谷子DnaJ蛋白基因的克隆

DnaJ蛋白是近年研究较多的同热激等胁迫反应相关的基因。本研究用0.8%NaCl胁迫下的谷子幼苗提取RNA,用反转录酶M-MLV扩增得到第一链cDNA,再以第一链cDNA为模板进行PCR扩增,克隆获得了完整的谷子DnaJ蛋白基因,该基因cDNA全长1 260 bp,编码419个氨基酸,具有DnaJ蛋白分子伴侣系统的3个保守结构域。将谷子DnaJ蛋白基因构建入表达载体pGFP,获得了谷子DnaJ基因的表达载体。该基因的克隆和表达载体构建,为谷子DnaJ蛋白基因的功能分析以及谷子耐热抗旱机理研究有重要意义。     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

割手密2个DREB2基因的克隆与比较分析

干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein,DREB),在植物应对干旱、盐碱和低温胁迫的反应中起非常重要的调控作用。利用已知的甘蔗栽培种DREB2转录因子序列,设计引物,按照同源克隆的方法,获得了2个割手密DREB2基因组DNA序列,分别命名为Ss DREB2-a和Ss DREB2-f(Gen Bank登录号分别为:KU963272和KU963277)。序列分析结果表明,Ss DREB2-a基因序列全长为1 578 bp,Ss DREB2-f基因序列全长为1 729 bp,2个基因均包含1个内含子和2个外显子。Ss DREB2-a和Ss DREB2-f基因的c DNA序列全长分别为824 bp和971 bp,均编码262个氨基酸。序列比对分析显示,2个基因的序列相似性为96.6%,编码的蛋白相似性为98.9%,存在3个氨基酸变异位点。系统进化分析结果显示,割手密DREB2转录因子与高粱、牛鞭草、斑茅、玉米等植物的DREB2转录因子的同源关系最近。基因的获得为下一步了解DREB2基因表达与割手密抵御非生物胁迫能力之间的关系奠定了基础。     

Molecular Cloning and Preliminary Analysis of Clmk-1 Gene in Cochliobolus lunatus

谷子弯孢病菌(Cochliobolus lunatus)为谷子上重要的叶部病害,发生严重时会影响谷子的产量及品质.为了解MAPK级联途径在谷子弯孢病菌发育及致病性中的作用,根据已知植物病原真菌MAPK基因的保守结构域设计简并引物,通过PCR扩增法获得了谷子弯孢病菌MAPK基因的同源片段,并利用RACE技术获得了基因的全长cDNA 序列,该基因命名为Clmk-1.Clmk-1基因开放阅读框为1065bp,编码354个氨基酸,并且含有MAPK基因的保守的TGY和CD基序.聚类分析结果表明,谷子弯孢病菌Clmk-1基因与其他植物病原真菌Hog1类似MAPK基因的同源性很高.利用Promoterscan软件发现,Clmk-1基因启动子区含有热激转录因子(HSF)、ADR转录因子和GCR转录因子的结合元件.MAPK途径特异性抑制剂U0126抑制谷子弯孢的孢子萌发及芽管发育.研究初步表明,Clmk-1基因为Hog1类似MAPK基因,可能与渗透胁迫相关,并且MAPK级联途径参与病菌孢子萌发及芽管形态建成.克隆的Clmk-1基因为进一步研究谷子弯孢病菌MAPK基因的功能奠定基础.     

