猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定

根据文献报道的猪肌生成抑制素基因cDNA序列，分别从第1、第2和第3外显子中设计引物，以大约克猪染色体DNA为模板，分段扩增出含内含子和外显子的序列。将所得各序列回收、克隆到pGEM-easyT载体中，然后进行序列测定。合并所有测得的猪肌生成抑制素因序列，共获得6kb连续序列。分析结果表明，猪肌生成抑制素基因第1内含子长1809bp，第2外显子长374bp，第2内含子长1978bp。所测得的外显子序列与已发表的cDNA序列同源分析比较，没有出现引起氨基酸改变的突变。表明瘦肉型猪（大约克猪）肌生成抑制素基因仍很完整，可通过改变基因结构等降低肌生成抑制素活性的方法提高瘦肉率。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554 bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1 650 bp,含一个462 bp的内含子;其cDNA编码区全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470.该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点.     

猪泛素-B 基因的克隆及组织表达谱分析

从人泛素-B（Ubiquitin B,UbB）基因mRNA序列出发,在猪的ESTs库中进行同源性搜索,通过电子克隆和进一步RT-PCR方法从猪肌肉组织总RNA中扩增出泛素-B基因部分cDNA序列（GenBank登录号：EF688558）,长894bp,其中在89～778bp处包含一个完整的开放阅读框,编码229个氨基酸。猪泛素-B基因由2个外显子和1个内含子构成（GenBank登录号：EF688559）,内含子长657bp,符合GT-AG规则。序列分析结果表明：猪泛素-B基因与已报道的人、黑猩猩、小家鼠、大鼠、鸡等物种的泛素-B基因高度同源,同源性分别为92％、91％、91％、91％、89％,氨基酸序列同源性为100％。半定量RT-PCR结果表明：泛素-B基因在150日龄肥育猪心脏、肝脏、肾脏、小脑中的表达量较高,脾脏、肺脏、胃、膀胱、背最长肌、大脑次之,脂肪和下丘脑中的表达量最低,其在蓝塘与长白猪肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、膀胱、背最长肌等7个组织中的表达量存在差异。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。     

野生大豆DREB基因cDNA的克隆与分析

以野生大豆Glycine soja叶片总RNA为模板，根据其他双子叶植物DREBP/AP2结构域的保守氨基酸序列设计简并引物，通过降落和巢式PCR进行扩增，获得1条190 bp的cDNA片段。以此序列设计引物，采用RACE扩增3’和5’末端未知序列，最终克隆到野生大豆DREB全长基因（GsDREB）。该基因1 191 bp编码395个氨基酸，基因内部没有内含子。氨基酸分析表明，其N 末端具有核定位信号（nuclear localization signal, NLS），并具有由58个氨基酸编码的、能够与DNA结合的保守区域 DREBP/AP2结构域。通过多序列比对分析，该基因与拟南芥Arabidopsis thaliana DREB2C氨基酸序列相似性最高，推测其为DREB2亚家族的成员。     

荣昌猪自细胞介素-6基因的克隆与序列分析

根据GenBank收录的猪白细胞介素-6（PIL-6）设计1对特异性引物，经刀豆蛋白素A（Co—nA）诱导猪淋巴细胞并提取总RNA，用1it—PCR方法扩增出荣昌猪IL-6的cDNA。将扩增基因连接到PMD18-T质粒上，经酶切鉴定和序列测定证明该序列是PIL-6。序列分析结果表明：该基因cDNA全长741bp，开放阅读框由639个核苷酸组成，推测产生的编码产物由212个氨基酸组成。核酸序列分析比对发现：荣昌猪IL-6与GenBank已发表的IL-6序列的同源性较高，为99．8％。100％，氨基酸的同源性为99．5％-100％。对荣昌猪IL-6基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析，表明其与IL-6基因氨基酸序列性质一致。     

