重铬酸钾对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性效应

以二倍体和三倍体泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)鳍细胞系(DIMF和TRMF)为实验材料,研究了重铬酸钾对细胞的氧化损伤、微核形成以及金属硫蛋白表达情况的影响,旨在多角度探讨重铬酸钾对细胞系的毒性效应,建立适合监测其污染情况的指标。采用MTT法测定了细胞的半数抑制浓度;使用试剂盒测定了3种主要抗氧化酶活性;吉姆萨染色后观察了细胞微核的变化,并通过实时定量PCR方法测定了金属硫蛋白的表达情况。结果表明,24 h急性毒性实验两种细胞系的半抑制浓度分别为(25.3±1.2)μmol/L、(27.9±0.6)μmol/L,DIMF对重铬酸钾的敏感性要高于TRMF。当重铬酸钾浓度为0~30μmol/L时,二个细胞系的超氧化物歧化酶(SOD)活性随染毒浓度升高而升高。当重铬酸钾浓度为0~20μmol/L时,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性逐渐升高,浓度为30~40μmol/L时,其活力开始下降。两种细胞系的谷胱甘肽S转移酶(GST)活性随重铬酸钾浓度增大逐渐降低。二倍体细胞系氧化酶活性均低于三倍体。微核试验显示,重铬酸钾可引起细胞核损伤,形成微核。当重铬酸钾浓度为40μmol/L时,DIMF、TRMF微核率达到最大,分别为7.33‰和8.00‰,DIMF微核率要低于TRMF。实时定量PCR结果显示,对照组金属硫蛋白(MT)基因表达量很低,但经重铬酸钾胁迫后,MT基因表达量显著升高(P0.01)。     

锌胁迫对海洋小球藻生长和金属硫蛋白诱导的影响

研究锌离子胁迫对海洋小球藻生长和金属硫蛋白诱导的影响,当小球藻达到对数生长期,用不同离子浓度(5、10、20、50和100μmol/L)的锌盐(氯化锌、柠檬酸锌、乙酸锌和葡萄糖酸锌)分别进行胁迫培养,通过测定小球藻的生物量和锌结合金属硫蛋白含量,考察锌胁迫对海洋小球藻的生物量、热稳定蛋白含量以及锌结合金属硫蛋白含量的影响。结果显示,当浓度分别小于5和10μmol/L时,柠檬酸锌和氯化锌对小球藻生长无显著抑制作用;而浓度为5μmol/L时,乙酸锌和葡萄糖酸锌对小球藻生长即产生显著抑制,且抑制作用皆随锌离子浓度的增加而增大。与对照组相比,4种锌盐胁迫3 d后小球藻产生的热稳定蛋白含量极显著增加,其中以锌离子浓度为50μmol/L的葡萄糖酸锌对小球藻胁迫产生的热稳定蛋白含量最高,达到34.5 mg/g(湿藻泥)。同样在此浓度的葡萄糖酸锌胁迫下,小球藻诱导产生的锌结合金属硫蛋白的含量最高。研究表明,用锌离子浓度为50μmol/L的葡萄糖酸锌对小球藻胁迫培养,诱导产生的锌结合金属硫蛋白含量达到最高。     

中草药提取物黄连素对草鱼肝细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

本研究运用细胞生物学研究方法,探讨中草药提取物黄连素对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝细胞(L8824)活力、氧化应激和细胞凋亡的影响。用不同浓度黄连素(0μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)分别处理体外培养的草鱼肝细胞Oh、6 h、12 h和24 h,采用CCK-8法检测细胞活力。结果显示,黄连素浓度和时间对细胞活力有显著交互作用(P0.05),且黄连素浓度对其活力影响差异显著(P0.05),草鱼肝细胞活力随着黄连素的浓度增加先升高后降低(P0.05)。在此基础上,设置了黄连素梯度浓度(0μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)培养草鱼肝细胞12 h后,收集细胞,测定细胞谷丙转氨酶(GPT)及谷草转氨酶(GOT)活性,丙二醛(MDA)及活性氧(ROS)含量、细胞凋亡水平和相关基因mRNA表达量。结果表明,与不添加黄连素组相比,当黄连素浓度为100μmol/L时,细胞GOT和GPT活性、ROS和MDA含量显著(P0.05)增加。当黄连素的浓度为25μmol/L和50μmol/L时,细胞凋亡水平显著(P0.05)升高;当黄连素的浓度增加到100μmol/L时,细胞凋亡水平显著(P0.05)降低。当黄连素的浓度为50μmol/L和100μmol/L时,细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达量显著(P0.05)升高。综上所述,当黄连素浓度超过50μmol/L会抑制细胞的生长,引发氧化应激,影响细胞功能。因此,黄连素在草鱼肝细胞培养液中添加的适宜浓度为25～50μmol/L。     

