小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析

WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。利用cDNA宏阵列(macroarray)和RT-PCR相结合的方法,从小麦全长cDNA文库的WRKY转录因子中筛选出一个应答小麦白粉病菌胁迫的TaWRKY34转录因子,该基因编码464个氨基酸。染色体定位分析表明,该转录因子位于小麦第一同源群染色体的短臂上,并且只在细胞核中表达。其蛋白序列与拟南芥、大麦和葡萄抗病相关WRKY转录因子的亲缘关系较近,与其中的3个WRKY基因具有相似的表达模式。TaWRKY34在Pm16/北京8377抗白粉病近等基因系中,对小麦白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导的表达模式存在差异。TaWRKY34可能与小麦对白粉菌的抗性有关。     

小麦TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定

WRKY是植物特有的转录因子基因, 在植物对外界胁迫响应及生长发育的过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个新的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY44, 获得其全长cDNA, 其中开放阅读框长度为897 bp, 编码298个氨基酸。半定量RT-PCR的结果表明, TaWRKY44在叶片中表达水平较高, 并且受干旱和低温胁迫诱导表达。转基因功能分析结果表明, TaWRKY44的拟南芥超表达株系叶片变小, 叶柄缩短, 并且叶片细胞也明显小于野生型。另外, 转基因系对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性也高于野生型, 说明该基因可能作为一个转录抑制子参与逆境胁迫信号转导过程。     

小麦应答低磷的钙依赖蛋白激酶基因TaCPK1A和TaCPK10的克隆和表达

采用构建富集磷胁迫特异表达基因cDNA差减文库、序列分析和cDNA-AFLP技术,鉴定了2个应答低磷胁迫的钙依赖蛋白激酶(CDPK)基因的表达序列标签。克隆、测序和比对结果表明,上述基因分别为TaCPK1A和TaCPK10。其cDNA长度分别为2 129 bp和1 696 bp,开放阅读框分别为1 599 bp和1 281 bp,分别编码532和426个氨基酸;具有CDPK的典型结构特征。系统进化分析表明,上述基因的核苷酸序列同源性低,分别来自不同的祖先。在对低磷胁迫的响应上,TaCPK1A在磷胁迫1~24 h范围内根系内的表达水平不断增强,叶内表达水平在1 h内明显被诱导,以后保持稳定;TaCPK10在相应磷胁迫时间范围根叶内的表达水平均呈低—高—低变化,在磷胁迫1 h的表达被诱导,以后又逐渐降至胁迫前水平。TaCPK1A和TaCPK10对氮、钾胁迫没有应答响应。结果表明,CDPK在介导小麦低磷胁迫的信号转导中具有重要作用,小麦中存在两种或多种CDPK介导的磷酸化过程参与低磷信号的转导。     

板栗CmWRKY基因的克隆、序列分析与原核表达

为深入研究板栗WRKY转录因子基因在板栗抗病过程中的分子作用机制,根据板栗转录组数据库分析获得EST序列,利用RT-PCR技术,克隆板栗WRKY转录因子cDNA(CmWRKY)序列,分析CmWRKY基因及其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究。结果表明,CmWRKY基因为1 437 bp,编码479个氨基酸,推测蛋白分子质量为52. 128 96 ku,理论等电点为9. 15,具有2个WRKY保守结构域和2个C2H_2锌指结构域,属于WRKY家族的第Ⅰ组,基因登录号为KY312850. 1。CmWRKY核苷酸序列与巴旦木等植物的WRKY基因一致性均在80%以上,与西班牙栓皮栎WRKY基因一致性最高,达到97%。同源建模表明,CmWRKY蛋白三级结构与拟南芥At WRKY1蛋白结构相似,推测其可能与At WRKY1具有相似的调控功能。分子进化分析显示,板栗CmWRKY与西班牙栓皮栎及核桃WRKY蛋白亲缘关系最近。SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,CmWRKY蛋白最佳诱导表达条件为0. 2 mmol/L IPTG在30℃下诱导10 h,蛋白分子质量为56 ku,其主要以可溶性蛋白的形式存在。为板栗CmWRKY基因的生物学功能研究及应用奠定基础。     