猪NDUFS2基因的定位、克隆和组织表达谱分析

利用辐射杂种克隆板对猪NDUFS2(NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein 2)基因进行了染色体定位,克隆了该基因的CDS序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用半定量RT-PCR对基因的组织表达谱进行了分析。研究结果表明:NDUFS2基因定位于猪的4号染色体SSC4q,与标记SW589紧密连锁。获得NDUFS2基因的CDS为1 392 nt,编码463个氨基酸。物种间系统进化树分析表明:猪与牛的NDUFS2基因序列同源性更高。结构预测发现猪NDUFS2基因具有一个NuoD保守结构域,与能量的产生和转化功能有关。根据组织表达谱分析结果,NDUFS2在猪的11种组织中的表达量有差异。     

牛FABGL基因的分离与染色体RH定位

以中国西门塔尔牛血样为材料,提取基因DNA,运用同源序列克隆技术对牛FABGL基因DNA序列进行了克隆与分析,应用SUNbRH7000型辐射杂种板（RH）对分离的牛FABGL基因进行了染色体定位。结果显示,本研究所获得的长为1 925 bp的DNA序列为牛FABGL基因的包含全部9个外显子的基因组序列。该序列与人（NM-014234）和猪（AF-146398）的FABGL基因序列的相似性分别为84%和90%;牛FABGL基因被定位于牛的23号染色体上,与该染色体上的标记BM47的距离为1.71 cR,两点评分值为31.05。     

猪Cathepsin B 基因cDNA分子克隆、序列分析及遗传多态性分析

采用 RT-PCR 结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总 RNA 中克隆出了猪组织蛋白酶 B(Cathepsin B,CTSB)基因的 cDNA 序列,并推导出其编码的氨基酸序列.猪 CTSB 基因开放阅读框(ORF)全长1 008 bp,编码335 个氨基酸.同源性分析结果表明,猪与人、鼠、牛的 CTSB 基因 cDNA 编码区(CDS)同源性分别为 85%、81%、90%,推测的氨基酸序列同源性分别为 81%、79%、91%.利用同源性结合序列特征预测表明该蛋白具有信号肽和前肽序列.蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白具有木瓜蛋白酶家族的典型空间结构,包括1个底物结合凹槽和3个相互靠近的活性位点.另外采用 PCR-SSCP 方法,在147头个体中分析了CTSB基因第6内含子内的SS-CP位点多态性,检测到3个等位基因6种基因型.FF基因型个体的各项嫩度指标最高,其最大剪切力与硬度值分别为6.56 kg和23.55 kg·s,极显著地高于 EE 和 EF 基因型个体(P<0.01),平均剪切力为4.85 kg,显著地高于EF基因型个体(P<0.05).     

羊驼生长激素基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR和PCR技术克隆得到了羊驼生长激素(Growth hormone,GH)基因,包括完整的编码区812 bp 的cDNA序列和1 800 bp 的DNA序列.两者比对后证明羊驼GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽.序列比较结果表明,羊驼GH基因序列与骆驼、猪、马、犬和猫等哺乳动物类似,但羊驼GH基因的启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而同骆驼一样为CATA盒.在DNA和cDNA水平以及推导的氨基酸水平,均与骆驼的同源性最高.通过GH氨基酸的功能位点分析推测,羊驼生长激素与人、猪等大多数动物的生长激素无明显功能上的差异.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒辽宁分离株ORF5基因的克隆与序列分析

本试验以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)发病猪病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的ORF5基因全长cDNA,结果该分离株ORF5基因编码区长603bp,可编码200个氨基酸。与美洲型代表株VR2332、欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为89.5%和55.7%。推测该辽宁分离株属于美洲型。     

杜大长猪IGF-I基因的克隆及其序列分析

采用ＴＲＩzol法从杜大长杂交猪的肝脏中提出总ＲＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板 ,以设计的Ｐ１（５′－ＣＴＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣ－３′）为引物合成ＩＧＦ－Ｉ基因cＤＮＡ的第１链,再以Ｐ１和Ｐ２（５′－ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＴ－３′）为引物扩增到大小约为３６０bp的产和,并将其达隆至pＧＥＭ－Ｔ载体上。经筛选、酶切、我分析,表明该片段为ＩＧＦ－Ｉ基因的cＤＮＡ     