三种抗氧化剂对氯化镉所致河蟹精子DNA损伤的保护作用

采用单细胞凝胶电泳技术与CASP软件检测和分析了3种抗氧化剂(VC,VE和Zn2SO4)对氯化镉所致河蟹离体精子DNA损伤保护作用的量效关系。以5mmol.L-1氯化镉处理河蟹精子DNA,表征DNA损伤程度的4个参数(L tail,TailDNA,TM,OTM)值与空白组相比显著增加,表明该氯化镉浓度下已对河蟹精子的DNA造成严重损伤。在此基础上,将河蟹精子加入到分别含有不同浓度抗氧化剂的氯化镉(5mmol.L-1)溶液中,研究不同浓度抗氧化剂对精子DNA的保护作用。其中VC的浓度分别为:400μmol.L-1,1mmol.L-1,3mmol.L-1,5mmol.L-1;VE的浓度分别为:50μmol.L-1,100μmol.L-1,200μmol.L-1,400μmol.L-1;Zn2 的浓度分别为:400μg.mL-1,1mg.mL-1,2mg.mL-1,4mg.mL-1。结果发现,上述3种抗氧化保护剂均对精子DNA具有一定的保护效果,其中VE和Zn2 添加组均随其浓度的增加,保护作用不断增强,当VE达到400μmol.L-1,Zn2 达到4mg.mL-1时,均表现出很好的保护效果;然而,VC在低浓度时保护作用随其浓度增加而加强,至3mmol.L-1时细胞拖尾率最低,即保护效果最佳,但在5mmol.L-1时细胞拖尾率又明显增加,即精子DNA又受到严重损伤,表明VC对精子DNA的保护作用具有一定的浓度范围。此外,与VC和Zn2 的保护作用相比,VE在400μmol.L-1浓度时表现出更好的保护效果。     

硫辛酸对草鱼脂肪细胞脂质含量及脂代谢相关基因表达的影响

为了探究硫辛酸对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)脂肪细胞脂质代谢的影响,分离草鱼腹腔脂肪组织,消化得到脂肪细胞进行体外培养,分别用0、50和200μmol/L硫辛酸孵育细胞6 h,收取细胞和培养基样品后检测细胞甘油三酯(TG)含量、甘油和非酯化脂肪酸(NEFA)释放量及脂代谢相关基因表达。结果显示:50和200μmol/L硫辛酸处理显著降低草鱼脂肪细胞TG含量,200μmol/L硫辛酸显著增加细胞甘油和NEFA的释放量。200μmol/L硫辛酸组脂肪细胞脂肪分解相关基因(HSL、PPARα、CPT1、CD36)mRNA表达显著高于对照组,且ACC和PPARγ的mRNA表达水平显著上升,ATGL、MGL、SREBP-1c、FAS、DGAT等脂代谢基因表达状况无显著变化。综上所述,硫辛酸可能通过诱导草鱼脂肪细胞HSL和CPT1的基因表达促进脂质水解和β-氧化,从而降低脂肪细胞脂质含量。     

联苯菊酯对菲律宾蛤仔肝胰腺细胞DNA损伤的初探

为了评价联苯菊酯的遗传毒性,研究了不同浓度联苯菊酯对菲律宾蛤仔肝胰腺细胞DNA的损伤作用。研究分别在0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L联苯菊酯暴露25 d后,取菲律宾蛤仔肝胰腺细胞并用单细胞凝胶电泳(彗星实验)进行分析,以彗尾DNA相对含量(TDNA%)、彗星尾长(TL)、Olive尾矩(OTM)和拖尾率(TR)作为DNA损伤的指标,实验结果表明:与空白对照组相比,各处理组菲律宾蛤仔肝胰腺细胞DNA均有不同程度的损伤且各检测指标值均显著增加(P0.05);随着联苯菊酯浓度的增加,各检测指标均呈规律性的增长趋势,具有高度的相关性(r0.99),表现出良好的剂量效应关系。评价彗星实验较好的检测指标为彗尾DNA相对含量和Olive矩,实验获得的多元回归方程具有显著的统计学意义(P0.01),可以有效地推断联苯菊酯对菲律宾蛤仔的染毒毒性浓度。     

