达情况，将筛选出的VvCHS3基因构建植物表达载体并进行烟草瞬时转化以确定其表达位置。【结果】在葡萄基因组中共鉴定出7个VvCHS基因成员，分布于5条不同的染色体上，蛋白质二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主。系统进化和基因对选择压表明，CHS基因家族基因可分为三大亚族，葡萄CHS基因家族与其他物种之间主要进行纯化选择。共线性分析表明，VvCHS3与VvCHS4、VvCHS3与VvCHS5、VvCHS4与VvCHS5之间存在共线性关系。顺式作用元件预测结果表明，大部分VvCHS基因成员可能同时对多种逆境胁迫有响应。qRT-PCR分析发现，VvCHS基因具有明显的组织特异性，在根中表达水平最高，茎中表达水平最低。在5 mmol·L     

柑橘属SAUR基因家族的全基因组鉴定及表达分析

分析SAUR（Small auxin up-regulated RNA）基因家族在不同柑橘基因组中的数量、连锁群分布、基因结构、系统进化、基因表达模式等，从香橼、柚、莽山野橘和克里曼丁橘等基因组中分别鉴定到69、62、58和70个SAUR基因。SAUR在基因组上分布不均，呈现明显的串联重复现象，基因家族成员的差异可能是由于串联重复和染色体大片段复制引起。大多数柑橘SAUR基因不含内含子，含有SAUR特有的4个保守motif。系统进化树分析显示，来源于拟南芥、水稻、番茄、马铃薯和柑橘的629个SAUR基因分为9组，每一组都含有5个物种的家族成员，并且同一个物种的SAUR基因具有较近的遗传距离。顺式元件分析表明，CclSAUR基因家族成员的上游序列含有光响应、转录因子结合、激素响应、伤害响应、低温响应、玉米素代谢和类黄酮生物合成相关的元件。qRT-PCR分析结果显示，大多数CclSAUR都能响应外源IAA和低温处理。     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因抗白粉病功能分析

中国野生毛葡萄（Vitis quinquangularis）‘丹凤–2’白藜芦醇含量高，并抗白粉病。以此为材料，利用同源序列克隆技术获得两个芪合酶基因 VqSTS12 和 VqSTS25。以欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导法进行遗传转化，分别获得 7 个 VqSTS12 和 5 个 VqSTS25‘无核白’葡萄转基因植株。实时定量 PCR 分析发现，与野生型植株相比，转基因植株中芪合酶基因 STS 与下游白藜芦醇糖基转移酶基因 RSGT 表达量升高，与 STS 有底物竞争关系的查尔酮合酶基因 CHS 表达量降低。STS 的表达产物中主要的芪类物质反式云杉新苷含量增加。选择芪类物质含量高的转基因植株接种白粉菌发现，转基因植株对白粉菌的敏感性降低，发病较晚，病情较轻，在转基因植株上部分孢子萌发受抑制，菌丝发育迟缓。转基因植株中 VqSTS12 和 VqSTS25 受白粉菌诱导表达：在接菌后 1 ~ 3 d 内表达量显著升高，随后略有下降，在 6 ~ 7 d 表达量再次上升。同时高效液相色谱（HPLC）检测到 STS 的表达产物白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素与紫檀芪含量增加。研究结果表明‘丹凤–2’毛葡萄拥有的 VqSTS12 和VqSTS25 及其表达的芪类物质具有抑制白粉菌的作用。     

瓜叶菊花青素合成关键结构基因的分离及表达分析

 本文通过RT-PCR的方法分离了花青素合成途径上的关键结构基因片段：CHS、CHI、F3H、F3'H和DFR。在白色系、红色系、紫色系和蓝色系瓜叶菊舌状花中，采用半定量RT-PCR的方法分析CHS、CHI、F3H、F3'H、DFR、F3'5'H、3MaT这7个结构基因在花不同发育阶段的表达模式。结果表明：在白色花中，不存在CHS的表达；在红色花中，检测到F3'H基因的高丰度表达，但没有检测到F3'5'H的转录本；在蓝色花中，没有F3'H表达的信号，但在花序开放的第Ⅰ阶段有较强的F3'5'H的表达信号；而在紫色花中，可以同时检测到F3'H和F3'5'H的转录本。此外，瓜叶菊花青素合成相关结构基因在花序开放初期高丰度表达，随后逐渐降低，在第Ⅳ阶段表达量再次出现升高现象，而在花序开放末期表达量极低或没有表达信号。     

