内蒙古红干椒RAPD反应体系的正交优化

以内蒙古开鲁县12个红干椒品种为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,通过采用正交优化设计方法,对红干椒RAPD反应条件进行了优化.试验结果表明,最佳红干椒RAPD的反应体系(25 μL)为:PCR染料2.0μL,MgCl2 2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.6 mmol·L-1,引物0.5μmlo·L-1,DNA模125 ng,Taq酶1.25 U,超纯水14.9μL;适宜扩增条件为:94℃预变性4 min,40个PCR循环94℃变性1 min,37℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,72℃复延伸5 min,4℃保存.     

内蒙古红干椒RAPD反应体系的正交优化

以内蒙古开鲁县12个红干椒品种为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,通过采用正交优化设计方法,对红干椒RAPD反应条件进行了优化。试验结果表明,最佳红干椒RAPD的反应体系(25μL)为:PCR染料2.0μL,MgCl22.0 mmol·L-1,dNTPs0.6 mmol·L-1,引物0.5μmol·L-1,DNA模板125ng,Taq酶1.25U,超纯水14.9μL;适宜扩增条件为:94℃预变性4min,40个PCR循环94℃变性1min,37℃退火1min,72℃延伸1.5min,72℃复延伸5min,4℃保存。     

河北核桃ISSR反应体系的建立

以3个河北核桃样品为材料,对ISSR反应体系中的主要影响因子DNA模板浓度、引物浓度、DNA聚合酶用量、退火温度进行优化筛选。最后确定河北核桃ISSR-PCR反应体系为20 L体系中含10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2 L,d NTPs(各2.5 m M)1.6 L,DNA聚合酶1.0 U,引物25 M,模板DNA 50 ng。反应的基本程序为:94℃预变性5 min(1个循环),然后94℃变性30 s,52℃退火60 s,72℃链延伸60 s(32个循环),72℃延伸10 min(1个循环),4℃保持。不同引物间适宜的退火温度不同。通过对影响ISSR反应体系的主要因子进行优化筛选,建立了适合河北核桃ISSR分析的反应体系,为进一步开展河北核桃指纹图谱、遗传多样性及品种鉴定等的研究奠定基础。     

枇杷属植物ISSR反应体系的建立和优化

首次通过正交实验,对影响枇杷属植物ISSR反应较大的Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化。优化后的反应体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0mmol·L-1,Taq酶1.5U,引物0.3μmol·L-1,模板DNA60ng,dNTPs0.15mmol·L-1。反应程序为94℃预变性5mim;94℃变性1mim,退火温度70s,72℃延伸1.5mim,40次循环;72℃延伸7mim,4℃保存。     

锥栗自然居群ISSR-PCR分析技术的建立

提取野生锥栗的基因组DNA作为ISSR-PCR模板,对反应体系中的模板用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶用量5个主要影响因素进行梯度试验,并对扩增程序中的退火温度与循环次数进行了探讨,初步确立了适合野生锥栗的ISSR-PCR分析技术体系,即25μL反应体系中,模板DNA40或50ng、Mg2+2.25mmol.L-1、dNTPs0.2mmol.L-1、引物0.2μmol.L-1、TaqDNA聚合酶1.0U;PCR扩增程序为:94℃预变性3min;然后94℃变性45s,(Tm+2～4℃)退火45s,72℃延伸2min,共32个循环;最后72℃充分延伸5min;1.5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。     

刺梨ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以刺梨为试材，对影响ISSR．PCR扩增结果的主要影响因素包括Mg^2＋、TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物、模版DNA的浓度及引物退火温度进行了优化筛选。确立了适合刺梨ISSR．PCR分析的最佳反应体系，即20μL反应体系中各组分浓度分别为：10×buffer 2．0μL，Mgz＋1．875mInoI／L。TaqDNA聚合酶1．0U，dNTPs0．1mmol／L，引物2．0μmol／L，模板DNA20ng。PCR扩增程序：94。c预变性5min，94℃变性1min，48℃退火温度45S，72℃延伸1min，34个循环，72℃后延伸6min。利用优化体系对3个刺梨品种进行体系稳定性检测，结果表明该优化体系的重复性和稳定性良好。     