溴氰菊酯对中华绒螯蟹血细胞DNA的损伤

为研究溴氰菊酯对中华绒螯蟹的遗传毒性作用,将中华绒螯蟹分为5组进行半静水毒性试验,分别为0μg/L的空白对照组,只添加丙酮的溶剂对照组,以及0.10、0.20、0.40μg/L的溴氰菊酯质量浓度试验组。通过彗星检测的方法,分别测定溴氰菊酯暴露1、2、4、8、12d后中华绒螯蟹血细胞拖尾率及Olive尾距(OTM值)。结果显示,溶剂组在各时间点拖尾率及Olive尾距均同对照组无显著差异(P0.05),表明溶剂丙酮并非造成中华绒螯蟹血细胞DNA损伤的原因。溴氰菊酯对中华绒螯蟹血细胞有较强的DNA损伤作用,1d后0.20μg/L和0.40μg/L组拖尾率和Olive尾距均显著高于对照组(P0.05),此后3个质量浓度组在各时间点均极显著高于对照组(P0.01),至12d后仍未恢复。拖尾率和Olive尾距随着暴露时间增加而上升,呈现明显的时间效应和剂量效应,表明其可以作为评估溴氰菊酯对中华绒螯蟹遗传毒性的敏感指标。     

维生素C对异育银鲫原代肝脏细胞活性及抗敌百虫氧化胁迫的影响

南京农业大学动物科技学院,江苏省水产动物营养重点实验室,江苏南京210095用含不同浓度维生素C(0,50,100,200,400和800 μmol/L)的培养液培养异育银鲫原代肝脏细胞,待细胞融合后,测定细胞活性、细胞内维生素C含量,乳酸脱氢酶(LDH)活性.再将用维生素C培养的肝脏细胞经敌百虫胁迫24 h,测定细胞内总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和丁酰胆碱酯酶(B-ChE)活性以及细胞内细胞色素P450( CYP450)含量.结果表明,与未添加维生素C组相比,在100 μmol/L的维生素C剂量组,肝脏细胞活性显著高于较其它剂量组(P＜0.05);细胞内维生素C的含量随着培养液中维生素C的增加而增加,且差异显著(P＜0.05);在800 μmol/L维生素C剂量组,细胞LDH活性显著增加(P＜0.05),但是其它剂量组均无显著变化.肝脏细胞经敌百虫胁迫后,在50、100和200μmol/L维生素C剂量组,细胞T-AOC能力,GST活性,B-ChE活性和CYP450含量显著升高(P＜0.05),细胞解毒和抗氧化能力增强;但是当维生素C的剂量为400和800 μmol/L时,细胞T-AOC能力和GST活性降低.综上所述,在体外细胞培养液中添加在50 ～ 200μmol/L剂量范围的维生素C可以促进原代肝脏细胞生长,增强细胞解毒能力,提高细胞的抗氧化水平.     

悬沙胁迫下日本囊对虾仔虾的生长和DNA损伤

以日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)仔虾为受试生物,研究不同悬沙浓度(0、l0、50、100、500和1 000 mg/L)下仔虾的存活率、增重率、RNA/DNA比率变化和DNA损伤情况,探讨悬沙对仔虾的影响.结果表明,低浓度悬沙(＜500 mg/L)对仔虾的存活率、增重率、RNA/DNA比率和DNA损伤指标无显著影响.高浓度悬沙(≥500 mg/L)为仔虾生长蜕皮提供隐蔽场所,减少自残,但在提高存活率的同时,影响仔虾摄食,表现为仔虾的增重率和RNA/DNA比率与对照组相比显著下降(P＜0.05),且增重率和RNA/DNA比率之间具有显著的正相关性(P＜0.05).在高浓度悬沙组(≥500 mg/L)中,作为DNA损伤指标,彗星细胞拖尾率、尾长和尾矩与对照组相比均显著增加(P＜0.05),但不同的指标灵敏度不同,尾长和尾矩灵敏度较拖尾率更高.结论认为,RNA/DNA比率和DNA损伤指标能够有效评估悬沙对仔虾生长的影响.     

