奶牛乳腺炎病原菌的分离、耐药性分析及其特异性卵黄抗体的体外抑菌效果

试验从新疆石河子地区3个建设兵团采集60份临床型乳腺炎患牛的奶样。细菌分离纯化后,在VITEK 2微生物自动分析系统基础上,利用16S r DNA序列分析对乳腺炎主要致病菌进行菌种鉴定,并对病原菌进行药敏试验。结果表明,60份奶样中共分离14种细菌,其中无乳链球菌(S.agalactiae)最多(20%),其次为金黄色葡萄球菌(S.aureus)(15.56%)。选择14种常用抗生素,采用Kithy-Bauer纸片法,对分离出的病原菌进行药敏试验,无乳链球菌和金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药性最强(耐药菌株最多)。通过免疫蛋鸡制备无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的特异性卵黄抗体(Ig Y),体外抑菌试验表明,10mg/m L的特异性Ig Y能够有效抑制两种细菌的生长,为卵黄抗体替代抗生素防治奶牛乳腺炎提供一定理论基础。     

用表达人溶菌酶基因的重组质粒防治干乳期奶牛乳腺炎

将人溶菌酶（human lysozyme，hLYZ）cDNA插入由pcDNA3改造而成的pcDNAK表达载体。用获得的重组载体pcDNAKLYZ转染COS-1细胞，经免疫荧光试验证明能进行正确表达。将重组载体注射于哺乳母鼠，取其乳汁进行溶菌酶活性测定，结果显示，分泌在乳汁中的重组hLYZ高达139mg／L。根据乳汁体细胞检测结果，选择健康奶牛和乳腺炎阳性奶牛，分别在干奶时和产犊前2周2次注射重组质粒pcDNAKLYZ，注射途径为乳腺基部穿刺，注射剂量为300μg／乳区,于产犊后1个月采集奶样进行体细胞检测，结果显示，对前一泌乳期发生的奶牛乳腺炎的治愈率为91．5％，对下一泌乳期奶牛孔腺炎的预防有效率王少为96．97％。由此认为。构建的表达hLYZ基因的重组表达质粒，可以替代抗菌素类油乳剂用于干乳期乳腺炎的防治。     

苏中地区规模化牧场奶牛乳腺炎病原菌鉴定及药物敏感性分析

从江苏省南通市大生源牧场、盐城市泰来神牧场及连云港市三元双宝牧场采集分析了12个月的奶牛乳样,通过分析3个牧场奶牛乳腺炎发病率的季节变化发现,冬季发病率普遍低于夏秋季。以2017年7月份南通市大生源牧场321头奶牛的乳样为例,采用奶牛生产性能测定(DHI)随机筛选出20头患有临床型乳腺炎的奶牛乳样,经过细菌分离纯化培养后采用PCR技术鉴定致病菌种类。结果显示:这20份乳样中共分离鉴定出枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、苏云金杆菌、微杆菌、金黄色葡萄球菌、格氏乳球菌、分支杆菌、大肠杆菌、气单胞菌、枸橼酸杆菌、不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌共13种细菌,其中以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枸橼酸杆菌、不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌感染为主;此外,奶牛大都感染了3种及以上致病菌,说明奶牛乳腺炎以多种致病菌混合感染为主。选用6种抗生素药物组合对混合乳样致病菌进行药敏试验,结果显示氨苄西林钠、青霉素钾、硫酸链霉素共同处理组体外抑菌效果最好,为苏中地区大生源牧场奶牛乳腺炎防治提供一定的理论基础。     

小鼠乳腺炎模型的建立及肿瘤坏死因子变化的研究

<正>乳腺炎是奶牛最常见的产科疾病之一,已成为影响奶牛养殖业发展的最严重疾病之一,不仅危害奶牛健康,降低产奶量,影响奶的品质,而且还降低奶牛的繁殖性能。引起奶牛乳腺炎的最主要的病原菌是金黄色葡萄球菌和无乳链球菌,其中金黄色葡萄球菌危害最严重。本试验用从乳腺炎病牛奶样中分离的金黄色葡萄球菌人工诱发小鼠乳腺炎,建立小鼠乳腺炎模型,通过ELISA法测定乳腺组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的变化研究动物体乳腺感染情     

牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的鉴定及其生物学特性

β溶血素(β-hemolysin,Hlb)在金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺的致病过程中起到了重要的作用,但是关于牛源抗β溶血素的免疫制剂研究较少。本研究首先以金黄色葡萄球菌ATCC25923的DNA为模板,利用PCR技术扩增编码β溶血素的基因hlb,构建原核表达质粒pET32a-hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组Hlb蛋白。以纯化的重组Hlb蛋白为包被抗原,从牛源噬菌体单链抗体表达文库中筛选到了一株针对β溶血素高亲和力单链抗体(single-chain variable fragment, scFv),通过构建原核表达质粒pET32a-scFv在大肠杆菌Transetta中诱导表达。结果表明,重组Hlb蛋白具有良好的溶解奶牛红细胞的能力,抗β溶血素单链抗体可以显著抑制重组Hlb蛋白和金色葡萄球菌培养物上清的溶血作用。本研究一方面为研制抗金色葡萄球菌所致奶牛乳腺炎新型抗体制剂提供参考,另一方面也为深入研究β溶血素在金色葡萄球菌致病过程的作用奠定基础。     

呼和浩特地区不同养殖模式下引起奶牛隐性乳房炎的主要致病菌

本试验通过采集呼和浩特不同的地区的不同养殖模式（牧场、小区、奶站）的奶样,进行实验室的分离、培养及鉴定,分析引起呼和浩特地区奶牛乳房炎发病的主要致病菌,为针对性预防和治疗乳房炎提供理论基础。结果显示,呼和浩特地区乳腺炎以金黄色葡萄球菌感染为主,以环境性病原微生物感染为辅。金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎仍是困扰呼市奶牛养殖业的主要问题,环境性病原菌感染引起的乳腺炎也是影响奶牛养殖的大难题。     

奶牛乳腺炎病原菌的分离鉴定及中药透皮剂治疗

对佳木斯市8所规模型奶牛场做了乳腺炎发病情况调查,随机采集了88份临床型乳腺炎乳样和176份隐性乳腺炎乳样做了细菌学检查,并对分离得到的病原菌进行鉴定,同时采用中草药透皮剂治疗发病奶牛.试验结果表明,引起奶牛乳腺炎主要病原菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、化脓链球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌、沙门氏菌;中药透皮剂治疗奶牛乳腺炎实验表明治疗效果良好.     

奶牛乳房炎无乳链球菌Fc-Sip和金黄色葡萄球菌Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗的免疫试验研究

为探究由IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌(S. agalactiae,Sgc)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sau)保护性抗原亚单位疫苗的免疫效果,在本实验室前期研究基础上,本研究按体积11的比例将Sgc的Fc-Sip和Sau的Fc-FnBPB-ClfA两种蛋白分别与1%的盐酸左旋咪唑(1%LH)充分混合,制备两种亚单位疫苗。将即将干奶(妊娠220 d)、CMT试验为"++"以上的奶牛随机分为4组,分别将Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗(A组)、Fc-Sip亚单位疫苗(B组)、Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗(C组)通过首次肌肉免疫和二次乳头管灌注免疫方式进行免疫试验。通过免疫前后对乳样细菌分离、体细胞数测定及免疫血清抗体滴度测定,评价上述亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛的乳样细菌分离率分别为80%、90%、80%,其中Sgc检出率分别为20%、30%、10%,Sau检出率分别为30%、20%、10%;首免90 d后3个免疫组奶牛乳样细菌分离率分别降至20%、20%、40%,其中Sgc的检出率分别降至0、0、10%,Sau的检出率分别降至10%、10%、0,对照组免疫前后以上各项检测无明显变化。使用利拉伐牛奶体细胞检测仪检测免疫前后试验奶牛乳样中的体细胞数,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛体细胞数均值分别为6.19×105个/mL、5.16×105个/mL、5.49×105个/mL,首免90 d后3个免疫组奶牛乳样中体细胞数均值分别为2.05×105个/mL、2.04×105个/mL、2. 52×105个/mL,而对照组奶牛乳样体细胞数与免疫前无明显变化。检测首免后0、7 d、14 d、28 d、60 d、90 d的血清抗体滴度,结果显示,首免后7 d,免疫组(A、B、C)80%的奶牛血清抗体滴度为11 024;第14 d后,免疫组(A、B、C)90%奶牛血清抗体滴度达到12 048;第28 d后,免疫组(A、B、C)80%奶牛血清抗体滴度在14 096～18 192,比对照组平均上升3～4个抗体滴度,对照组奶牛血清抗体滴度一直保持在1256～1512。综合分析以上试验结果显示免疫A组(Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA)综合免疫效果在各免疫组中最佳。本研究结果表明Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎具有较好的治疗和预防作用,为奶牛隐形乳房炎的防治提供了实验依据。     

