果树自交不亲和花粉S基因研究进展

果树自交不亲和属于配子体自交不亲和,配子体自交不亲和至少由S位点的花柱S基因和花粉S基因2个基因决定,花柱S基因已被确定为S-RNase基因,而花粉S基因研究在近年才取得进展,一个在花粉中特异表达的基因SFB(Shaplotype-specificF-boxprotein)被发现,并且多方面的证据表明该基因是花粉S基因的最佳代表。就花粉S基因的筛选、该基因的结构特点、可能的作用机理等方面的研究进展予以综述。     

新疆杏品种SFB基因的克隆及实时定量表达

以新疆杏27个品种花粉为材料,进行转录水平SFB基因的克隆与测序;选取冬杏、苏陆克、库尔勒托拥3个杏品种,对其进行花粉离体培养,分析SFB基因在不同时期的表达特性。结果表明,在27个品种中扩增出4种大小不同的条带,引物组合1在26个品种中扩增出条带,其中品种贝新纳尔,赛买提的片段大小为447 bp;大优佳的片段大小为446 bp,其余品种的大小为434 bp。引物组合2在品种托乎提中扩增出大小为660 bp大小的条带。序列比对显示27个品种的SFB基因为20种基因序列,与其他物种SFB基因序列比对显示20种基因序列均为新SFB基因序列,在GenBank上的登录号为:HQ148064-HQ148083;SFB基因在3个杏品种花粉离体培养不同培养时期均有表达,其表达丰度的变化趋势一致,呈先增后减的趋势,均在培养24 h时表达丰度最高,但是每个品种的表达峰值不同。     

11个延边地区栽培梨品种的S基因型鉴定

鉴定梨品种的S基因型可为合理配置授粉树、杂交亲本选配提供理论依据。为鉴定11个延边地区栽培梨品种的S基因型,利用梨的自交不亲和基因（S-RNase）特异引物FTQQYQ和anti-IIWPNV,对11个梨品种的基因组DNA进行S基因特异扩增,并对扩增片段进行回收、克隆、测序,使用生物信息学软件对各序列进行分析和同源性搜...     

‘小白杏’自交不亲和SFB基因RNAi表达载体的构建

【目的】应用RNA干扰(RNAi)技术在分子水平调控杏自交不亲和性状,为培育自交亲和杏品种奠定基础。【方法】基于南疆自交不亲和杏品种‘小白杏’(Prunus armeniaca‘Xiaobaixing’)花粉决定子SFB(S-haplotype-specific Fbox protein)基因3’端c DNA全长序列,选取SFB基因变异区上游距起始密码子61 bp处、大小为29 bp的片段作为干扰序列,棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR(Fusion PCR)构建SFB基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihp RNA),再酶切连接到植物表达载体p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII上,构建SFB基因RNAi表达载体;用冻融转化法将重组质粒转化至农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中。【结果】测序结果表明臂长29 bp、茎环242 bp的SFB基因ihp RNA结构融合成功,双酶切检验和PCR验证结果表明,该结构正确地插入p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的启动子和终止子之间,说明SFB基因的RNAi表达载体p CAMBIA-RNAi-SFB构建成功;PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌LBA4404中。【结论】研究结果表明,应用融合PCR结合酶切连接的方法构建SFB基因的RNAi表达载体是可行的,为RNAi技术在果树自交不亲和性状改良上的应用创造了条件。     

甜樱桃‘拉宾斯’自交亲和性与SFB4′基因的关系研究

甜樱桃品种‘拉宾斯’与‘雷尼’均为S1S4基因型。调查其自花结实率,‘拉宾斯’为31.3%,表现自交亲和;‘雷尼’为0,表现为自交不亲和。将‘拉宾斯’与‘雷尼’相互授粉,‘拉宾斯’为父本时表现亲和,反之不亲和,推断‘拉宾斯’的自交亲和性由花粉侧突变导致;调查花粉萌发率,‘拉宾斯’为58.08%,‘雷尼’为57.82%。鉴定‘拉宾斯’自交后代及其与‘雷尼’杂交后代的S-RNase的基因型,发现所有后代中均出现S4基因型,部分后代中出现S1基因型,证明‘拉宾斯’花粉育性是正常的,其亲和性可能是由S4基因座上花粉侧的基因突变导致。测序发现‘拉宾斯’花粉SFB4′在911 bp处有4个碱基缺失。分析‘拉宾斯’花粉SFB4′与花柱S4-RNase的连锁性,发现两者连锁率为100%。以‘拉宾斯’为父本的带有SFB4′的杂交后代的自花结实率为23.3%~61.4%,表现自交亲和,说明来源于‘拉宾斯’的SFB4′基因与自交亲和性有关。RT-PCR及测序显示‘雷尼’SFB4与‘拉宾斯’SFB4′均能正常转录,但4个碱基缺失导致其C端翻译提前终止,原核表达SFB4和SFB4′蛋白发现SFB4略大于SFB4′,推测是由于SFB4′的翻译提前终止导致的。以上结果表明:‘拉宾斯’的自交亲和性可能是由花粉侧SFB4′C端的氨基酸缺失导致,该缺失可能使其丧失了与S-RNase的识别能力。     