4种常用鱼药对泥鳅的急性毒性试验

用福尔马林等4种药物对泥鳅进行急性毒性试验,结果表明:福尔马林24 h半致死浓度为138.50mg/L,48 h半致死浓度为122.30 mg/L,安全浓度为25.30 mg/L;高锰酸钾24 h半致死浓度为7.23 mg/L,48h半致死浓度为5.61 mg/L,安全浓度为0.75 mg/L;硫酸铜24 h半致死浓度为3.90 mg/L,48 h半致死浓度为2.70 mg/L,安全浓度为0.26 mg/L;敌百虫24 h半致死浓度为11.80 mg/L,48 h半致死浓度为10.50mg/L,安全浓度为2.22 mg/L。根据试验结果,建议高锰酸钾不要作为泥鳅的治疗药物,硫酸铜在用于泥鳅疾病的防治时要谨慎使用,福尔马林和敌百虫是治疗泥鳅疾病的有效药物。     

单细胞凝胶电泳检测百草枯对大鳞副泥鳅血细胞DNA的损伤

以大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）为受试对象,设置0.302、0.362、0.434、0.521、0.625 mL/L共5个浓度组和1个对照组,通过单细胞凝胶电泳技术（SCGE）,研究除草剂百草枯对大鳞副泥鳅血细胞DNA 6、24、48、96 h所造成的损伤。结果表明,6、24、48、96 h时处理组与对照组相比,在尾部DNA百分比（Tail DNA）、慧星尾长（Tail length,TL）和Olive尾矩（Olive tail moment,OTM）3项指标上均具有显著差异（P〈0.05）,而且在6、24、48 h时,时间一定时,各项指标随除草剂浓度升高而变大;浓度一定时,各项指标随时间推移而变大,而96 h时与48 h时相比,各项指标则有所下降。TL和OTM 2项指标在24 h时0.625 mL/L组达到最大,分别为（553.22±106.92）%和（200.73±50.72）%,Tail DNA在48 h时0.625 mL/L组达到最大,为（75.14±10.99）%。研究结果对于百草枯的合理使用和环境污染监测提供了科学依据,也为其对水生生物的毒性研究提供了资料。     

Induction of DNA damage in the peripheral blood of zebrafish (Danio rerio) by an agricultural organophosphate pesticide,monocrotophos

The use of organophosphate pesticides (OPs) in agricultural practices in India has gained popularity due to their broad spectrum, low cost and high potency. Monocrotophos (an OP) which is a systemic and contact broad-spectrum cholinesterase inhibitor is being widely used in India. However, its use entails the damage to other non-target organisms such as fish. In the present study, zebrafish (Danio rerio) were exposed to various doses of monocrotophos (0.125, 0.625 and 1.25 μL/L) and genotoxicity studies were carried out employing the comet assay and micronucleus test in the peripheral blood of these fish after 24, 48 and 72 h of exposure. Significant DNA damage in the form of % tail DNA and micronuclei was observed in all the treated fish compared to the control. Both % tail DNA and micronuclei frequency were found to increase significantly as the concentration increased. DNA damage was also observed at all the time intervals for all treatments except in the 0.125 μL/L-treated group. A positive correlation was also observed between the comet assay and micronucleus test. The study thus suggests the use of zebrafish as an experimental model to study the genotoxic effects of agricultural pesticides using the comet assay and micronucleus test.

     

氰戊菊酯对菲律宾蛤仔染毒后消化腺细胞的彗星实验分析

为检测氰戊菊酯对菲律宾蛤仔染毒培育25 d后消化腺细胞DNA的损伤情况,将菲律宾蛤仔分为6组进行不同剂量染毒,采用彗星实验技术进行DNA损伤分析,并通过Comet Score 1.5分析软件对拖尾率、尾长、彗尾DNA相对含量、尾矩、Olive矩等DNA损伤指标进行统计。在对各指标分别建立一元回归方程的基础上,又通过SPSS软件进行判定分析,筛选影响作用更大的检测指标,建立了多参数的多元回归方程。结果显示,与空白对照组相比,菲律宾蛤仔各染毒组消化腺细胞DNA均有不同程度的损伤且各检测指标均有显著性差异,对照组受损细胞极少,拖尾率仅为8.06%±1.94%,彗尾DNA相对含量、尾矩和Olive矩都接近0,0.067 5~1.080 0 mg/L染毒实验组各指标值显著增加。研究表明,各检测指标与染毒浓度表现出良好的剂量效应关系,随着染毒浓度递增,各检测指标都呈规律性地增长趋势,具有高度的相关性,多项式回归方程和多元回归方程均有显著性的统计学意义,通过多元回归方程可以有效地推断氰戊菊酯染毒浓度和染毒时间。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料,研究了Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶,以及退火温度对RAPD反应的影响,建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系。反应总体积为20μL,Mg2+浓度为2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶浓度为1U,引物浓度为2μmol/L,dNTPs浓度为400μmol/L,模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序:94℃预变性2min→40循环(94℃变性1min→36℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃延伸5min。     