锦带花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以锦带花幼叶为试材,提取锦带花基因组的DNA,并对其纯度、浓度进行检测,建立适合锦带花的ISSR-RCR反应体系.结果表明:DNA扩增效果良好,完全能满足进一步试验的需要.同时对锦带花ISSR-PCR反应体系中各个影响因素进行优化,建立了适合锦带花ISSR分子标记的最佳反应体系,即在20μL的反应体系中,含稀释浓度为3倍的DNA模板,0.20 mmol/LdNTP,稀释10倍体积高保真PCR缓冲液含(Mg2+)3.0 μL;1.00 μmol/L引物,1.25 U Taq酶.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52.0℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,45个循环;最后72℃延伸5 min,4℃保存.应用该ISSR体系对3份锦带花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

结球甘蓝SSR检测体系的建立及优化

摘，要：以结球甘蓝自交系15R(南宝)和14S（北黑大平头）为试材，建立了甘蓝SSR-PCR反应体系，并从 PCR反应组成、扩增程序等环节对SSR-PCR反应体系进行了优化。即10.00 μL反应体系组成为：1× Buffer(含20.00 mmol·L^-1 MgCl₂)、50.00 μmol·L^-1 dNTPs、0.40 U Taq DNA聚合酶、0.40 μmol·L^-1 SSR引物、1.00 μL DNA(60.00 ng·μL^-1)，加ddH2O至终体积10.00 μL；对基本扩增程序作了改进，适 宜的扩增程序为：94 ℃预变性5 min后进行20个迫降循环，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，每个循环降低0.5 ℃；再进行15个循环，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。对PCR产物的电泳检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染法）。     

栓皮栎ISSR反应体系的建立

以栓皮栎叶片为试材,采用单因素试验设计对栓皮栎ISSR反应条件进行系统优化,建立了栓皮栎ISSR的最佳反应体系和扩增程序。结果表明:PCR反应体系总体积为25μL,其中10×Buffer 2.5μL,30ng模板DNA,1.5UTaq聚合酶,2.5mmol/L Mg2+,0.6μmol/L引物,0.3mmol/L dNTPs;扩增程序:94℃预变性1min;94℃变性30s,51.5~59.0℃退火60s,72℃延伸2min,35个循环;最后72℃延伸5min。在此条件下从100条ISSR引物中筛选出12条多态性好、稳定性高的引物对陕西省天然群体共22个栓皮栎个体的DNA进行扩增,共得到166个位点,其中142个为多态位点,多态位点百分率为85.54%,Nei指数为0.2928,Shannon信息指数为0.4381,表明栓皮栎的遗传多样性处于较高水平。     

辣椒SSR反应体系的优化

本试验研究了辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,同时进行了退火温度梯度和循环次数试验。优化后的反应体系为:总体积20μL,1.5μL模板DNA(25ng/μL)、1U Taq酶、0.375μmol.L-1引物、1.875mmol.L-1Mg2 、0.2mmol.L-1dNTPs、1XPCR buffer。扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性45s,58℃(以SSR005为例)退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后一个循环延伸增加为8min,4℃保存至电泳。     

山楂ISSR分析体系的建立和优化

为在DNA分子水平上对山楂种质资源进行分析奠定基础,对退火温度、循环次数、DNA模板质量、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶的种类和浓度等影响ISSR反应的因素进行研究,建立并优化了山楂的ISSR分析体系。优化的山楂ISSR分析体系为:采用改进的CTAB法或QIAGEN试剂盒法提取总DNA;PCR反应体积为20μL,内含1×PCR反应缓冲液(Promega公司),3.0mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP,0.3μmol/L引物,0.5U Taq DNA聚合酶(天根公司),50ng总DNA;扩增程序为94℃ 3min;94℃ 30s,退火温度1min,72℃ 2min,38个循环,72℃ 7min。筛选出了10个适宜山楂遗传分析的ISSR引物。     

中国樱桃S-RNase基因PCR扩增技术体系的建立

通过对TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、通用引物、模板DNA浓度等反应参数的系统研究,建立了中国樱桃S-RNase基因特异PCR扩增体系。该体系反应的总体积25μL,其中Taq酶1.25U,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,通用引物0.25μmol/L,模板DNA 50 ng。反应程序为:94℃预变性3 min;33个循环的94℃变性1 min,56℃退火45 s,72℃延伸1.5 min;最后72℃延伸10 min。利用优化的扩增体系在中国樱桃的不同品种中获得有效扩增,进一步证明了该体系具有良好的稳定性和重复性。     

安徽乌菜DNA提取与InDel引物筛选

利用改良的SDS法提取了153个品种的安徽乌菜DNA,并进行2次重复,均获得了较理想的DNA产物。通过试验确定了安徽乌菜InDel-PCR的10μL最佳反应体系:1×PCR Buffer 1μL,dNTP 0.2μL,引物1μL,Taq E 0.1μL,DNA 1μL,ddH2O 6.7μL;最佳PCR扩增反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火40 s,72℃延伸40 s,共36个循环,最后72℃延伸10 min,10℃保存。从供试的66对InDel引物中筛选出31对适合安徽乌菜、条带清晰、重复性高、多态性好的引物,为安徽乌菜品种鉴定、遗传多样性分析等奠定了基础。     