2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析北大核心CSCD

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

中国樱桃泰山干樱S-RNase基因的克隆及序列分析

以中国樱桃品种泰山干樱为试材,利用李属植物C2、C5保守区引物,扩增花柱S-RNase基因,获得4个S等位基因,测序结果表明序列大小分别为:1608、950、796、504bp。根据同源比较发现大小为796bp的等位基因与基因库中登录的S1-RNase为同一基因,其它3个S-RNase基因为首次报道,依序列大小分别命名为S2(1608bp,登陆号EF541168)、S4(950bp,登陆号EF541173)和S6(504bp,登陆号EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3区存在终止密码子,导致翻译提早终止;S4-RNase的C5区前有插入片断;S6-RNase在高变区比其它S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较分析表明,中国樱桃S-RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S-RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。     

枇杷属植物3个新S基因鉴定及大渡河枇杷分类地位的新证据

【目的】鉴定枇杷属普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷3个种的S-RNase基因型,为利用其优良性状开展种质创新,以及大渡河枇杷分类地位的探讨提供科学依据。【方法】以苹果S-RNase基因高度保守区设计兼并引物对3个种的基因组DNA进行PCR扩增,片段回收、克隆及测序,分别采用BLASTn、BLASTx、DNAMAN和CLUSTALW软件进行同源性检索、序列比对和结构分析。【结果】从参试的3个种中共分离了4个S等位基因,分别为S2-RNase、S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase,其中S26-RNase、S32-RNase和S34-RNase为新分离的枇杷S-RNase基因,GenBank登录号分别为:MG765271、MG846012和MG812504。所克隆获得的4个枇杷S-RNase基因与苹果S-RNase基因的氨基酸序列结构相同,具有5个保守区(C1、C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV)。此外,所获得的4个枇杷S-RNase基因电泳图谱及同源性和进化分析结果表明,大渡河枇杷可能为普通枇杷和栎叶枇杷的杂交后代。【结论】确定了普通枇杷野生种、栎叶枇杷和大渡河枇杷的S-RNase基因型分别为S2S26、S32S34和S26S32。大渡河枇杷S-RNase基因型及S-RNase的同源性和系统进化分析结果支持其可能为普通枇杷和栎叶枇杷杂交后代的结论。     

中国原产果梅自交亲和变异品种花粉决定基因SFB的插入突变

 果梅是配子体自交不亲和树种,但在长期进化过程中也出现了自交亲和品种。以果梅典型的自交不亲和品种‘南高’和自交亲和品种‘甲州小梅’为对照,采用田间自交授粉试验对原产于中国的‘四川白梅’和‘长农17’两个果梅品种进行了自交亲和性鉴定,结果表明：其自花授粉坐果率分别为30.73%和16.27%,属于自交亲和品种。进一步通过AS-PCR分析发现花粉SFB基因存在一段插入序列,造成了分子水平的基因突变。推测该基因的突变使‘四川白梅’和‘长农17’SFB功能发生改变,从而自交亲和。     

李梅杏类种质资源的RAPD分析

为探讨李梅杏种质资源与其近缘种李、杏之间的亲缘关系,对来源于山东、辽宁等地的李梅杏种质资源及李、杏等品种共30份进行了RAPD和S等位基因的PCR扩增分析,结果表明,李梅杏与李、杏之间亲缘关系较近;聚类分析结果显示大部分李梅杏与中国李的遗传距离较近,表明李梅杏的母本可能为李;同时S等位基因的PCR扩增结果显示李梅杏与李的扩增条带数一致,均为一条且位置相近,表明李梅杏与李的进化趋同性可能较杏更近。     

新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因的检测

 为系统鉴定新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因型,以新疆25个主栽杏品种为试材,利用蔷薇科保守序列设计引物对叶片基因组DNA进行SFB基因特异PCR扩增,筛选出有效的扩增引物;对成功扩增的杏品种的特异条带克隆测序,在GenBank上进行BLASTN比对,确定各品种的SFB基因型。结果显示：引物组合Ⅱ-1、Ⅳ-2,1-Ⅰ、1-Ⅱ对新疆杏品种的扩增效果最好,成功地在18个品种上扩增出了5种大小不同的条带,14种不同的基因型,其中两     