黄瓜CsWRKY23基因的生物信息学及表达分析

WRKY转录因子是植物中广泛存在的一种转录因子,参与植物的生物胁迫与非生物胁迫。采用RTPCR克隆黄瓜CsWRKY23基因cDNA序列,对序列进行结构域、基因结构分析,构建系统发育树,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在黄瓜根、叶组织中的表达。结果表明:CsWRKY23的cDNA开放读码框全长1 431bp,含有5个外显子,4个内含子;编码476个氨基酸,含有两个WRKY结构域,编码蛋白的分子量为52.2kDa、等电点为6.43;系统发育分析表明CsWRKY23与拟南芥AtWRKY33同源。qRTPCR结果表明该基因响应低温胁迫,并在根、叶组织中的表达均上调。本研究为进一步鉴定该基因在非生物胁迫的功能奠定了基础。     

利用cDNA-AFLP技术分析小麦应答低磷胁迫的特异表达基因

以磷高效小麦品种石新828为材料,采用cDNA-AFLP技术,鉴定了短期(1~6 h)、中期(12~48 h)和长期(72~144 h)低磷胁迫根系特异上、下调表达基因的表达序列标签(EST)。共有非重复的上调ESTs 142个,下调ESTs 94个。胁迫下的前者分别含短、中和长期23、53和66个;后者分别含短、中和长期17、39和38个。对其功能比对发现,上调ESTs在功能上归属于信号转导、转录调控、代谢、逆境响应、发育、物质运输、脂类代谢和功能未知等类别,下调EST除上述类别外,还含有蛋白质合成和降解等类别。部分转录因子基因(如水稻OsPTF1和拟南芥ZAT10高度同源的转录因子基因)、促分裂原激酶基因MAPK1a、钙依赖蛋白激酶基因CPK1A和蛋白激酶基因(如serine/threonine kinase)、高亲和磷转运蛋白基因(PHT3和PT2)、过氧化物酶基因(如peroxidase 73)和谷胱甘肽-S-转移酶基因(glutathione S-transferase),受到低磷胁迫的特异增强诱导,在改善小麦植株对低磷胁迫的适应能力中可能具有重要作用。研究表明,小麦对低磷胁迫的响应,在分子水平上存在着植株感受低磷胁迫信号和信号转导、进一步在生理生化方面对胁迫信号产生应答等复杂的过程。     

六倍体小麦TaWRKY90的克隆和功能分析

WRKY转录因子家族在长期的进化过程中,由低等到高等植物中发展和扩增。在植物应对干旱,低温和盐害等渗透非生物胁迫的响应中占据重要角色。本研究立足六倍体小麦基因组数据库,筛选获得一条新的WRKY转录因子Traes_3B_41047D5E6(TaWRKY90),进一步克隆该转录因子全长序列,并通过荧光定量分析,构建进化树等相关方法验证了所筛选转录因子在植物对渗透胁迫相应中发挥作用。研究分析表明,所克隆TaWRKY90具有1个WRKY结构域,属于WRKY家族第ⅡC亚族;其在不同时间的PEG-6000、低温、H_2O_2、ABA处理下,在小麦幼苗的根、叶片组织中均表现出不同程度的上调表达,且与MDA、CAT、SOD、POD四种酶的活性表达具有较高的相关性,表明TaWRKY90在小麦抗渗透胁迫的响应过程中发挥重要作用。     

苦荞麦FtWRKY6基因的克隆及其在低磷与激素诱导下根中的表达分析

WRKY转录因子是植物非生物胁迫反应中的重要调节子。荞麦耐贫瘠，磷利用率较高。为了探究WRKY基因在荞麦磷饥饿反应中可能的调节作用，以苦荞麦为材料，采用逆转录PCR方法，从低磷处理的根RNA样品中获得了FtWRKY6基因的编码序列。FtWRKY6 cDNA长1 572 bp,编码524个氨基酸，含有2个典型的WRKY保守结构域，锌指类型为C₂H₂,归属于第Ⅰ类WRKY,与绿茶CsWRKY24在氨基酸水平上的同一性较高(55.5%)。拟南芥原生质体瞬时表达分析表明，FtWRKY6定位于细胞核中；酵母单杂交试验表明，FtWRKY6具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明，在根中FtWRKY6的表达受低磷和3种重要的低磷反应相关激素—吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和细胞分裂素(CTK)显著诱导。上述结果提示，FtWRKY6具有转录因子的基本结构与生化特征，在根中可能通过IAA、GA、CTK信号通路的交互作用介导苦荞麦在低磷条件下的响应过程。     

