家蚕滞育卵浸酸后易溶性蛋白的表达差异分析

探明浸酸解除家蚕卵滞育的关联蛋白,可为改进和提高蚕种的人工孵化技术提供理论依据。以经2.5℃冷藏45 d的家蚕品种"7.湘×9.芙"滞育卵为材料,采用双向凝胶电泳和图像分析技术,比较浸酸与未浸酸蚕卵易溶性蛋白的差异变化。在未浸酸蚕卵的双向电泳图谱中共检测到523个蛋白质斑点,其中特异性蛋白质斑点41个;浸酸卵共检测到526个蛋白质斑点,其中特异性蛋白质斑点44个。浸酸与未浸酸蚕卵能相互匹配的蛋白质斑点有482对,匹配率91.897%。经对比分析,浸酸活化后的蚕卵蛋白出现了一些特异性的蛋白质斑点,或某些蛋白质斑点在含量上出现了差异变化。     

家蚕Polycomb家族基因BmEsc功能结构域编码序列的克隆及表达分析

Polycomb蛋白(polycomb group proteins,PcG)主要包含PRC1和PRC2 2个核心蛋白质复合体,其中PRC2在靶基因转录抑制起始阶段发挥作用,ESC作为PRC2的一个关键蛋白质,通过参与组蛋白H3K27me3的修饰来抑制基因转录。为了研究家蚕PcG蛋白的功能,克隆了长度为876 bp的家蚕Esc基因(BmEsc)WD40功能结构域编码序列,构建重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,成功表达并纯化了目的蛋白质,可用于进一步的抗体制备和功能研究。利用实时荧光定量PCR检测BmEsc基因在家蚕不同发育时期的表达特征:非滞育卵中该基因的表达水平在卵期1~5 d相对较高,而滞育卵中该基因在卵期1~2 d的表达量低于非滞育卵,卵期6~9 d的表达量却高于非滞育卵,并保持较稳定水平;该基因在各龄幼虫龄中期的表达量较低,在5龄1~3 d和化蛹前的一段时期表达量较高,在蛹期的表达水平变化不大。初步推测BmEsc可能在家蚕早期胚胎发育、滞育卵中的靶基因沉默以及在幼虫蜕皮前后和化蛹变态前的组织分化过程中发挥重要作用。     

柞蚕滞育蛹与非滞育蛹蛋白质表达差异初步分析

柞蚕是以蛹滞育越冬的昆虫之一,研究滞育蛹及非滞育蛹的蛋白质种类及含量的变化规律,有利于其滞育机理的解明。通过SDS-PAGE获得滞育与非滞育雄性柞蚕蛹的蛋白质图谱在分子质量16～105 kD范围内均出现清晰的25条带,其中大小为79、54、48、29 kD的蛋白质表达量较高,79 kD的蛋白质为高丰度表达的大分子质量蛋白质;采用2D-PAGE技术分析,在滞育蛹蛋白质样品中检测到的总蛋白质斑点数为400个,非滞育蛹蛋白质样品中检测到的总蛋白质斑点数为619个,非滞育蛹蛋白质斑点明显增多,二者蛋白点匹配率仅为37%,蛋白质的等电点变化剧烈,差异性较大,匹配率较低。研究结果提示柞蚕蛹滞育过程中蛋白质的数量和种类发生了明显变化。     

天蚕与美洲野蚕远缘杂交后代的滞育性及化性

以天蚕 (A .yamamai)为母本 ,以美洲野蚕 (A .polyhemus)为父本的远缘杂交 ,后代均以卵滞育越冬 ,多数表现为一化性 ,仅少数蛾区和个体夏卵不滞育 ,表现为二化性。从F1代起 ,就有完全滞育蛾区和不完全滞育蛾区之分 ,完全滞育蛾区占总受精蛾区数的 37 7%,而不完全滞育蛾区内的滞育卵占总受精卵数的 91 0 %。低温可以促进夏卵滞育的解除。     

