长期干旱胁迫下Mdm-miR160- MdARF17- MdHYL1模块调控苹果生长发育的研究

为了研究长期干旱条件下Mdm-miR160-MdARF17-MdHYL1 调控网络在苹果生长发育中的作用，以GL-3和Mdm-miR160e OE、MdARF17 RNAi、MdmARF17 OE、 MdHYL1 OE及MdHYL 1 RNAi转基因苹果为试验材料，进行为期3个月的长期干旱处理，测定苹果株高、根干质量、根冠比以及叶片净光合速率、胞间CO₂浓度、气孔导度、蒸腾速率、叶绿素荧光值和水分利用效率。结果表明，在长期干旱胁迫下， Mdm-miR160e OE转基因苹果植株更矮化，根冠比、根干质量、光合能力及水分利用效率大于GL-3植株，具有更强的耐旱性； MdARF17 RNAi植株比GL-3更矮，且具有更大的根冠比、根干质量、光合能力和水分利用效率，而MdARF17 OE与之相反； MdHYL1 RNAi植株对长期干旱胁迫更敏感，其株高大于野生型且具有更小的根冠比、更低的光合能力和水分利用效率，而 MdHYL1 OE植物对长期干旱条件具有更强的适应性，生长发育表型与RNAi植株相反。综上所述，Mdm-miR160- MdARF17-MdHYL1调控网络在苹果响应长期干旱过程中发挥了重要功能，为苹果抗旱分子育种提供了候选基因。     

苹果MdcyMDH过量表达对光合、激素和生长的影响

【目的】获得过量表达苹果细胞质苹果酸脱氢酶基因（MdcyMDH）的苹果植株,评价其过量表达对转基因株系生长的影响,并通过光合特性和和激素水平来探讨其调控生长的机理,为进一步揭示该基因调控生长发育的机制奠定基础。【方法】从苹果叶片中克隆MdcyMDH编码区,连接植物表达载体pBI121,转化农杆菌LBA4404;利用农杆菌侵染‘嘎啦’苹果叶片,通过叶片再生的方法获得MdcyMDH过表达的转基因苹果株系。以分化的苹果组培苗叶片为材料,提取基因组DNA,利用来自35S启动子和转化基因序列的引物,通过PCR初步筛选转基因株系;然后,提取初筛的转基因苹果组培苗叶片RNA,分别采用半定量和荧光定量PCR的方法检测MdcyMDH表达量,来确定MdcyMDH过表达株系。以继代培养40和60 d的野生型和转基因苹果组培苗为材料,进行生根处理,30 d后测定MdcyMDH过表达对组培苗表型以及株高、叶片数量、根重等生长参数的影响。以驯化的、在大田生长一年的野生型和转基因苹果苗为材料,测定叶片光合参数和叶绿素含量的变化;以组培苗为材料,利用液质联用仪测定叶片内源激素含量的变化。【结果】以苹果叶片基因组DNA为材料,PCR初步筛选获得了3个转基因株系,即Line 2、Line 3和Line 4;半定量和荧光定量PCR检测发现Line 2和Line 4中MdcyMDH表达量分别比野生型提高了12倍和5倍,因此确定以上两个株系为MdcyMDH过表达株系。此外,MdcyMDH过量表达也提高了叶绿体苹果酸脱氢酶基因（MdchMDH）表达量。组培苗生根培养30 d后,MdcyMDH过表达对转基因株系的株高、叶数目、茎粗度、地上部重量未造成显著性影响,但小幅提高了转基因株系的株高和地上部总重量;与野生型相比,MdcyMDH过量表达显著提高了根系的重量和总鲜重。MdcyMDH过表达显著提高了转基因株系的光合速率,Line 2和4光合速率分别提高了13.2%和15.1%;转基因株系的蒸腾速率和气孔导度总体上都有显著性提高,但其胞间CO₂浓度显著降低;MdcyMDH过量表达显著提高了叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量,与对照相比,Line 2和4株系叶绿素总含量分别提高了20.4%和15.9%。叶片激素含量测定表明,MdcyMDH过量表达显著抑制了ABA水平,其含量约为对照的1/2。【结论】MdcyMDH过量表达通过提高光合能力和降低ABA水平促进了转基因苹果组培苗的生长,尤其是促进了生根。     