柑橘中黄龙病菌效应子SDE70的表达特征及寄主互作蛋白解析

柑橘黄龙病菌主要致病种亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’，Las）具有完整的Sec依赖型分泌系统，可分泌致病因子（效应子）作用于寄主靶标蛋白或基因，调控寄主的抗（感）病反应。为了研究黄龙病菌Sec依赖型效应子在柑橘中的致病机理及其寄主靶标基因，本研究中从感病‘锦橙’中克隆了Las病原菌Sec依赖型效应子基因SDE70（CLIBASIA_02470）。生物信息分析显示，SDE70蛋白全长132个氨基酸，N端20个氨基酸为典型信号肽。大肠杆菌碱性磷酸酶活性分析显示，该信号肽具有胞外分泌功能。亚细胞定位显示，SDE70::GFP融合蛋白在洋葱细胞质和细胞核中积累。定量PCR分析发现，耐黄龙病酸柚显症叶脉中SDE70表达量显著低于未显症叶脉，相反，易感黄龙病‘锦橙’显症叶脉中表达显著高于未显症叶脉；‘锦橙’根中SDE70表达量显著高于叶脉，而幼叶叶脉中显著低于老叶。SDE70在不同品种不同症状发育时期以及不同组织中表达差异显著。利用酵母双杂交试验筛选获得26个与SDE70互作的柑橘蛋白。GO富集分析表明，42.3%的蛋白质与细胞内生物合成过程有关；65.4%的靶标蛋白位于细胞质或质膜上；34.6%的靶标蛋白具有核糖核苷酸结合的分子功能。进一步酵母点对点杂交试验验证3个与SDE70效应子强相互作用的靶标蛋白（CsTRAPP、CsARF、CsRub1），其主要参与植物囊泡转运、类泛素化等过程，暗示SDE70效应子极有可能调控柑橘信号转导和胞质运输途径影响寄主抗（感）病反应。     

柑橘中挥发性萜类物质代谢研究进展

柑橘中挥发性物质以萜类为主，不仅影响植株与环境间的信号传递和赋予果实的香气，而且对消费者的感官体验及人体健康有多样的功能。对柑橘中挥发性萜类物质生物学功能、代谢谱的种质及组织特异性、合成途径相关基因及挥发性物质与柑橘分类等研究进展进行了综述。提出目前对柑橘挥发性萜类物质的研究仅限于代谢通路及代谢谱分析；在成分分析上多以游离态为主，糖苷等键合态的分析较少；已明确功能的结构基因及调控基因报道较少，香气品质的形成机理尚有待深入解析。展望未来，基础研究方面应重点揭示柑橘中挥发性萜类物质代谢的进化和演变规律、重要结构基因及转录因子调控机制等；生产应用中关注开发利用现有具特异香味种质、创制特殊香味新品种以及提升香气品质的栽培措施。     

Expression of chalcone synthase and chalcone isomerase genes and accumulation of corresponding flavonoids during fruit maturation of Guoqing No. 4 satsuma mandarin (Citrus unshiu Marcow)

Chalcone synthase (CHS) and chalcone isomerase (CHI) are two key genes involved in flavonoid biosynthesis. They were both cloned from Guoqing No. 4 satsuma mandarin (Citrus unshiu Marcow), and their relative expression and accumulation of corresponding flavonoid components during fruit maturation were investigated by real-time PCR and HPLC techniques, respectively. During fruit maturation, expression of CHS and CHI genes declined gradually in peels, as well as the concentrations of total flavonoids, trans-chalcone, narirutin and hesperidin; in pulps, however, expression of both genes showed an approximately uptrend, and the concentrations of total flavonoids and those three components were detected in a lower level without significant changes among different developmental periods (P < 0.05). This research confirmed that expression of CHS and CHI genes was positively correlated with flavonoid accumulation and overexpression of them could be a potential approach to produce massive desired flavonoids in citrus fruits.     

西瓜YUCCA 基因家族鉴定及在果实成熟过程中的表达分析

以栽培西瓜自交系97103 为试材，测定不同发育时期果肉及果皮中游离态吲哚-3- 乙酸（IAA）含量。结果显示：果实发育后期，果肉中IAA 含量显著上调，果皮中IAA 含量则一直保持较低水平，推测果肉中IAA 可能对西瓜果实成熟与含糖量积累起重要作用。利用生物信息学手段，鉴定了西瓜生长素合成色氨酸依赖途径限速酶基因家族YUCCA，并对其在果肉与果皮组织的表达水平进行qRT-PCR 检测。结果表明：西瓜YUCCA 基因家族包含 10 个成员，所有YUCCA 基因均含有FMOs 保守结构域，聚类分析表明其分为两大类。基因结构分析显示这些基因包含 2～5 个外显子。ClYUCCA4、ClYUCCA6、ClYUCCA10b 及 ClYUCCA10c 等4 个YUCCA 基因在西瓜果肉中表达，且都在果实发育后期表达明显上调。ClYUCCA4 及ClYUCCA10c 在果肉与果皮中的表达量变化与IAA 含量变化趋势一致，且在其他组织中几乎检测不到表达，推测其可能参与调控西瓜果实的成熟。     

辣椒细胞核雄性不育系主要农艺性状的对比及生理特性分析

以辣椒核雄性不育两用系GMSDS-702A、GMSDS-702B 为试验材料，对其主要农艺性状进行调查，并对花蕾不同 发育时期的相关生理指标的含量进行测定。结果表明，不育系植株的营养生长较旺盛，株高、开展度明显高于可育系；不育 系花药干瘪、表面褐化，组织结构硬化，花药紧闭无法形成正常花粉粒；可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸、丙二醛含量 在不同发育时期的含量均有不同程度的差异，小孢子母细胞期不育系开始表现为可溶性糖、游离脯氨酸含量大幅降低，丙二 醛含量处于较高水平，可育系则相反，可能与小孢子的败育存在一定内在联系。