小麦TaWRKY71a基因克隆、生物信息学及表达分析

WRKY蛋白是主要存在于植物体内一类转录因子家族,在植物的生长发育和逆境应答中发挥重要作用。为了揭示小麦WRKY基因功能,从普通小麦中克隆出Ta WRKY71a基因后进行氨基酸序列分析,并对Ta WRKY71a基因在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明,Ta WRKY71a基因编码一个含有355个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析显示,Ta WRKY71a蛋白含有1个WRKY结构域及1个C2H2锌指结构。预测分析表明,Ta WRKY71a蛋白定位在细胞核;其二级结构包含28.17%的α-螺旋、16.34%的延伸链、4.79%的β-转角和50.70%的无规则卷曲。不同物种间WRKY蛋白的同源性分析比较表明,Ta WRKY71a与粗山羊草WRKY71、水稻WRKY71、高粱WRKY71和拟南芥WRKY40的氨基酸序列之间具有高度的保守性。q RT-PCR分析表明,Ta WRKY71a在叶、根、茎、花和种子中均有不同程度表达,并受ABA、Na Cl和PEG诱导表达,推测该基因可能参与小麦逆境胁迫应答。研究结果为进一步研究Ta WRKY71a的生物学功能奠定了基础。     

小麦TaABC1L的克隆及表达特性分析

通过反向Northern筛查小麦旱选10号幼苗水分胁迫诱导表达的cDNA文库，选择一个在水分胁迫1、6和12 h均上调表达的cDNA克隆作为“种子”序列，利用电子延伸和RT-PCR方法，获得一个开放阅读框为1 434 bp，编码477个氨基酸的cDNA序列。由该序列推测编码的蛋白含有1个典型的ABC1保守域（123~243氨基酸）和1个AARF域（42~369氨基酸），但是没有发现ABC1向线粒体转移的信号肽前体序列（PD017350），因此，将该基因命名为TaABC1L。同源比对结果表明，TaABC1L只与水稻、拟南芥中4个尚未研究功能的基因编码的氨基酸序列高度同源。实时定量RT-PCR结果显示，TaABC1L对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和ABA处理均表现出应答反应，但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异。其中受NaCl胁迫1 h，基因的表达量已达到对照的30倍，之后其表达量迅速回落，但仍高于对照；受ABA诱导时，其表达量略有增加，在12 h的最高表达量也仅为对照的2倍。     

大豆中一个WRKY28-like基因的克隆与功能分析

WRKY转录因子参与调节植物生长发育、生物与非生物胁迫应答等多种过程,AtWRKY28是拟南芥中与抗病和耐逆相关的重要转录因子。为探讨大豆中一个AtWRKY28同源基因GmWRKY28-like(Glyma.14G028900)的生物学功能,本文对该基因进行了克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、组织表达等试验,并对其在ABA、PEG、NaCl胁迫下的表达水平进行了分析。结果显示,GmWRKY28-like基因的编码区(CDS)为1008bp,编码335个氨基酸。GmWRKY28-like蛋白具有保守的WRKY结构域,含有22个丝氨酸(Serine)、1个苏氨酸(Threonine)、2个酪氨酸(Tyrosine),不含跨膜结构与信号肽;进化树分析表明大豆GmWRKY28-like与菜豆(Phaseolus vulgaris)WRKY28的相似性最高;亚细胞定位显示GmWRKY28-like定位在细胞核中。该基因在根、种子中表达量很低,在真叶、花、及茎尖分生组织表达量较高。GmWRKY28-like启动子中含有多种与生物和非生物逆境胁迫应答相关的元件,如MBS、W-box、ABRE、Box-W1等,且表达受到ABA、PEG、NaCl的诱导。此外,过表达GmWRKY28-like显著增强了拟南芥的耐盐性。     

乌拉尔图小麦WRKY转录因子的筛选与分析

WRKY转录因子广泛参与植物抗逆胁迫反应,全面分析挖掘小麦A染色体组供体物种乌拉尔图小麦中的WRKY转录因子,对进一步挖掘分析六倍体小麦WRKY转录因子的分子功能具有重要意义。本研究通过生物信息学分析,在乌拉尔图小麦基因组数据中鉴定得到62条全长WRKY转录因子,其中14条能被准确定位在染色体上,并发现2对WRKY转录因子发生了复制;通过进化树分析,发现62条WRKY转录因子被分为8个小亚族,且小亚族内部的基因结构相对保守。通过荧光定量分析所选基因在非生物胁迫下的表达模式,筛选到2条在不同非生物胁迫下均上调表达的WRKY转录因子,为进一步分析其功能打下基础。     