天蚕与美洲野蚕远缘杂后代的滞育性及化性

以天蚕（A.yamamai)为母本，以美洲野蚕（A.poyhemus)为父本的远缘杂交，后代均以卵滞育越冬，多数表现为一化性，仅少数蛾区和个体夏卵不滞育，表现为二化性。从F1代起，就有完全滞育蛾区和不完全滞育蛾区之分，完全滞育蛾区占总受精蛾区数的37.7%，而不完全滞育蛾区内的滞育卵占总受精卵数的91.0%。低温可以促进夏卵滞育的解除。     

家蚕滞育卵冷藏随时孵化法的研究

家蚕卵滞育后入库冷藏,若还未解除滞育前,难以中途出库应用于生产,使蚕种利用受到很大的限制。近年来我们进行了家蚕滞育卵冷藏随时孵化法的研究。结果表明:采用二段高温人工孵化法可使滞育卵入库冷藏后10—60天随时出库利用,其实用孵化率均达90％以上,对幼虫的体质和茧质不但无不良影响,而且有提高的倾向。     

生长激素转基因家蝇的建立

利用显微注射技术，将人生长激素表达载体导入家蝇受精卵，人工孵化后收集子１、２代卵，提取染色体，经核酸探针及ＰＣＲ特异片段扩增检测，两代均为阳性。对整合阳性卵孵化至幼虫，热冲击诱导后立即进行表达检测，结果发现，人生长激素在蝇幼虫体内实现了表达，表达量最高可达４．０４μｇ／Ｌ。对转基因家蝇不同发育阶段的表型特征进行了观察，未发现明显变化     

哺乳动物蛋白质间相互作用对精卵识别的研究进展

哺乳动物的受精过程是由一系列有序步骤的特异性蛋白质经过特定识别结合而成的,最终使精卵质膜融合形成受精卵。近年来,科学家运用基因组学和蛋白质组学的技术在哺乳动物精子和卵细胞表面发现了许多可能参与受精过程的的特异性蛋白分子,但哺乳动物蛋白质间相互作用对精卵识别的具体机理尚不清楚。综述了参与精卵识别的相关蛋白质,为未来的研究精卵识别提供参考。     

滞育诱导发生温度与光周期对家蚕垂体同源框激素基因Pitx表达的影响

家蚕垂体同源框激素PITX对滞育激素DH的分泌与作用有直接影响。为了探讨家蚕滞育的信号传导机制,研究了3种典型的滞育发生诱导温度和光周期条件对Pitx基因表达的影响。结果显示,亲代催青期滞育卵诱导发生条件25LL显著上调了蚕卵中Pitx基因表达水平。整个世代持续25LL环境中,3龄前幼虫和成虫体内,Pitx基因的表达水平高于15DD环境中的蚕体;胚后蚕体Pitx基因的表达水平有显著组织差异,幼虫眠中表达水平有下调趋势。子代卵内Pitx基因mRNA的水平变化与亲代诱导所致的蚕卵滞育性差异密切相关,滞育性卵中未检测到母源Pitx基因的mRNA,卵龄12～24h的胚胎发生期则有较高水平的表达,卵龄72h后的滞育发生阶段后只有痕迹量;非滞育性卵中有较高水平的母源Pitx基因mRNA,胚胎发生及发育期,Pitx基因转录水平显著高于滞育性卵;亲代20LD催青条件下所产卵滞育性不稳定,Pitx基因的mRNA水平显著高于滞育性卵,也高于非滞育性卵。亲代卵的孵化温度与光周期决定子代卵的滞育性,也影响到Pitx基因表达水平,子代卵内Pitx基因表达水平高低不是蚕卵滞育与否的关键。     

合成滞育激素对家蚕卵碳水化合物代谢的影响

为了进一步阐明家蚕滞育激素在诱导滞育卵发生以及对蚕卵滞育过程中碳水化合物代谢的调节作用 ,对低温 (16℃ )暗催青的二化性品种大造 ,在化蛹初期注射合成滞育激素 ,诱导其产下滞育卵 ,然后将这种滞育卵分别用 2 5℃和 5℃保护 ,调查其在滞育过程中糖元、海藻糖、山梨醇和甘油量的变化。结果发现 ,从化蛹第 3天开始 ,每天注射 15 0pmol/头合成滞育激素 ,连续 3次 ,可得到 70 %左右的滞育卵。这种滞育卵在产卵初期糖元的含量与自然滞育卵相似 ,但山梨醇的含量仅有自然滞育卵的 5 0 %左右。诱导滞育卵在 5℃中保护时 ,解除滞育的时间比自然滞育卵提前 ,孵化率比自然滞育卵低 2 0 %左右。未孵化卵大多在转青期死亡。由上述结果推测 ,这种诱导滞育卵在产卵初期糖元与山梨醇的代谢间存在某种障碍 ,从而影响山梨醇的合成 ,导致滞育的提前解除和胚胎发育异常。     