斑茅铜锌超氧化物歧化酶基因(SaSOD-1)的克隆与序列分析

斑茅是甘蔗近缘野生种之一,具有较强的抗逆性,研究并开发利用斑茅的强抗逆基因,对甘蔗育种具有重要意义。本研究以高粱Cu/Zn-SOD(登录号:XM 002445626.1)cDNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行检索、比对、拼接,通过设计特异引物,PCR扩增和序列分析验证,克隆得到2个Cu/Zn-SOD(SaSOD-1a和SaSOD-1b,登录号:KJ001795和KJ001796)基因全序列,其中SaSOD-1a基因组序列全长2 473 bp,SaSOD-1b基因组序列全长2 228 bp,均有8个外显子,7个内含子,其cDNA序列长度均为692 bp,编码206个氨基酸。序列比较分析表明,SaSOD-1a和SaSOD-1b序列相似性为98.6%,有8个单核苷酸多态性位点,蛋白质相似性为99.0%,2个氨基酸变异位点。用推导出的氨基酸序列与其它植物做同源进化分析,与高粱、玉米、谷子等比较均表现出较高的保守性。研究结果可为进一步了解超氧化物歧化酶与斑茅耐旱性的关系奠定基础。     

谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)对逆境胁迫的响应

为解析谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,Phosphoenolpyruvate carboxylase)在非生物逆境胁迫下的响应特征。从谷子基因组中鉴定出一个Si PEPC(Seita. 1G020700)基因,利用相关软件对其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信号途径、顺势应答元件等参数特征进行分析和预测,随后分析了该基因在幼苗期逆境胁迫下的动态表达模式及在拔节期、抽穗期、灌浆期不同光照处理和干旱胁迫下的表达。结果表明,该基因位于谷子1号染色体,基因组序列长6 652 bp,编码965个氨基酸,基因无可变剪切、不含内含子;功能域分析显示,该基因含PEPC基因的特征结构域;多序列比对发现,该PEPC蛋白与其他植物PEPC蛋白非常相似,具有非常保守的序列结构。实时荧光定量PCR分析表明,Si PEPC(Seita. 1G020700)在ABA、低温、PEG、高盐胁迫下表达量均有所上调,其中,在ABA处理时,表达量呈现波动,在12 h被诱导达到峰值。在低温处理时,表达量持续上升,在24 h达到峰值;在PEG和Na Cl处理时表达量整体呈上升趋势,均在12 h达到峰值,在24 h其表达量均急剧下降。进一步研究表明,Si PEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应,推测Si PEPC(Seita. 1G020700)基因参与了谷子对非生物逆境的应答,可能在干旱和其他逆境胁迫信号途径中起关键作用。     

苎麻Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析

以耐旱性较强的湘苎3号为材料,从苎麻转录组测序结果中获得了1个与P5CS基因高度相似的Unigene,该片段长1 448 bp,根据该序列设计5′RACE和3′RACE槽式PCR引物,利用RACE结合RT-PCR技术分别克隆得到590 bp的5′端和293 bp的3′端,拼接获得该基因全长cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析表明,该基因全长为2 318 bp,其中开放读码框为2 154 bp,编码717个氨基酸,其编码蛋白质的等电点和分子量分别为6.57 kD和77.56 kD,与亚洲棉、麻风树、拟南芥和水稻的P5CS基因的核苷酸序列相似性分别为81%、81%、75%和72%,蛋白质序列的相似性分别为86%、85%、78%和77%,说明该基因与P5CS为同源,被命名为BnP5CS1。半定量RT-PCR分析表明,该基因在苎麻的茎尖中表达量最高,在根中其次, 且受干旱胁迫的诱导。P5CS基因是植物体内合成脯氨酸的关键酶基因,BnP5CS1基因的克隆将为苎麻的抗逆分子育种和进一步的功能分析鉴定基础。     