基于转录组测序数据的青稞WRKY基因家族的生物信息学分析

WRKY是植物中一类重要的转录因子,广泛调控了植物的生长发育和逆境胁迫应答。基于青稞白粉病侵染幼苗的转录组测序数据,本研究鉴定得到41个青稞WRKY转录因子,被划分为3个大组:Ⅰ组(6个)、Ⅱ组(21个)和Ⅲ组(12个)。另外,Hv WRKY40和Hv WRKY41没有分组。青稞WRKY基因进化分析的聚类结果和分组结果一致,进一步支持了我们分组的正确性。包括HvWRKY2、HvWRKY8、HvWRKY13、HvWRKY34和HvWRKY41,以及HvWRKY4、HvWRKY7、HvWRKY20、HvWRKY26和HvWRKY30在内的两组WRKY基因,表现出明显的先升高(36 h和72 h),后降低(168 h)的基因表达趋势。这些WRKY基因很可能参与了调控青稞抗白粉病的分子应答机制。青稞WRKY家族的蛋白相互作用网络中,Hv WRKY3、Hv WRKY8、Hv WRKY9属于网络中的主要中心节点。此外,Hv WRKY3、Hv WRKY8、Hv WRKY9、Hv WRKY30、HvWRKY34、Hv WRKY38、Hv WRKY39彼此之间相互作用,是蛋白互作网络的核心网络。本研究挖掘了青稞的WRKY家族成员,系统分析了家族成员的分组、家族成员的WRKY保守域特点、家族成员之间的进化关系、白粉菌侵染下的基因表达水平和家族成员的蛋白互作网络。本研究可为今后青稞的抗逆研究提供优良的候选WRKY基因。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

红麻非生物逆境胁迫响应基因HCWRKY71表达分析及转化拟南芥

WRKY转录因子在植物响应非生物逆境胁迫过程中具有重要的调控作用。本研究根据红麻转录组unigene序列(CL3883.Contig4),设计引物进行PCR扩增,经sanger测序获得全长为957 bp的HcWRKY71基因cDNA序列。该基因开放读码框为957 bp,编码1个含有318个氨基酸的蛋白,具有1个WRKY功能保守结构域,属于II类WRKY转录因子。在盐胁迫下,HcWRKY71基因表达量随NaCl溶液浓度升高而增加;在干旱胁迫下,HcWRKY71基因表达量随干旱胁迫时间的增加呈现先下降再上升然后再下降的趋势;在重金属镉胁迫下,HcWRKY71基因表达量随CdCl2溶液浓度的增加而降低。表明该基因表达受盐、干旱和重金属镉胁迫的诱导。利用农杆菌介导花序浸染法将该基因转化拟南芥发现,HcWRKY71基因提高了转基因拟南芥幼苗的耐盐性,这为进一步研究HcWRKY71基因的耐逆机制奠定了坚实的基础。     

植物响应低温胁迫转录组测序研究进展

低温胁迫是限制植物生长发育和地理分布最主要的环境因子之一,影响植物细胞膜系统、抗氧化系统、光合作用、次生代谢等诸多方面,对农业生产和发展有严重影响。因此,揭示作物在冷胁迫下的生理及分子机制是十分必要的,这有助于培育耐寒作物品种,从而减少生产损失,扩大作物种植面积,具有重要的生产价值和经济效益。目前,基于RNA-seq技术进行植物低温胁迫分子机制深度解析在拟南芥、水稻、油菜、茶树、小麦、烟草、高粱等重要作物上得到了发展应用。本研究综述了近年来植物在低温胁迫或低温适应过程中的转录组学研究现状,以期为高通量测序技术在植物抗性研究方面提供方法借鉴和理论基础。     

入侵植物加拿大一枝黄花对小麦生理生化及显微结构的影响

本研究以入侵植物加拿大一枝黄花和土著植物一枝黄花为供体材料,并以小麦为受体植物,分析两种供体的浸提培养液对小麦生理生化及其根尖显微结构的影响。结果表明与对照相比,加拿大一枝黄花和对照一枝黄花的浸提培养液中麦苗的生长受到抑制,保护酶SOD、POD和CAT活性增强,根尖结构受破坏,导致麦苗根系活力减弱,对N、P、K的吸收能力下降,并最终使得麦苗鲜干重减少。其中具化感作用潜力的加拿大一枝黄花浸提培养液对小麦生理生化和根尖显微结构的影响程度较一枝黄花大。