小麦转录因子TaWRKY28基因克隆与抗旱性分析

【目的】克隆小麦TaWRKY28基因,通过农杆菌浸染法将其转化至拟南芥,研究转基因拟南芥植株生理生化指标变化,探究其在抵御非生物胁迫中的作用。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦百农207 cDNA中克隆得到TaWRKY28基因,利用ProtParam等软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法,分析TaWRKY28基因的组织表达特异性及在NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温逆境胁迫下的表达情况;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,选取TaWRKY28基因相对表达量较高的转基因T₃拟南芥株系,测定拟南芥超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性以及丙二醛（MDA）、H₂O₂和脯氨酸含量,研究TaWRKY28对拟南芥抗旱性的影响。【结果】成功克隆获得小麦TaWRKY28基因,该基因ORF全长为978 bp,编码325个氨基酸,相对分子质量为34.87 ku,理论等电点为9.27,含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员。序列系统进化分析结果显示,小麦TaWRKY28与大麦HvWRKY2亲缘关系最近。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。qRT-PCR结果表明,TaWRKY28在小麦根、茎、叶、雌蕊和雄蕊组织中均有表达,但具有组织特异表达性,在叶中表达量最高,雄蕊中次之,雌蕊中表达量最低,且受NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温胁迫后TaWRKY28表达会增强。对TaWRKY28转基因拟南芥植株的抗旱性分析表明,在干旱条件下,转基因植株的表型优于野生型,SOD、POD活性和脯氨酸含量显著增加,而H₂O₂和MDA含量显著降低,转基因植株抗旱性显著提高。【结论】克隆了小麦TaWRKY28基因,该基因可以增强转基因拟南芥植株的抗旱能力。     

四季秋海棠BsMYB62的抗旱性功能研究

【目的】以前期从四季秋海棠叶片中克隆得到的R2R3型MYB转录因子BsMYB62为研究对象,分析其在干旱胁迫下的功能。【方法】对四季秋海棠MYB62蛋白进行亚细胞定位,并通过实时荧光定量PCR方法明确BsMYB62基因在四季秋海棠根、茎、叶、雄花和雌花5个组织部位中的表达情况;构建BsMYB62基因的过表达载体转化到拟南芥,观察过表达转基因株系与野生型植株在萌发期和幼苗期遭受干旱胁迫时的生长表型、种子萌发和根长情况,测定各株系在幼苗期干旱胁迫处理时的叶绿素荧光参数PSⅡ最大光化学效率（F_v/F_m）,叶绿素、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量,抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性以及转基因株系中BsMYB62基因的相对表达量变化。【结果】BsMYB62定位于四季秋海棠的细胞核,其在根、茎、叶和雌雄花中均有表达,其中以根和茎中的表达水平较高。在MS培养基中,野生型拟南芥和3个BsMYB62过表达转基因株系（OE1、OE2和OE3）的发芽率和长势均无显著差异,而在200 mmol/L甘露醇（模拟干旱胁迫）培养基中,OE1、OE2和OE3在胁迫处理后前2 d的发芽率及主根长均显著高于野生型拟南芥,幼苗长势也明显优于野生型。置于培养土中干旱胁迫1 d时,OE1、OE2和OE3的BsMYB62即被显著诱导;干旱胁迫13 d时,OE1、OE2和OE3的F_v/F_m、叶绿素含量、Pro含量以及SOD、POD和CAT活性均显著高于野生型拟南芥,而MDA含量则显著低于野生型拟南芥。【结论】BsMYB62基因通过提高转基因拟南芥的光合潜能和抗氧化能力,显著增强其对干旱胁迫的抗性。     

3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因的克隆与分析

【目的】克隆3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因,分析其在不同条件下的表达特性;构建植物表达载体并转化烟草,对转基因烟草的耐盐性进行初步鉴定。【方法】根据已获得的cDNA序列设计引物,扩增MsERF5、MsERF8和MsERF11的DNA序列,并分析基因结构;利用半定量RT-PCR技术分析其组织表达特异性和胁迫条件下的表达特性;通过农杆菌介导的方法转化烟草,鉴定盐胁迫条件下转基因烟草的表型和生理生化特性,初步验证其功能。【结果】MsERF5、MsERF8和MsERF11都不包含内含子。MsERF5在根、叶和花蕾中的表达量高于茎和花;MsERF8在根和叶中的表达量高于茎、花蕾和花;MsERF11在叶中的表达量最高;3个基因都能被多种非生物胁迫（盐、干旱、铝）和激素（脱落酸、赤霉素、乙烯利、水杨酸和茉莉酸甲酯）诱导,但表达模式不同。在盐浓度为200 mmol•L-1的筛选培养基上只有导入目的基因的愈伤组织能产生不定芽,250 mmol•L-1 NaCl处理再生植株10 d,转基因植株和野生型植株叶片的电导率和可溶性糖含量均呈现上升趋势,但野生型植株叶片的电导率显著高于转基因植株,可溶性糖含量则显著低于转基因植株（P＜0.05）;转基因植株和野生型植株叶片的叶绿素含量均呈现下降趋势,野生型植株叶片叶绿素含量显著低于转基因植株（P＜0.05）;盐胁迫条件下,转化不同基因的再生植株的电导率、叶绿素和可溶性糖含量没有显著差异（P＞0.05）。【结论】3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因都不包含内含子,其表达具有组织特异性,都能被多种非生物胁迫和激素诱导,能够使烟草愈伤组织在含盐培养基上形成不定芽并最终产生转基因植株,且转基因植株的耐盐性高于野生型植株。     

苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1的克隆及功能鉴定

【目的】异三聚体G蛋白(Heterotrimeric G protein)作为植物生物体内重要的信号转导分子,在感受外界环境刺激、参与植物抗逆反应和跨膜信号转导等方面发挥着重要作用。克隆异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1,并在烟草中过量表达MdGPA1,对其进行生物学功能鉴定和生理指标分析,为多年生木本植物响应环境因子信号转导过程中的分子机理研究提供参考。【方法】本研究以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为研究试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆获得MdGPA1。使用MEGA5.0构建GPA1物种间系统进化树;利用qRT-PCR方法检测该基因在苹果受非生物胁迫诱导表达及组织特异性表达情况。构建MdGPA1植物过表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶片,比较干旱胁迫条件下野生型和转基因株系的表型与生理指标,验证MdGPA1在植物干旱胁迫条件下的生物学功能。【结果】克隆得到苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1(基因序列号:MDP0000881842),该基因长为1 173 bp,编码390个氨基酸。进化树分析表明MdGPA1与白梨Pb GPA1亲缘关系最近,同源性最高。基因表达分析显示MdGPA1主要在叶片中表达,在根系中的表达量次之,在茎和果实中的表达量较低。定量分析表明,该基因参与干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫响应,在150 mmol·L~(-1)Na Cl、150 mmol·L~(-1)甘露醇、10%PEG和4℃胁迫条件下表达量明显下调,在5%H_2O_2胁迫处理下表达量明显上调。在烟草中过量表达MdGPA1,发现MdGPA1转基因烟草表现出对干旱敏感的表型特征,其叶片鲜重、叶绿素含量以及脯氨酸含量明显低于野生型烟草。在地下部,MdGPA1转基因烟草同样表现出对干旱敏感的表型特征;其根系形态相比于野生型较小,干重也明显低于野生型。【结论】MdGPA1参与了植物感受外界环境刺激的过程,对干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫都存在着不同程度的响应。在烟草中异源表达MdGPA1后,提高了烟草对干旱的敏感性,转基因烟草表现出不耐干旱的表型,受干旱胁迫比野生型烟草更为严重,说明MdGPA1在响应植物抗旱胁迫中起着负调控作用。     

水稻顺式还原酮加双氧酶基因的表达分析及功能研究

【目的】农作物对逆境胁迫的耐受能力与产量息息相关,是作物育种要考虑的重要因素。文中对水稻顺式还原酮加双氧酶基因OsARD1进行研究,分析其表达模式,明确其在水稻应对非生物胁迫中的功能,为水稻耐旱品种的分子设计及育种提供参考依据。【方法】提取不同组织器官的总RNA,利用RT-PCR方法分析OsARD1表达的组织特异性。利用不同的非生物胁迫处理14 d大小的野生型（中花11）植株,在不同时间点提取总RNA,利用RT-PCR方法分析OsARD1表达的受诱导情况。通过农杆菌遗传转化法转化水稻愈伤组织,经过一系列分子检测后获得稳定遗传的T1代OsARD1的过量表达转基因植株,以转入空载体的野生型植株作为对照。将在营养液中正常培养的12 d大小的野生型和过表达幼苗移出营养液进行缺水处理并进行恢复试验。将催芽后的野生型和过表达转基因植株种子种在含有5% PEG6000的agar培养基中进行渗透胁迫处理,以不含PEG6000的agar培养基作为对照,观察二者的表型。【结果】组织特异性表达分析表明OsARD1主要在根及成熟的组织中表达,尤其在衰老的组织中有较高表达。非生物胁迫处理表明OsARD1的表达明显受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。获得6个独立株系的可稳定遗传的OsARD1过量表达转基因植株。对过量表达转基因植株及空载体野生型对照进行干旱胁迫处理,缺水处理5 h后,野生型植株叶片卷曲皱缩成针状表现出严重的缺水症状,但此时过表达转基因植株叶片仍处于舒展状态;缺水处理8 h后开始复水培养3 d,野生型植株的存活率仅为10%,而过表达植株存活率为80%,远远高于野生型,说明过量表达OsARD1提高了水稻对缺水的耐受能力。用PEG渗透胁迫模拟干旱胁迫处理6 d后发现,不含PEG6000对照组中野生型和过表达植株的幼苗生长情况没有明显的差别;在PEG处理组中,野生型幼苗根的生长受到严重抑制,而过表达植株幼苗根的生长受到抑制较小,根长明显长于野生型对照植株,说明过量表达OsARD1增强了水稻耐受干旱胁迫的能力。【结论】OsARD1主要在水稻根及成熟的组织中表达,并且受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。过量表达OsARD1提高了水稻抗旱性能。     