4种药物对彩鲫鱼苗的致死毒性试验

在常温静水条件下,采用甲醛、硫酸铜、食盐和高锰酸钾4种常用水产药物对彩鲫鱼苗进行急性毒性试验。试验鱼规格3.0～4.5cm/尾,平均体重2.5g/尾。结果表明：彩鲫鱼苗对试验药物的敏感性大小依次为：硫酸铜〉高锰酸钾〉甲醛〉食盐。硫酸铜、高锰酸钾、甲醛和食盐的安全浓度分别为0.64、1.80、21.00和4500.00mg/L。     

饲料中绿原酸对泥鳅生长性能、消化酶活性、免疫功能及抗氧化能力的影响

（目的）本试验以泥鳅为研究对象,探究饲料中添加不同浓度绿原酸（Chlorogenic acid）对泥鳅生长性能、消化酶活性、免疫功能及抗氧化能力的影响。（方法）试验选用无病无伤初始体重为（3.50±0.01 g/尾）的泥鳅,随机分为5组,在基础饲料投喂中分别添加0、200、400、600和800 mg/kg的绿原酸试验饲料,每组3个重复,饲养56 d 。饲养试验结束后,测定泥鳅生长性能、消化酶活性、生化指标、免疫功能及抗氧化能力。（结果）试验表明,与对照组相比较饲料中加入绿原酸可以显著增高泥鳅的终末体质量（FBW）、增重率（WGR）和特定生长率（SGR） （P <0.05）;且显著提高肝脏和肠道中蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性（P <0.05）以及肝脏与肠道中总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性,丙二醛（MDA）的生成被降低。肝脏中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活性随绿原酸浓度增加而提高,分别在400 mg/kg和600 mg/kg时达到最大值。随着绿原酸浓度的升高,血清中AST、ALT活性均显著下降（P <0.05）。随着绿原酸浓度的增加,血清中乳酸脱氢酶（LDH）逐渐下降,在浓度400 mg/kg时达到最低值;血清补体3（C3）和补体4（C4）含量先升高后下降,分别在绿原酸浓度为400 mg/kg和600 mg/kg时达到峰值含量;血清中免疫球蛋白M（IgM）水平显著升高（P <0.05）,在浓度为600 mg/kg时达到最大;血清中溶菌酶（LYS）含量先上升后下降,在浓度为400 mg/kg时含量为最大值。（结论）结果表明,在饲料当中添加400～600 mg/kg绿原酸可显著提高泥鳅生长性能和消化酶活性（P <0.05）,增强泥鳅的免疫功能和抗氧化能力。     

四种药物对哲罗鱼的急性毒性试验

以哲罗鱼为试验对象,研究甲醛、拜净、硫酸铜和氯化钠对其急性毒性试验,求出半数致死浓度和安全浓度。研究结果表明哲罗鱼对于4种药物的敏感性为:硫酸铜>拜净>甲醛>氯化钠,安全浓度为硫酸铜0.21mg/L、拜净0.47mg/L、甲醛19.30mg/L、氯化钠2182.88mg/L,甲醛、氯化钠是哲罗鱼较好的日常病害防治药物。     

Cloning and expression of metallothionein cDNA in the hard clam (Meretrix lusoria) upon cadmium exposure

The objective of this study was to determine whether metallothionein (MT) expression was related to Cd accumulation in hard clams (Meretrix lusoria). We cloned clam MT. Then a specific primer for the hard clam was designed for MT mRNA measurements using real-time PCR. The hard clams were exposed to 50, 200, and 1000 μg/L cadmium (Cd) for 1, 3, 5, and 7 days, to determine the relationship between MT mRNA relative quantity (RQ) levels and Cd accumulation. The following results were obtained: (1) the cloned MT, consisting of 228 bp encoding a protein of 76 amino acids showed higher than 55% identity with the deduced amino acid sequence previously published for another bivalve. (2) Both MT mRNA expression and Cd accumulation appeared to be dose-responsive following cadmium treatment for 1, 3 and 5 days, respectively; however, no time-dependent responses were found. According to these results, MT mRNA expression levels can be used as an indicator to monitor the concentrations of Cd in aquaculture farms.