猪血清白蛋白基因的克隆与序列分析

血清白蛋白融合技术是一种开发长效重组蛋白药物的新技术.为了获得猪血清白蛋白(PSA)基因,根据GenBank(登录号:AY663543)中PSA的基因序列,设计一对引物,采用RT-PCR从新鲜猪肝组织中扩增出PSA基因的全长cDNA,产物纯化后连接至pBS-T载体,转化大肠埃希菌TG1,采用PCR法及酶切鉴定法筛选出阳性菌株后进行测序.序列分析结果表明,成功克隆了PSA基因的1 821 bp全长cDNA,与 GenBank中参照基因序列同源性为99.6%,氨基酸序列同源性为99.5%.本研究数据已提交至GenBank,并申请到一个登录号EF202601.     

草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第二内含子的克隆和测序

采用PCR技术对草地藏系绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因第2内含子进行了扩增,扩增产物经克隆和测序显示,其长度为1 893bp,该基因片段与GenBank中普通绵羊和猪的H-FABP基因第2内含子分别有99%和66.4%的同源性。实验还对22只草地藏系绵羊H-FABP基因第2内含子中174 bp的序列进行了PCR-SSCP分析,结果未检测到多态性。     

山羊催乳素受体基因部分片段的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出济宁青山羊催乳素受体基因长892 bp的片段，该片段含有97 bp的部分外显子8序列（外显子8全长为100 bp）、683 bp的内含子8、70 bp的外显子9及42 bp的部分内含子9。将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。该序列与绵羊、母牛、人、大鼠、小鼠的催乳素受体基因mRNA的对应序列的核苷酸同源性分别为99.4 %、97.01%、89.22%、89.22%、88.02%，氨基酸同源性分别为100%、94.55%、81.88%、81.82%、83.64%。     

山羊Ets-1基因cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank已收录的牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种Ets-1基因序列的同源保守区域,设计特异性引物,采用RT-PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Ets-1基因的cDNA序列。该序列全长2 263 bp(GenBank登录号HQ589338),包括5’UTR 331 bp,CDS 1 326bp和3’UTR 606 bp,编码441个氨基酸组成的蛋白质。核苷酸序列分析发现,山羊编码序列与牛、猪、人、小鼠等的相应序列同源性分别为98%、94%、92%和90%,3’UTR相应序列为96%、83%、81%和77%,5’UTR相应序列为98%、85%、82%和71%。氨基酸序列分析发现,山羊与牛、猪、人和小鼠的Ets-1的相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析发现,其蛋白质分子量为50 340.8 D,等电点为5.08,具有典型的螺旋-转角-螺旋结构域,不存在跨膜结构,并且整个序列不含信号肽。     

猪ICOS基因部分cDNA的克隆与序列分析

研究旨在对猪T细胞诱导型刺激物(ICOS)基因的cDNA序列进行克隆与分析。根据已报道的人ICOS基因cDNA序列设计引物,首次从猪脾脏组织总RNA中扩增出ICOS基因编码区全长cDNA序列,克隆于pMD18-T载体后进行测序并进行序列拼接,运用生物信息学分析DNA序列。结果表明:该基因编码区全长630bp,编码210个氨基酸,包含5个外显子。该序列与人全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为80%和85%;与狗和小鼠的推导氨基酸序列的同源性分别为81%和75%。这为进一步研究该基因的结构特点和功能奠定了良好基础。     

猪Toll样受体5基因cDNA克隆、蛋白质序列分析及其意义

为了解猪Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和进化关系,本研究从肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪Toll样受体5基因的cDNA序列。序列全长2641bp,其中2571bp的开放阅读框编码856个氨基酸残基的猪TLR5,含17.4%的亮氨酸,并有一段19个氨基酸的信号肽序列;同源性分析结果显示,TLR5在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、山羊、绵羊、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为77.5%、79.6%、78.3%、81.0%、69.2%和68.9%。蛋白分子结构预测结果表明,该分子由胞外区(642个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(191个氨基酸)组成,胞外区具有LRR结构域,胞内区具有TIR结构域,表现出典型的TLR家族结构特征。表明猪TLR5分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用,这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。