转录因子ABP9基因过表达对植物生长发育的影响分析

【研究目的】为分析玉米ABA/逆境响应转录因子ABP9基因过量表达对植物生长发育的影响以利用该基因开展抗逆分子育种。【方法】本研究构建了35S启动子驱动ABP9组成型表达的植物表达载体,获得了过表达ABP9基因的拟南芥转基因株系,并在正常生长条件下,比较了转基因植株和野生型在种子萌发、营养生长和生殖生长阶段的形态和生理变化,分析了可能的分子机制。【结果】结果表明,正常生长条件下,转基因植株与野生型相比表现出萌发,幼苗生长以及开花阶段的生长抑制;气孔开度减小,叶片内源ABA含量降低;ABA信号传导基因表达增强,而ABA合成基因表达降低;而且这些效应在ABP9基因表达相对较强的转基因株系中表现更明显。【结论】说明ABP9基因过量在正常生长条件下即诱导转基因植株产生耐逆反应,抑制植株的生长发育。因此,在利用ABP9基因进行转基因抗逆育种时须考虑控制ABP9基因适时适量表达。     

橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,命名为TKFPS（GenBank登录号 KJ558350.1）。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 kD,理论等电点（pI）为5.41,平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,TKFPS 蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低。重组子pCAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。     

水稻顺式还原酮加双氧酶基因的表达及功能分析

【目的】农作物对逆境胁迫的耐受能力与产量息息相关,是作物育种要考虑的重要因素。文中对水稻顺式还原酮加双氧酶基因Os ARD1进行研究,分析其表达模式,明确其在水稻应对非生物胁迫中的功能,为水稻耐旱品种的分子设计及育种提供参考依据。【方法】提取不同组织器官的总RNA,利用RT-PCR方法分析Os ARD1表达的组织特异性。利用不同的非生物胁迫处理14 d大小的野生型(中花11)植株,在不同时间点提取总RNA,利用RT-PCR方法分析Os ARD1表达的受诱导情况。通过农杆菌遗传转化法转化水稻愈伤组织,经过一系列分子检测后获得稳定遗传的T1代Os ARD1的过量表达转基因植株,以转入空载体的野生型植株作为对照。将在营养液中正常培养的12 d大小的野生型和过表达幼苗移出营养液进行缺水处理并进行恢复试验。将催芽后的野生型和过表达转基因植株种子种在含有5%PEG6000的agar培养基中进行渗透胁迫处理,以不含PEG6000的agar培养基作为对照,观察二者的表型。【结果】组织特异性表达分析表明Os ARD1主要在根及成熟的组织中表达,尤其在衰老的组织中有较高表达。非生物胁迫处理表明Os ARD1的表达明显受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。获得6个独立株系的可稳定遗传的Os ARD1过量表达转基因植株。对过量表达转基因植株及空载体野生型对照进行干旱胁迫处理,缺水处理5 h后,野生型植株叶片卷曲皱缩成针状表现出严重的缺水症状,但此时过表达转基因植株叶片仍处于舒展状态;缺水处理8 h后开始复水培养3 d,野生型植株的存活率仅为10%,而过表达植株存活率为80%,远远高于野生型,说明过量表达Os ARD1提高了水稻对缺水的耐受能力。用PEG渗透胁迫模拟干旱胁迫处理6 d后发现,不含PEG6000对照组中野生型和过表达植株的幼苗生长情况没有明显的差别;在PEG处理组中,野生型幼苗根的生长受到严重抑制,而过表达植株幼苗根的生长受到抑制较小,根长明显长于野生型对照植株,说明过量表达Os ARD1增强了水稻耐受干旱胁迫的能力。【结论】Os ARD1主要在水稻根及成熟的组织中表达,并且受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。过量表达Os ARD1提高了水稻抗旱性能。