玉米ZmCIPK基因的克隆及表达特性

根据玉米(Zea mays L.)CIPK基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了一个ZmCIPK基因。结果表明,ZmCIPK基因cDNA全长1 956 bp,5’-非编码区长62 bp,3’-非编码区长337bp,编码区长1 557 bp,编码518个氨基酸,预测分子量为57.18 kDa,等电点为8.94。氨基酸同源性分析表明,ZmCIPK与高粱的CIPK蛋白质同源性较高。实时定量PCR检测表明,ZmCIPK基因的表达受干旱、盐胁迫和高温诱导,说明玉米ZmCIPK基因可能参与玉米对逆境胁迫的应答。     

玉米ZmCIPK基因的克隆及表达分析

根据玉米CIPK基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了1个ZmCIPK基因。分析结果表明,ZmCIPK基因cDNA全长1 748 bp,5'-非编码区长115 bp,3'-非编码区长508 bp,编码区长1 125 bp,编码374个氨基酸,预测分子量为41.72 Ku,等电点为6.96。氨基酸同源性分析发现,ZmCIPK蛋白与高粱的CIPK蛋白同源性较高。实时定量PCR检测表明,ZmCIPK基因的表达受盐胁迫和低温诱导,说明玉米ZmCIPK基因可能参与玉米对逆境胁迫的应答。     

玉米ZmbZIP基因的克隆及表达模式分析

根据玉米碱性亮氨酸拉链(bZIP)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了一个ZmbZIP基因。研究结果表明:ZmbZIP基因cDNA全长1 300 bp,5′-非编码区长180 bp,3′-非编码区长226 bp,编码区长894 bp,编码297个氨基酸,预测分子量为32.4 KDa,等电点为9.39。氨基酸同源性分析发现,ZmbZIP与谷子的bZIP同源性较高。实时定量PCR检测表明,ZmbZIP基因的表达受脱落酸,干旱和高盐胁迫的诱导,不受低温诱导,说明玉米ZmbZIP基因可能参与玉米对逆境胁迫的应答。     

玉米ZmCIPK6基因的克隆及植物表达载体的构建

根据MaizeDGB数据库中ZmCIPK6基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了1个ZmCIPK6基因。ZmCIPK6基因c DNA全长1 739 bp,5′-非编码区长281 bp,3′-非编码区长111 bp,编码区长1 347 bp,编码448个氨基酸,预测分子量为48.8 KDa,等电点为9.14。氨基酸同源性分析发现,ZmCIPK6与高粱SbCIPK6同源性较高。根据ZmCIPK6的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pMD18-T-ZmCIPK6为模板,PCR扩增ZmCIPK6基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建成该基因的植物表达载体。经PCR检测及测序鉴定,表明成功构建了ZmCIPK6基因的植物表达载体,为进一步遗传转化研究基因的功能奠定基础。     

玉米CIPK3蛋白激酶的克隆及表达分析

利用同源克隆的方法从玉米中获得1个可能编码CIPK的基因ZmCIPK3.ZmCIPK3包括CIPK家族的特征性结构域:N端的蛋白激酶结构域和C端的调节结构域NAF.序列分析表明ZmCIPK3的开放阅读框有1 323个碱基组成,编码440个氨基酸的多肽.表达分析表明ZmCIPK3受各种信号诱导,比如干旱、低温、NaCl和ABA.研究表明Ca2+促进ZmCIPK3的表达,而且Ca2+通道阻断剂(LaCl3)及Ca2+螯合剂(EDTA)能够部分降低这种促进效应.这些结论表明,ZmCIPK3可能属于逆境(或者ABA)胁迫基因,第2信使Ca2+调控其在逆境胁迫下的表达.     

玉米中3个CIPK同源基因在干旱和低温胁迫下的表达分析

应用生物信息学分析,筛选获得了玉米中的3个CIPK基因同源序列(登录号分别为AY104819,EU974290和EU968441),它们编码的氨基酸序列都具有CIPK家族典型的功能结构域,推测属于CIPK家族成员.根据同源性,分别将它们暂命名为ZmCIPK1、ZmCIPK17和ZmCIPK18.RT-PCR分析结果表明...     