海南粗榧GGPPs基因克隆与诱导表达分析

濒危植物海南粗榧富含多种抗癌活性次生代谢产物。为研究这些产物的生物代谢途径和表达调控,通过同源克隆和RACE技术获得了海南粗榧紫杉醇生物合成途径中通用前体牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(GGPPs)基因全长并进行了生物信息学分析。该基因命名为CmGGPPs(GenBank登录号:JX971119),并进一步利用不同激发子诱导研究了该基因对不同逆境信号的响应情况。结果表明:海南粗榧GGPPs基因cDNA全长1694bp,包含一个1182bp的ORF框,编码393个氨基酸;预测该基因编码蛋白质分子量为42.91kD,其等电位为7.12。通过BLAST比对结果分析,海南粗榧GGPPs基因全长核苷酸序列与红豆杉科植物的同源性最高可达91%,氨基酸序列有89%的相似性。同时,GGPPs基因氨基酸序列同其他植物也有较高的同源性。用不同类型激发子处理发现,GGPPs在诱导后表达量均上升,但不同激发子诱导的基因表达强度和速率存在明显区别。     

一个水稻小G蛋白OsRan1的克隆及表达分析

逆境对于水稻产量和品质有很大影响,研究在逆境下水稻基因的表达变化对于研究水稻抗逆有着重要意义。该实验运用荧光差异显示(Fluorescence Differential Display, FDD)技术,从低温处理的水稻中克隆到OsRAN1基因并通过半定量PT-PCR分析该基因在低温和高盐逆境下的表达。该基因cDNA序列全长为984bp,含有一个编码221个氨基酸残基的开放阅读框,推测分子量为25.0 KD,此氨基酸序列具有GTPase活性区域,属于小G蛋白Ran亚家族,通过氨基酸相似性比对发现,Ran家族氨基酸序列高度保守,OsRAN1与TaRAN1和AtRAN1相似性分别达到98.19%和92.76%。通过半定量PT-PCR分析,发现在低温胁迫下,OsRAN1在根和叶鞘中表达量均有增加,尤其是高盐胁迫下根中OsRAN1表达量有迅速升高然后降低的变化。推测该基因在水稻逆境应答中起着重要作用。     

花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

萌发期耐莠去津谷子种质资源筛选及评价

研究100份谷子种质资源萌发期耐除草剂莠去津特性,分析莠去津胁迫条件下谷子发芽势、发芽率、芽长和根长等的变化。结果表明,2.0mL/L的莠去津浓度是谷子萌发期耐莠去津筛选的最适浓度;在此浓度胁迫下,100份谷子材料萌发期各性状相对值的变异系数为发芽相对莠去津胁迫率>相对发芽势>相对活力指数>相对发芽指数>相对芽长>相对发芽率>相对根长;根据T值的聚类分析,将供试品种划分为4个莠去津耐性级别,高耐品种24份、中耐品种28份、中感品种31份和高感品种17份;汾选3号、紫根谷子、公矮2号、山西乌谷、河北香谷和草谷子6个品种为综合耐莠去津能力强的资源。     

100份谷子品种资源萌发期耐盐性评价及耐盐品种筛选

研究了100份谷子品种资源萌发期盐胁迫条件下芽、根的变化,并对供试材料的耐盐性进行了综合评价和等级划分,结果表明：150mmol/L的NaCl溶液是谷子萌发期耐盐筛选的最适浓度;盐胁迫条件下谷子芽受到的抑制作用小于根;100份谷子品种资源各测定指标变异系数由大到小顺序为：发芽相对盐害率>相对活力指数>相对发芽势>相对根干重>相对芽干重>相对发芽指数>相对芽长=相对根长>相对发芽率;晋育红谷、公矮6号、红钙谷和晋谷29共4个品种为综合耐盐能力强的资源。     