牛源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及ClfA基因的克隆和真核表达载体的构建

以研制安全有效的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌基因工程疫苗为目的,采集380份隐性和临床型乳房炎奶样,经高盐肉汤、过氧化氢酶、甘露醇发酵、三糖铁发酵试验以及Baird-Parker平板对金黄色葡萄球菌进行分离和生化鉴定,PCR扩增分离株凝集因子基因(Clf A)并连接TA克隆载体。经测序确定无误后,连接pc DNA3.1His B以构建真核表达载体pc DNA 3.1His B-Clf A,转化Trans T1TM感受态细胞,HindⅢ和XhoⅠ双酶切分析,同时进行测序和序列分析。结果显示,通过高盐肉汤、过氧化氢酶、甘露醇、三糖铁试验和Baird-Parker平板从380份隐性及临床型奶牛乳房炎奶样中共分离到35株金黄色葡萄球菌,成功构建了真核表达载体(pc DNA3.1His B-Clf A),为研制金黄色葡萄球菌基因工程疫苗奠定基础。     

人溶菌酶基因治疗奶牛乳腺炎的初步研究

将两种自行构建的表达人溶菌酶基因的重组质粒注射到患病奶牛的乳腺,经CMT试验证明对临床型和隐性乳房炎具有治疗作用。将其中的p205C3LYZ注射入奶牛乳腺,经微球菌溶解试验证明溶菌酶的表达量达到1．18μg／ml以上,表达至少维持8d。不同注射次数、剂量和途径的试验结果表明,重组质粒的治疗作用具有剂量和次数依赖性,3次注射450μg或2次注射400μg的治疗效果相当,乳房基部注射的治疗效果优于乳池注射。以CMT结果为主要指标的对比治疗试验结果表明,重组质粒对隐性奶牛乳房炎的治疗效果与青链霉素合剂接近,有效率分别为19／22(86．4％)和8／9(88．9％),优于中药乳炎消的治疗效果(9／13,69．2％)。3种药物治疗后,奶样中的细菌总数及葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等代表性致病菌的数量有明显下降,重组质粒和抗菌素治疗组的奶产量上升幅度高于中药治疗组。结果表明,表达人溶菌酶基因的重组质粒对奶牛乳房炎具有可靠、持久的治疗效果,可以代替抗菌素使用。     

奶牛乳房炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测奶牛奶样中无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的方法,根据无乳链球菌sip基因、停乳链球菌isp基因、乳房链球菌pauA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因各设计1对特异性引物,建立多重PCR检测体系。结果显示,该检测方法具有高特异性,无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌敏感性分别为105、104、105、105 CFU/mL。对临床采集的460份奶样检测结果表明,建立的多重PCR体系可以用于临床上无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测。     