烟草NtCIPK2基因的克隆及表达分析

CIPK(CBL-interacting protein kinase)是一类具有生物活性的丝/苏氨酸蛋白激酶,通过与类钙调神经素B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)相互作用从而调节植物在适应或抵制非生物逆境胁迫中的生理活动。基于同源序列克隆烟草K326中Nt CIPK2基因c DNA全长,采用q RT-PCR分析Nt CIPK2的组织及逆境胁迫下特异性表达。结果表明,该基因全长1 341 bp,编码446个氨基酸残基,预测分子量为50.3 ku,等电点为8.90。同源性分析结果显示,该蛋白与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)CIPK2有95%的同源性,故命名为Nt CIPK2。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水蛋白,其N端含有活化环结构域S_TKc,C端含有调节结构域CIPK-C,可能定位在质膜。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中茎中表达量最高。逆境胁迫试验表明,该基因受低钾、高盐、干旱、H2O2和ABA诱导,参与烟草非生物逆境胁迫的响应。     

应答非生物胁迫的甘蔗硫氧还蛋白基因ScTRXh2的克隆

从甘蔗蔗茎cDNA文库中获得1个TRXⅠ类第3亚组成员的硫氧还蛋白家族基因全长cDNA序列,命名为ScTRXh2(登录号:KF921298).该基因全长752 bp,开放阅读框长381 bp,5'非翻译区长57 bp,3'非翻译区长314 bp,编码126个氨基酸残基,氨基酸序列与拟南芥TRXs具有高度同源性.实时定量PCR检测显示,该基因在甘蔗中为组成型表达,叶片和蔗茎中的表达量显著高于根和芽.在H2O2和PEG逆境胁迫下,甘蔗ScTRXh2基因的应答模式基本相同,呈现初期(3 h)略微下调,早中期(6 h或12 h)表达量明显上调,中后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达.甘蔗ScTRXh2基因对NaCl胁迫的应答较快,虽然也呈现中期(12 h)表达量显著上调,后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达,但表达模式与H2O2和PEG胁迫应答有明显不同,表现在胁迫初期(3 h)基因表达显著下调.上述结果提示,甘蔗ScTRXh2基因积极应答非生物逆境H2O2、PEG和NaCl的胁迫,在应答的基因表达谱模式上存在一些差异.     

应答非生物胁迫的甘蔗硫氧还蛋白基因 ScTRXh2 的克隆

从甘蔗蔗茎cDNA文库中获得1个TRXI类第3亚组成员的硫氧还蛋白家族基因全长cDNA序列,命名为＆TRXh2（登录号：KF921298）．该基因全长752bp,开放阅读框长381bp,5’非翻译区长57bp,3’非翻译区长314bp,编码126个氨基酸残基,氨基酸序列与拟南芥TRXs具有高度同源性．实时定量PCR检测显示。该基因在甘蔗中为组成型表达,叶片和蔗茎中的表达量显著高于根和芽．在H：02和PEG逆境胁迫下,甘蔗＆TRXh2基因的应答模式基本相同,呈现初期（3h）略微下调,早中期（6h或12h）表达量明显上调,中后期（24、48、72h）显著下调并维持基本稳定的低水平表达．甘蔗＆TRXh2基因对NaCl胁迫的应答较快,虽然也呈现中期（12h）表达量显著上调,后期（24、48、72h）显著下调并维持基本稳定的低水平表达,但表达模式与也02和PEG胁迫应答有明显不同,表现在胁迫初期（3h）基因表达显著下调．上述结果提示,甘蔗Sc—TRXh2基因积极应答非生物逆境H2O2、PEG和NaCl的胁迫,在应答的基因表达谱模式上存在一些差异．     

梭梭糖基转移酶基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物糖基转移酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到2个同源的序列,分别命名为HaUGT1和HaUGT2。基因测序结果显示,HaUGT1基因编码区长1 485bp,编码495个氨基酸;HaUGT2基因编码区长1 185bp,编码394个氨基酸。HaUGT1和HaUGT2蛋白具有保守的PSPG基序、UDP-葡萄糖基转移酶结构域,与其他植物中的糖基转移酶蛋白同源性较高。     

甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆与生物信息学分析

[目的]克隆甘蔗MAP激酶家族新基因的全长序列,为了解甘蔗抗逆胁迫机制提供依据.[方法]以新台糖22为材料,提取甘蔗幼叶总RNA并反转录为cDNA;利用已知物种MAP激酶基因核苷酸序列保守区设计引物,采用5′和3′端RACE技术克隆新基因全长,并进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的甘蔗新基因与玉米ZmMAPK4同源性很高,达92.6%,将该基因命名为SoMAPK4(登录号JQ062930),基因全长1499 bp,其中开放阅读框(ORF)为1128 bp,5′非翻译区(UTR)为218 bp,3′非翻译区(UTR)为213 bp.生物信息学分析结果表明,SoMAPK4基因编码一个含376个氨基酸的蛋白质,分子量约43.5 kDa,等电点为5.51,含有11个保守的蛋白激酶亚区和MAP激酶的磷酸化位点TEY基序.[结论]克隆获得甘蔗MAP激酶新基因SoMAPK4,该基因可能参与多种胁迫反应的信号传递,是研究甘蔗非生物胁迫和生物胁迫过程中信号传递的一个关键因素.     

葡萄类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶VvCIPK10的特性与表达

【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶Vv CIPK10,分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式,为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能,探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得Vv CIPK10序列,设计特异引物进行RT-PCR反应,对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析;构建原核表达载体,转化表达菌株后用IPTG进行诱导表达,收集菌体后裂解细胞,制备蛋白上样液,SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,同时对融合蛋白进行可溶性分析;IPTG大量诱导表达融合蛋白,收集菌体后进行超声破碎细胞,用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化MBP-Vv CIPK10融合蛋白,SDS-PAGE电泳进行分析;纯化后的融合蛋白与体外自磷酸化缓冲液进行自磷酸化反应,反应后SDS-PAGE电泳,压磷屏检测体外自磷酸化反应;构建重组瞬时表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10;分离拟南芥原生质体,通过PEG介导的瞬时转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至原生质体;通过基因枪介导的转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至洋葱表皮细胞,培养16 h后用激光共聚焦显微镜进行荧光信号检测;选择生长相对一致且健壮的葡萄植株,于干旱、低温和盐胁迫处理后不同时间取样,同时在田间取葡萄不同组织样品,实时荧光定量PCR检测Vv CIPK10在葡萄不同组织中的表达以及在不同逆境胁迫下的表达模式。【结果】PCR克隆获得葡萄Vv CIPK10全长为1 357 bp,5′端非编码区为30 bp,3′端非编码区为156 bp,开放阅读框为1 171 bp,编码436个氨基酸,理论等电点为8.59,分子量为48.7 k Da。保守结构域预测分析显示该蛋白5′端具有一个激酶结构域,3′末端具有一个PPI结构域和一个NAF结构域。BLSATP分析表明葡萄Vv CIPK10与桃树CIPK(XP_007205151)一致性最高(74%)。重组表达载体p MAL-C5X/Vv CIPK10在大肠杆菌中经诱导表达获得与理论分子量(43 k Da+48.7 k Da)相一致的融合蛋白。MBP-Vv CIPK10融合蛋白经柱纯化后获得单一的蛋白条带,Vv CIPK10的自磷酸化活性依赖于Mn~(2+),不依赖于Mg~(2+)和Ca~(2+),EDTA可以抑制Vv CIPK10的自磷酸化活性。亚细胞定位结果显示,Vv CIPK10定位在细胞核、细胞膜和细胞质。Vv CIPK10在葡萄各个组织中均有表达,主要在葡萄根和叶片中大量表达,葡萄茎、花序、果实和卷须中的表达量较低。在干旱、低温和盐胁迫处理后,Vv CIPK10呈现受诱导表达模式。Vv CIPK10的表达在低温胁迫后6 h达到峰值,干旱和盐胁迫后2 h即达到峰值。【结论】葡萄Vv CIPK10能够响应干旱、低温和盐胁迫,推测Vv CIPK10在葡萄抗非生物逆境胁迫中具有重要作用。     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽S-转移酶基因克隆与分析

通过RT-PCR法和RACE法,分别从奥利亚罗非鱼(Oreochromisco aureus)肝脏获得alpha、rho1、rho2型GST(GSTA、GSTR1、GSTR2)基因cDNA全序列,从尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)肝脏获得GSTR1、GSTR2基因cDNA全序列。结果表明:奥利亚罗非鱼GSTA基因cDNA全序列为933bp,5′非翻译区(5′-UTR)为98bp,3′非翻译区(3′-UTR)为166bp,开放阅读框(ORF)为669bp,编码222个氨基酸。奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR1基因ORF均为681bp、均编码226个氨基酸;奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR2基因ORF均为693bp,均编码230个氨基酸。氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明,罗非鱼GST基因与鱼类GST同源性较高,与哺乳类、鸟类、两栖类GST同源性较低。     