谷子芽期耐盐碱综合鉴定及评价

以全国主推的53个谷子品种为材料,在100 mmol L~(-1)混合盐碱(NaCl∶NaHCO_3=4∶1)胁迫下研究了不同谷子品种的耐盐碱性。结果表明,在盐碱胁迫下, 53个谷子品种的发芽势、发芽率、根长、芽长、根鲜重和芽鲜重均受到不同程度的抑制,以对根长的影响最大;相对发芽势与相对发芽率、相对根长与相对芽长及相对根鲜重与相对芽鲜重均呈显著或极显著正相关。通过主成分分析将14个单项性状指标转化为4个主成分,累积贡献率为90.4%;以4个主成分的得分值通过隶属函数分析获得不同品种耐盐碱的综合得分值,并通过聚类分析将53个谷子品种划分为6种耐盐碱类型,其中强耐盐碱品种2个,耐盐碱品种16个,中间型品种17个,盐碱敏感品种6个,不耐盐碱品种9个和极不耐盐碱的品种3个。同时利用回归分析建立了可用于评价谷子耐盐碱性的回归方程D'=0.298+0.037X_2+0.144X_3+0.018X_6+0.209X_7-0.183X_9+0.115X_(11)-0.201X_(12)+0.112X_(13)-0.101X_(14)+0.284X_(15),相对发芽率、根长盐害率、芽长盐害率和根冠比盐害率可以作为谷子耐盐碱性的评价指标。     

谷子品种（系）萌发期耐盐碱性鉴定及评价

为鉴定谷子品种（系）的耐盐碱性,以24个谷子品种（系）为试验材料,设置0、40、80、120和160mmol/L5个盐碱梯度,通过对响应盐碱胁迫的8个主要指标进行多重比较、相关性分析、主成分分析、隶属函数分析、聚类分析、灰色关联度分析及回归分析等了解谷子萌发期对盐碱胁迫的响应并筛选出强耐盐碱性材料。结果表明,耐盐碱性谷子鉴定的最适宜盐碱浓度为80mmol/L。根据综合耐盐碱系数（CDC值）、耐盐碱性度量值（D值）及加权关联度（WDC值）对谷子耐盐碱性进行排序,其中耐盐碱性最强的5个品种（系）为泰谷004、豫谷18、龙谷25、冀谷168和K148。通过聚类分析将供试材料分为4类,分别包含9、10、3和2个品种（系）。灰色关联度及逐步回归分析表明,相对发芽势、相对发芽率、相对根长和相对芽长4个指标可以作为谷子品种耐盐碱性鉴定的综合指标。本研究为谷子盐碱机制的深入研究提供理论依据,为耐盐碱新品种的选育提供重要材料基础。     

不同形态硒及用量对幼苗期谷子生长与生理的影响

为探究不同形态硒及用量对谷子生长和抗性的影响，选用0.0、0.1、0.5、1.0、10.0mmol/L亚硒酸钠和纳米硒，通过水培试验研究不同形态硒浓度对谷子株高、茎粗、根系、硒含量和酶活性的影响。结果表明，2种形态硒随着浓度的升高，株高均呈先升高后降低的趋势；亚硒酸钠对茎粗的影响呈开口向下的抛物线趋势，纳米硒对茎粗有显著的抑制作用。亚硒酸钠对根长和根冠比的影响呈先增加后降低的趋势；低浓度纳米硒对根长影响不显著，高浓度纳米硒对根长有显著的抑制作用；纳米硒对谷子根冠比抑制作用明显。2种形态硒均可提高谷子的硒含量；2种形态硒及其不同浓度对超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性及蛋白质含量均有显著影响，对过氧化物酶活性影响不显著。结合Circos-弦图、谷子株高、茎粗、根系、硒含量和酶活性等试验结果，得出喷施0.1mmol/L的纳米硒溶液对谷子生长、硒含量及酶活性提高效果显著，适宜在谷子种植中应用。     

腐植酸对干旱胁迫下谷子幼苗叶片抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响

为探讨腐植酸（HA）对干旱胁迫下谷子抗氧化系统的调节机制,以晋谷21号和张杂10号为材料,采用浸种法研究了不同浓度腐植酸（0、50、100、200、300mg/L）对干旱胁迫下谷子幼苗叶片抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环的影响。结果显示,100和200mg/L腐植酸处理显著提高了干旱胁迫下谷子幼苗叶片抗坏血酸过氧化物酶（APX）和脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的活性,促进了抗氧化物质AsA和GSH的再生,使AsA/DHA和GSH/GSSH值增加,有效缓解了活性氧的积累。研究表明,腐植酸可通过提高AsA-GSH循环相关酶活性及抗氧化物质含量,缓解干旱胁迫对谷子幼苗造成的氧化损伤,从而提高谷子的抗旱性。     