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌FnBPA蛋白免疫研究

为了研究奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌发病机制和治疗措施,对引起奶牛临床型和隐性乳腺炎的337株金黄色葡萄球菌进行FnBPA蛋白基因分子调查,并且表达和纯化了FnBPA蛋白,制作FnBPA蛋白疫苗进行动物免疫试验。结果表明,FnBPA蛋白基因携带率为51. 04%,临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌FnBPA蛋白基因的携带率为68. 5%。选取分离菌株10A扩增出的FnBPA基因,进行原核表达,重组蛋白得到高效表达,获得高纯度的FnBPA蛋白,BCA法蛋白定量为2. 8 mg/mL,制作蛋白疫苗免疫3头试验奶牛,30～40 d后,ELISA检测血清抗体滴度达到高峰,最高抗体滴度达到7l og_2,该蛋白具有很好的抗原性。     

长春市某奶牛场乳腺炎病原菌的分离鉴定及耐药性分析

奶牛乳腺炎是制约奶牛养殖效益和奶品质的主要疾病之一，为了解当前长春市某大型集约化奶牛场奶牛乳腺炎病原菌流行和耐药情况，本试验对该场奶牛乳腺炎发病情况进行了调查，对采集的119份临床型乳腺炎乳样进行细菌分离鉴定并对分离鉴定的病原菌进行小鼠致病性试验和药敏试验。结果显示：该场奶牛乳腺炎发病率在4%左右，初产牛乳腺炎发病率明显高于经产牛，乳腺炎发病率还与胎次、年龄等因素相关。本试验共分离鉴定出木糖葡萄球菌49株(42.2%)、松鼠葡萄球菌39株(33.6%)、大肠杆菌15株(12.9%)、金黄色葡萄球菌5株(4.3%)、无乳链球菌3株(2.6%)、菠萝泛菌3株(2.6%)、产酸克雷伯菌1株(0.9%)和铜绿假单胞菌1株(0.9%);其中菠萝泛菌、无乳链球菌和铜绿假单胞菌对小鼠具有较强致病性。药敏试验结果显示，分离菌株的耐药性普遍存在，大肠杆菌和铜绿假单胞菌耐药种类最多。除无乳链球菌外，其他菌株均对庆大霉素或阿米卡星敏感，可作为该场奶牛乳腺炎治疗首选药物。本试验通过对该场乳腺炎调查、分离菌鉴定和耐药性分析，为该场乳腺炎的防治提供了参考依据。     

奶牛乳腺炎5种病原菌多重PCR快速检测方法的建立与评价

为建立一种能同时快速检测多种奶牛乳腺炎致病菌的多重PCR检测方法,本研究以化脓隐秘杆菌ISR基因、无乳链球菌cfb基因、大肠杆菌phoA基因、副乳房链球菌23S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,设计并合成了5对特异性引物,通过方阵法对多重PCR反应体系及反应条件优化,建立了一种能快速检测5种病原菌的多重PCR方法。对各菌种随机组合后利用该多重PCR方法检测,结果显示,该方法能同时快速检测奶牛乳腺炎乳样中5种主要病原菌,而其他病原菌则呈阴性结果,具有较强特异性。分别将化脓隐秘杆菌、无乳链球菌、大肠杆菌、副乳房链球菌、金黄色葡萄球菌菌液10倍倍比稀释后,利用建立的多重PCR方法进行检测,确定该方法敏感性,结果显示,该方法对5种病原菌最低检测浓度分别为:金黄色葡萄球菌6.25×10~4cfu/mL,大肠杆菌2.95×10~6cfu/mL,化脓隐秘杆菌2.95×10~5cfu/mL,副乳房链球菌4.3×10~5cfu/mL,无乳链球菌3.15×10~5cfu/mL。对临床送检及人工模拟的乳样检测结果显示该方法具有较好符合率及灵敏度。本研究首次建立了对包括副乳房链球菌在内的奶牛乳腺炎致病菌多重PCR检测方法,为快速检测奶牛乳腺炎病原菌提供了可行的技术手段。     