虹鳟Ndufb2基因全长cDNA序列的克隆与分析

从虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的脑组织中提取RNA,经逆转录-聚合酶链反应及cDNA末端快速扩增技术克隆出Ndufb2基因全长cDNA序列(GenBank登录号:FJ534641),并对其序列进行分析.扩增结果表明:Ndufb2基因的cDNA序列全长899bp,其中5′端非翻译区长152bp,3′端非翻译区长441bp,开放阅读框长306bp,编码101个氨基酸;其N端前50个氨基酸为线粒体靶序列.将翻译的虹鳟Ndufb2蛋白序列与大西洋鲑(Salmo salar)的Ndufb2蛋白序列比对发现,其同源性高达98%,且虹鳟Ndufb2蛋白序列与已报道的哺乳动物的Ndufb2蛋白序列同源性均在55%以上.表明Ndufb2基因在进化过程中是高度保守的,推测其在线粒体呼吸链组成中发挥着重要作用.     

大白菜PHK4基因cDNA3′端序列的克隆及分析

采用3′RACEcDNA末端扩增技术,克隆出大白菜PHK4基因3′端cDNA序列。该序列长810bp,其中编码区序列546bp．编码181个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与拟南芥爿HK4基因的同源性分别为90％和96％．说明PHK4基因与AHK4基因编码区的同源性较高,而PHK4基因3′UTR区与AHK4基因3′UTR区的同源性为52％,远低于编码区。     

黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

以黄瓜品种露丰为材料,根据已报道的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的保守氨基酸序列设计简并引物,利用RT-PCR技术获得黄瓜6PGDH的cDNA同源片段,命名为CSPG(登录号为EU815934)。该片段长度为1 207 bp,包含一个936 bp的开放阅读框(编码311个氨基酸)和271 bp的Poly A 3′非翻译区末端,无内含子;该基因编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜的6PGDH基因有75%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对6PGDH基因的转录水平进行分析,结果表明:该基因在叶、根、茎中均有表达,高温胁迫下的表达量高于常温对照,说明6PGDH基因与热胁迫相关。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

奥利亚罗非鱼SOX9基因cDNA全长的克隆及分析

SOX9基因是重要的转录调控因子,与性别分化形成密切相关.以奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了奥利亚罗非鱼卵巢中SOX9基因cDNA的全长序列.序列全长1 582 bp,其中5'端非翻译区长71 bp,3'端非翻译区长75 bp,开放性阅读框长1 437 bp,编码478个氨基酸.其中第98位开始共81个氨基酸为HMG保守盒.将奥利亚罗非鱼SOX9基因与虹鳟等八种动物的氨基酸序列相比较发现,它们同源性达75%左右,表明SOX9基因在进化中较保守.     

盐芥ThNHX1基因的3′RACE

以盐芥为材料,依据拟南芥AtNHX1基因的序列信息设计引物,扩增出盐芥中ThNHX1基因的部分序列,然后使用快速扩增cDNA3′末端(3′RACE)方法,从盐芥中克隆到ThNHX13′cDNA序列。该序列全长680 bp,编码104个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与拟南芥AtNHX1基因的相应序列同源性分别为91%和91.5%,而盐芥ThNHX1基因3′端非翻译区序列与拟南芥相应序列的同源性为68.5%,明显低于编码区。     

奥利亚罗非鱼SOX9基因cDNA全长的克隆及分析

SOX9基因是重要的转录调控因子,与性别分化形成密切相关.以奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了奥利亚罗非鱼卵巢中SOX9基因cDNA的全长序列.序列全长1 582 bp,其中5'端非翻译区长71 bp,3'端非翻译区长75 bp,开放性阅读框长1 437 bp,编码478个氨基酸.其中第98位开始共81个氨基酸为HMG保守盒.将奥利亚罗非鱼SOX9基因与虹鳟等八种动物的氨基酸序列相比较发现,它们同源性达75%左右,表明SOX9基因在进化中较保守.