二化性家蚕卵低温和常温催青的胚胎期蛋白质表达差异分析

家蚕二化性品种的滞育性受上代胚胎期环境条件调控,查找家蚕胚胎期滞育关联蛋白,可为最终阐明家蚕滞育的分子机制提供实验依据。以家蚕二化性品种秋丰的蚕卵为材料,分别在25℃常温和18℃低温条件下催青,提取胚胎不同发育时期蚕卵的易溶性和难溶性蛋白,采用蛋白质双向电泳(2-DE)和图像分析技术,研究蚕卵在胚胎不同发育时期的蛋白质差异表达谱。在易溶性和难溶性蛋白图谱中分别检测到5个和7个差异显著的蛋白点。对这些差异蛋白点进行质谱鉴定,有8个蛋白点得到可信的最佳匹配蛋白报告,共鉴定出卵特异蛋白、卵黄原蛋白、表皮蛋白和丙酮酸脱氢酶激酶4种蛋白。这些差异表达蛋白可能导致蚕卵胚胎中物质代谢和能量代谢的不同,据此推测低温和常温催青可能在蚕卵胚胎中诱导了不同的生理生化反应。     

中国野桑蚕人工饲料育研究初报

为解决野桑蚕作为试验昆虫在室内饲养难的问题,以江苏启东野桑蚕为材料,用家蚕低成本饲料进行了饲育研究。在催青期温度25℃、饲育温度27~25℃以及光照条件1~2龄12 L 12 D、3~5龄15 L 9 D的条件下,野桑蚕人工饲料育的2龄起蚕率为31.3%,幼虫期20~48 d,雌、雄蛹体质量分别为0.45、0.25 g,蛹期17~23 d,雌蛾平均产卵266粒,产滞育卵的母蛾占45.0%。研究结果表明,人工饲料育能够使野桑蚕顺利完成世代发育。     

冷藏期家蚕滞育卵和即时浸酸卵的H2O2含量及过氧化氢酶基因表达的变化

将产下后48h的家蚕滞育卵和即时浸酸卵进行低温(5℃)冷藏处理30d以上,滞育卵孵化率显著上升,而即时浸酸卵孵化率显著下降。为了探讨低温处理对滞育卵和即时浸酸卵的孵化产生不同影响的分子机制,测定了冷藏期间2种卵中的H2O2含量、过氧化氢酶(CAT)基因mRNA转录水平和CAT活性变化。结果表明:2种卵在冷藏期间随着卵中的H2O2含量显著增加,CAT基因mRNA转录水平也上调;虽然冷藏后的10～70d,2种卵中的H2O2含量、CAT基因mRNA转录水平及CAT活性都显著上升,但滞育卵的H2O2含量仍显著高于即时浸酸卵,而CAT基因mRNA转录水平和CAT活性则显著低于即时浸酸卵。即时浸酸卵在冷藏过程中H2O2含量显著增加,可能造成了对胚胎的氧化伤害,从而降低其孵化率。然而,滞育卵在冷藏过程中的CAT基因mRNA转录水平及CAT活性相对较低,H2O2相对较高,胚胎却未受到氧化伤害,推测低温处理可能诱导了滞育卵中其它抗氧化反应。     