宁夏部分地区奶牛乳腺炎病原菌的分离鉴定

从宁夏9个县(区)的16个规模化牛场采集327份患乳腺炎奶牛乳样,通过分离培养和生化试验,检出含细菌乳样226份,乳样细菌检出率69.11%(226/327);鉴定出奶牛乳腺炎病原菌5大类9种260株,确认宁夏部分地区奶牛乳腺炎主要病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和酵母菌。乳腺炎的发生以单一病原感染为主,占84.96%(192/226);混合感染较少,占15.04%(34/226)。     

菌丝霉素抑菌活性鉴定及其在防治牛乳腺炎中的应用

试验目的是通过毕赤酵母系统高效表达一种新的真菌防御素菌丝霉素,鉴定它的抑菌活性,并考察其对牛乳腺炎疾病的防治功能。将菌丝霉素基因克隆到酵母表达载体p Pic Zα中,转化并重组到毕赤酵母GS115中。经过甲醇诱导表达,分离纯化,进行体外抑菌活性鉴定。结果显示菌丝霉素在1μg/ml浓度下,对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等起到抑制作用,对耐药性金黄色葡萄球菌的MIC为10~50μg/ml。鉴于上述细菌是引起奶牛乳腺炎的重要致病菌,我们将0.05%菌丝霉素蛋白灌注到奶牛乳腺中,经过7 d的治疗期,发现奶牛乳腺炎得到有效治疗或缓解。上述结果表明菌丝霉素在0.05%剂量下,对奶牛乳腺炎具有防治作用,可望开发为一种新兽药。     

石河子地区奶牛临床型乳腺炎源葡萄球菌的分离鉴定与药敏试验

为了解新疆石河子地区奶牛临床型乳腺炎源葡萄球菌的耐药情况，试验采用选择培养基对来自石河子地区规模化奶牛场患临床型乳腺炎奶牛乳样中的葡萄球菌进行分离，并对分离菌进行革兰氏染色观察、生化鉴定、16S rDNA基因PCR鉴定和药敏试验。结果表明：革兰氏染色观察到两种形态的葡萄球菌疑似菌，经生化鉴定及16S rDNA基因PCR鉴定确定分离到1株金黄色葡萄球菌和1株产色葡萄球菌，分别命名为金黄色葡萄球菌sau raw milk China和产色葡萄球菌sch raw milk China;其中金黄色葡萄球菌sau raw milk China对氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素和复方新诺明耐药，对青霉素G、环丙沙星、氟哌酸中介，对头孢噻吩、红霉素、克林霉素、四环素和氧氟沙星敏感；而产色葡萄球菌sch raw milk China对红霉素中介，对其他11种药物敏感。说明金黄色葡萄球菌和产色葡萄球菌可能是石河子地区奶牛临床型乳腺炎的主要病原菌，且对临床常用抗生素具有一定的敏感性。     

多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

多重PCR与细菌培养法检测牛乳中病原菌的对比研究

为了验证所建立的多重PCR法检测奶牛乳腺炎的灵敏性,应用所建立的多重PCR法与传统细菌培养法对临床型乳腺炎(54份)和隐性乳腺炎(145份)共计199份乳样进行了无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测,检测结果用SPSS 18.0软件进行统计分析。结果表明:对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测,多重PCR法的灵敏性显著高于细菌培养法(P0.05),而对无乳链球菌的检测,两种方法的敏感性无显著差异(P0.05)。说明所建立的多重PCR法灵敏性高于细菌培养法。     

新疆巴州地区某规模化奶牛场致奶牛隐性乳腺炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定

为了解新疆巴州地区金黄色葡萄球菌在奶牛隐性乳腺炎中所起的作用,实验对巴州地区某规模化奶牛场患隐性乳腺炎奶牛的乳样进行金黄色葡萄球菌分离,通过形态学特征观察、生化特性鉴定、16S rRNA鉴定,结果表明此奶牛场隐性乳腺炎的患病率为14.5%,最终确定13株分离菌均为金黄色葡萄球菌,占样本数的7.1%(13/184)。该结果为巴州地区金黄色葡萄球菌性奶牛隐性乳腺炎防治提供了科学依据。