硅胶干燥胡杨叶片DNA提取与RAPD反应体系的建立

以塔里木河流域胡杨(Populus euphratica)硅胶干燥叶片为材料,采用改进CTAB法提取胡杨基因组DNA,得到满足RAPD(Random amplif ied polymorphic DNA),随机扩增多态性DNA分析的胡杨基因组DNA。通过单因素优化试验,得到胡杨RAPD分析的最佳反应体系为:40 ng模板DNA,0.8 U rTaqDNA聚合酶,2.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L随机引物,1×buffer缓冲液,ddH2O补足至10μL。扩增反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,38℃复性30 s,72℃延伸120 s,35个循环,最后72℃延伸7 min。     

葡萄目标起始密码子多态性反应体系的优化

SCoT标记是一种新型目的基因分子标记方法,采用L16(45)正交试验和单因素试验2种方法优化了葡萄SCoT-PCR反应体系,结果表明正交试验中关键影响因子为dNTPs浓度,单因素试验中为dNTPs和Mg2+浓度.综合2种方法,优化的葡萄SCoT-PCR反应体系为:Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 ...     

枣树RAPD分析条件的优化研究

试验通过系统的比较研究,建立了枣树RAPD分析的优化反应条件,即25μL反应体系中含有100mmol/LKCl、8mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/LTris—HCl(pH9.0)、Np—40、2.0mmol/LMgCl2、160μmol/LdNTP、15ng引物、30ng模板DNA和1.5UTaqDNA聚合酶。适宜的扩增程序为94℃4min,1个循环;94℃30s、36℃40s、72℃1min,50个循环;72℃8min,1个循环。与不同试验室间获得的RAPD分析最佳反应条件进行比较表明,枣树RAPD分析的最佳反应条件在不同实验室间有很强的一致性,只需对dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的用量进行小幅度调整。     

SRAP分析体系的优化及在枇杷种质资源研究上的应用

以me7(5’-TGAGTCCAAACCGGTCC-3’)和em7(5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’)正反向引物组合对西班牙枇杷品种Javierin进行了SRAP分析体系的优化,结果表明,在25μL反应体系中,5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:dNTPs0.3mmol/L,Mg2+2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,引物0.3μmol/L,模板DNA20ng,优化的扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min30s,5个循环;之后94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min30s,35个循环;最后72℃下延伸10min。并将该优化的体系在来自中国、西班牙、日本、意大利和美国的46份枇杷种质资源上进行了SRAP扩增的初步应用,经琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳均获得了清晰、重复性好的SRAP指纹图谱。     

枇杷AS-PCR反应体系的建立和优化

【目的】建立和优化枇杷AS-PCR反应体系,为开展枇杷S基因快速鉴定奠定基础。【方法】以‘大五星’、‘早钟6号’和‘龙泉5号’为试材,通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化,运用正交设计直观分析法和DPS 7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。【结果】优化后的枇杷AS-PCR反应分析体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1,Taq酶1.5 U,引物0.5μmol·L-1,模板DNA80ng,dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94℃预变性1 min;94℃变性30 s,退火温度30 s,72℃延伸1 min,35次循环;72℃延伸5 min,4℃保存。【结论】建立了基于S基因保守序列设计引物的枇杷AS-PCR反应体系,利用该体系成功确定了‘大五星’的S基因型为S2-S41,其中S41为新分离鉴定的枇杷S-RNase基因,它们在GenBank上的登录号分别为JQ228451和JX217035。     

草莓属植物SCoT分析体系的建立及优化

为利用SCoT技术开展草莓属(Fragaria)植物种质资源遗传多样性及分子系统学研究,以草莓属植物11个野生种和1个栽培品种为试材,采用L25(56)正交试验设计,建立了草莓属植物的最优SCoT-PCR反应体系,即20μL反应体系中,含Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 mmol·L-1、Taq酶0.75 U、引物0.75μmol·L-1、模板DNA 40 ng,并对退火温度进行了优化,对电泳检测方法及草莓属植物DNA提取方法进行了改进。共筛选出22个适于进行草莓属植物SCoT分析的引物。经验证,该反应体系稳定性好、可重复性强、多态性高、扩增效果好,适于草莓属植物的SCoT分析。