谷子SiPRR37基因对光温、非生物胁迫的响应特点及其有利等位变异鉴定

从谷子品种延谷11号克隆生物钟基因SiPRR37,通过生物信息学分析、组织特异性表达分析、4种不同光温组合条件的昼夜表达模式分析以及对NaCl、ABA、PEG、低温、Fe 5种非生物胁迫的响应特点分析,揭示SiPRR37参与谷子光温互作调控以及应对非生物胁迫的作用机制;并对160份谷子材料重测序检测SiPRR37基因的突变位点进行单倍型分析,探究该基因对谷子主要农艺性状的影响。结果表明,SiPRR37基因蛋白质编码区(sequence coding for amino acids in protein,CDS)全长2247 bp,编码748个氨基酸,含有REC和CCT 2个结构域,基于PRR37蛋白的系统进化分析发现,谷子与糜子、高粱、玉米亲缘关系最近;启动子预测分析发现,SiPRR37启动子区存在光、温、生长素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯、干旱和盐胁迫等多种应答元件。SiPRR37相对表达量从高到低依次为根、穗颈、穗、顶叶、次顶叶、茎秆;4个光温组合条件SiPRR37均只在光照期出现1个表达峰,无论高温(27℃)还是低温(22℃),短日照相比长日照表达峰均要提前,无论长日照还是短日照,低温(22℃)相比高温(27℃)表达峰均要提前;NaCl、低温(15℃)胁迫能够抑制SiPRR37表达,PEG模拟干旱胁迫和Fe胁迫能够诱导SiPRR37基因表达,SiPRR37参与了ABA信号传导过程。位于SiPRR37 CDS区的10个SNP将160份谷子材料分为19个单倍型,其中3个单倍型(Hap_7、Hap_10、Hap_19)是改善穗部性状的有利单倍型。谷子SiPRR37基因表达具有昼夜节律性,同时受光周期和温度调控,并且参与了谷子对盐胁迫、低温胁迫、干旱胁迫和铁胁迫的应答反应,同时SiPRR37与抽穗期和多个穗部性状相关,在开展谷子高产分子辅助选育中具有一定应用潜力。     

谷子杂交种产量与主要农艺性状的相关性及回归分析

为了明确影响谷子杂交种产量的主要因子,对短穗型、中偏短穗型、中偏长穗型和长穗型4类不同谷子杂交种产量与主要农艺性状进行相关性和回归分析。结果表明,4种类型谷子杂交种的穗长与其产量差异显著。相关性分析表明,产量与出谷率之间存在显著正相关;单株穗重与单株粒重、经济系数之间存在极显著正相关,有效分蘖数与单株穗重、单株粒重和经济系数之间存在显著正相关,穗码密度与单株草重之间存在显著正相关,千粒重与穗长之间存在显著正相关。回归分析表明,谷子杂交种产量与穗粗、出谷率和千粒重呈显著正相关。     

干旱胁迫对不同基因型夏谷芽期的影响

用不同浓度的PEG-6000模拟干旱处理14个夏谷品种,统计相对发芽率、相对发芽指数、相对活力指数及相对芽长、根长。结果表明,除5%PEG处理外,PEG处理对14个品种夏谷的萌发均有抑制作用,但抑制程度不同。根据所有指标的隶属函数值将14个品种分为4个级别,200152和200131为强抗旱品种,安06-6082、郑06-3、沧344、济0404、济0515、06766-7和长生08为较抗旱品种,安04-4783、206058、沧555和冀谷19为弱抗旱品种,冀谷31为不抗旱品种。