诱导滞育的温度和光照节律对家蚕滞育激素基因Dh表达的影响

滞育激素(DH)是导致家蚕滞育生理现象出现的关键因素。研究卵期不同温度和光照节律引起家蚕滞育激素基因Dh表达的变化,探讨温度和光照对家蚕滞育调控的机制。催青期25℃持续光照(25LL)条件下,蚕卵中Dh基因mRNA高水平稳定转录;而在15℃持续黑暗(15DD)条件下,蚕卵中只有痕迹量Dh基因mRNA存在;25LL或者20℃、光照与黑暗12h交替(20LD)条件下,胚胎发育至单眼着色后(有效积温2160℃.h以后)Dh基因mRNA转录水平显著上调,与此时期胚胎对诱导滞育的温度和光照节律更加敏感一致。从催青期开始整个世代的保护温度和光照节律,呈现高温25℃显著上调整个胚后时期Dh基因mRNA转录水平,光照上调蛹期与蛾期Dh基因mRNA转录水平,且高温的作用强于光照。5龄第3天幼虫的基因芯片表达谱显示,Dh基因mRNA转录水平存在显著的性别与组织差异,雌蚕多个组织中的Dh基因mRNA转录水平都显著低于雄蚕,卵巢中的Dh基因mRNA只有痕迹量。亲代卵的催青温度与光照节律决定子代卵的滞育性,也影响到Dh基因mRNA的转录水平;但子代卵内Dh基因mRNA转录水平高低不是蚕卵滞育与否的关键。推测家蚕Dh基因表达的性别差异及在早期蚕卵中表达特征与滞育性不一致的现象,可能与Dh基因的前体多肽翻译产物剪切有关。     

3-氨基三唑与过氧化氢共同处理对家蚕滞育发动的影响

研究有效阻止家蚕滞育发动的措施发现 :在家蚕滞育发动期间 ,仅用过氧化氢酶 (catalase ,CAT)的专一性抑制剂 3 氨基三唑 (3 amino 1,2 ,4 triazole ,AT)处理滞育性蚕卵仍不能阻止家蚕滞育发动 ;但先用AT处理抑制CAT活性后 ,再用H2 O2 处理可有效阻止家蚕滞育发动。     

二化性家蚕滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶活性的变化

二化性家蚕卵以25℃和15℃催青,可分别诱导成虫产下子代滞育和非滞育卵,而即时浸酸和5℃左右的低温处理可以分别阻止和解除胚胎滞育。利用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)显色法测定了经上述处理后的胚胎滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)的活性,结果表明:胚胎发育后期的蚕卵经25℃催青,卵中的GST活性显著高于15℃催青蚕卵;蚕卵即时浸酸未显著改变胚胎滞育发动阶段蚕卵中的GST活性;5℃低温处理显著提高了滞育卵中的GST活性,但是未能显著改变即时浸酸卵的GST活性。上述结果表明,蚕卵中的GST活性变化与二化性家蚕胚胎滞育诱导和解除密切相关。     

家蚕卵长期保存中碳水化合物和蛋白质的代谢变化

应用气相色谱法、酚—硫酸法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描等方法,测定了现行品种(苏5×苏6)蚕卵滞育各阶段山梨醇、糖元和主要卵黄蛋白质的代谢变化,并探讨了环境温度与蚕卵长期保存的关系。结果表明:(1)家蚕卵滞育各阶段山梨醇、糖元的含量和卵黄蛋白质的某些电泳区带发生了规律性的变化。(2)山梨醇含量的变化,可作为生化指标监测和判断蚕卵的滞育阶段。(3)0℃区的环境温度调节,是一种能及时和2充分适应蚕卵滞育各阶段生理要求的、比较理想的长期保存蚕卵的方法。     

家蚕5龄幼虫不同时期中部丝腺细胞蛋白质双向电泳分析

对5龄家蚕不同发育时期的中部丝腺细胞蛋白质变化进行分析研究,有利于发现与丝胶蛋白分泌有关的功能蛋白质。采用蛋白质双向电泳和图像分析技术,发现同一区段的家蚕中部丝腺细胞在5龄第2天、第4天和熟蚕期的蛋白质组成具有显著差异:中部丝腺前部区段5龄第2天表达的特异性蛋白质斑点有8个,第4天有16个,熟蚕期有24个;中部区段5龄第2天表达的特异性蛋白质斑点有9个,第4天有33个,熟蚕期有30个;后部区段5龄第2天表达的特异性蛋白质斑点有10个,第4天有7个,熟蚕期有25个。