金太阳杏花粉超低温保存方法研究

为探讨杏花粉种质保存的方法,进而为花粉培养、遗传转化和杂交育种提供材料,以杏品种金太阳的新鲜成熟花粉为试材,采用干燥法和玻璃化法2种超低温保存技术,对花粉干燥时间、解冻方式和贮藏时间等影响保存后花粉萌发率的有关因素进行研究。结果表明,干燥时间对金太阳杏花粉超低温保存后的萌发率有显著影响,其中干燥法宜在4℃下硅胶干燥8h、玻璃化法宜在(20±1)℃下以玻璃化液PVS2(体积分数15%二甲基亚枫+15%乙二醇+30%甘油+0.4mol/L蔗糖)处理60min;干燥法保存后分别以4℃2h、20℃30min和40℃70s等3种方式化冻,花粉萌发率无明显差别,而对玻璃化法则以40℃70s化冻后的花粉萌发率最高;以2种方法分别保存1、10、30、60d后花粉萌发率无显著变化。     

桃自交亲和性的分子机制及遗传特性研究

 以油桃（Prunus persicavar.necturina）‘中油5号’及其自交后代为试材,利用花柱S-RNase基因和花粉SFB基因的特异性引物进行PCR扩增,对扩增片段进行回收、克隆、测序和Blast分析,确定了‘中油5号’的自交不亲和基因型为S₁S_2(m)。序列分析结果显示,‘中油5号’桃S₁-RNase和S_2(m)-RNase与多个其他李属S-RNase基因氨基酸和核苷酸序列间都具有极高的相似性,SFB₁和SFB₂基因与多个其他李属SFB基因氨基酸和核苷酸序列间也都具有极高的相似性。进一步对‘中油5号’自交后代个体的S基因型进行检测,发现后代群体中存在3种S基因型,分别为S₁S₁、S₁S_2(m)和S_2(m)S_2(m),且分离比为8︰13︰7,与预期的比例1︰2︰1差异不显著（χ² = 0.214 < χ²_0.05,2 = 5.991）,说明S-RNase基因和SFB基因都遵循两因素的孟德尔遗传规律进行连锁分离。此外,基因型为S₁S₁和S_2(m)S_2(m)的纯合体的存在,表明桃花粉SFB₁和SFB₂基因均不能被自身花柱S-RNase所识别,这是由于SFB₁和SFB₂基因翻译提前终止所造成的,从而使‘中油5号’表现出自交亲和性。     

普通杏品种SSR遗传多样性分析

利用来自杏、桃和扁桃的25对SSR多态性引物对66个普通杏品种进行了PCR扩增及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,共检测出284个等位位点,每对引物的等位位点数在3～17之间,平均为11.36。通过NTSYS软件计算得到的Dice相似性系数为0.083～0.987,平均值为0.370,表明中国普通杏种质资源的遗传多样性丰富。UPGMA法聚类将66份材料分为5个组。SSR标记反映出的品种间亲缘关系与根据地理生态类型对杏种质的分类结果基本一致。来自四川和贵州的多数品种独立聚成一组,表现出与其它品种较远的亲缘关系,该地区可能存在特异性较高的种质资源。证实了扁桃基因组SSR引物可用在杏SSR标记的研究中。     

梅及其近缘种数量分类初探

对包括野梅、半野生梅、栽培果梅和桃、山桃、光核桃、杏、山杏、藏杏、洪平梅及李等共４１个分类运算单位（ＯＴＵ）选用３７个性状进行聚类分析。结果表明，梅种内可聚力杏梅、常绿梅、品字梅、毛梅、小梅、长梗梅、野梅、果梅等８个类群。以距离系数而论，与梅亲缘关系最近者为洪平梅、藏杏，其余依次为山杏、杏、山桃、光核桃、桃、李等。参照聚类结果、形态分类以及其它因素，提出了梅种内及若干近缘种有关分类位置的方案。     

新疆栽培杏群体遗传结构的SSR分析

 利用11对SSR引物对喀什、和田和库车3个新疆栽培杏( Prunus armeniaca L. ) 品种亚群进行了分子系统学研究。结果表明: 各位点平均期望杂合度(He = 0.2364) 显示新疆栽培杏群体具有较高的遗传多样性水平。根据基因分化系数(Gst = 0.1508) 值, 新疆杏各品种亚群的遗传分化主要存在于亚群(84.9%) 内。基于Gst测得的基因流Nm 为2.3666, 人为通过种子引种可能是其基因交流的主要方式。根据果实形态和地理起源对新疆杏进行传统分类并不能完全反映出新疆杏品种间的亲缘关系。