牛体细胞核移植技术体系的优化

为了提升卵母细胞成熟质量和核移植胚胎的体外发育潜能,在卵母细胞成熟液和胚胎培养液中分别添加不同浓度IGF及胎牛血清FBS,并探讨了二者对牛卵母细胞成熟培养、核移植胚胎发育的影响以及相关性能的变化。结果表明:分别在成熟液中添加40 ng/mL IGF、培养液中添加20%FBS后,成熟率、卵裂率、囊胚率均有显著提高。本研究为今后牛体细胞核移植技术体系的优化和完善打下了坚实的理论基础。     

血管内皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响研究

为了探讨适宜浓度的(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)对猪卵母细胞体外成熟的影响,以提高猪卵母细胞的成熟效果进而促进胚胎的后期发育,以期为进一步改善猪卵母细胞体外成熟体系提供参考。本研究通过在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的VEGF,成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0 ng/mL VEGF对照组、5 ng/mL VEGF试验组Ⅰ、50 ng/mL VEGF试验组Ⅱ、500 ng/mL VEGF试验组Ⅲ的卵母细胞成熟培养后,经孤雌或体外受精和体外培养。结果表明：（1）试验组Ⅰ极显著地提高了猪卵母细胞的成熟率,试验组Ⅱ显著提高了猪卵母细胞的成熟率;（2）成熟的卵母细胞经孤雌激活和体外培养后,试验组Ⅰ极显著提高了孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。试验组Ⅱ显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、极显著的提高了囊胚率;（3）成熟的猪卵母细胞经体外受精和体外培养后,试验组Ⅰ显著地提高了体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率,试验组Ⅱ显著地提高了体外受精的卵裂率、极显著地提高了囊胚率。5 ng/mL或50 ng/mL的VEGF,有利于促进猪卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育。     

组织蛋白酶抑制剂E-64对猪卵母细胞体外发育能力的影响

为探明外源性组织蛋白酶抑制剂(E-64)对猪卵母细胞体外发育能力的影响,通过向成熟液中添加1、5、10μmol/L的外源性组织蛋白酶抑制剂,对猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养46 h,统计第一极体率,随后分别进行体外受精和孤雌激活,统计第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。结果表明,成熟液中加入1μmol/L E-64的第一极体排出率显著高于未添加的对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组。将体外成熟的卵母细胞进行体外受精及孤雌激活,体外受精后胚胎的卵裂率与囊胚率结果均为成熟液中加入1μmol/L E-64的添加组显著高于对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组;孤雌激活后,4组间胚胎的卵裂率差异不显著,囊胚率为10μmol/L E-64的添加组显著低于其他3组。因此1μmol/L E-64能促进猪卵母细胞的核成熟,并能进一步提高其体外受精后的卵裂率和体外培养的囊胚率。     

卵泡液对牛卵母细胞发育潜力的影响

为了确定卵泡液(直径大于10 mm)对卵母细胞成熟的影响,共收集1759枚卵母细胞进行试验。在成熟液中分别添加0%,10%,30%和50%的卵泡液(bFF, bovine follicular fluid ),成熟培养24h后,孤雌激活或者体外受精和胚胎培养;对比10% bFF和10% 胎牛血清（FBS）,以及观察微滴培养对卵母细胞成熟的影响。结果表明,在孤雌激活组中,bFF浓度对卵裂率的影响差异不显著,但胚胎囊胚发育率高于对照组（P<0.05）;在体外受精组中随着bFF浓度增加而卵裂率下降(P<0.01),而且囊胚率也下降(P<0.05)。在10%的bFF组中,孤雌激活囊胚率和体外受精囊胚率分别为47.1% 和38.0%,囊胚扩张率显著高于其它组。从试验得出,添加10% bFF有利于卵母细胞胞质成熟,且不会降低到受精率,而且可以替代FBS;微滴培养不利于卵母细胞成熟。     

体外成熟培养时间对牛卵母细胞孤雌发育的影响

为了探讨牛卵母细胞体外成熟培养时间对孤雌胚胎发育的影响,通过比较18.5、22和25.5 h等3个不同成熟培养时间下孤雌胚的卵裂率和囊胚率,从而确定较为理想的体外成熟培养时间。试验结果发现,体外不同成熟培养时间下卵母细胞的孤雌卵裂率之间并无显著差异,虽然体外培养22 h卵母细胞的孤雌卵裂率稍稍高于体外培养18.5 h和25.5 h卵母细胞的孤雌胚卵裂率,但差异不显著;而不同成熟培养时间下卵母细胞的孤雌囊胚率之间存在着显著的差异,体外成熟培养22 h卵母细胞的孤雌囊胚率显著高于其它两组。该结果证明卵母细胞体外培养时间是影响孤雌胚发育的一个重要因素,体外培养时间过长或过短都会对孤雌胚今后的发育产生不利影响。     

奶牛性控胚胎体外生产的影响因素及控制措施

针对奶牛胚胎体外生产环节,对体外受精和培养等技术进行了研究,旨在建立奶牛性控胚胎体外生产技术体系。结果表明,卵母细胞外周卵丘细胞至少保持3层以上,在成熟基础液中添加10 ng/ml的EGF,利于核质成熟;在精子获能液中添加咖啡因降低精子的存活时间;牛胚胎前3 d用CR1aa+BSA培养,再用SOFaa+5%FBS培养,获得高的囊胚发育率,并且添加50 ng/ml IGF-I后胚胎的发育得到了很大的改善。利用性控精液进行体外受精,受精率有轻微下降,但对生产的胚胎发育质量无明显（P>0.05）影响,胚胎移植后受胎率为40%左右。     

黄牛-奶牛IVF胚胎早期发育影响因素的研究

为了在实验室建立一套黄牛-奶牛IVF胚胎制备体系,为IVF胚胎的研究提供来源方便、制备简单的素材,本实验从黄牛-奶牛IVF胚胎制备过程中卵巢的处理方法、精子的处理方法及受精卵的培养方法等几个方面进行优化。结果表明：温度递增式洗涤卵巢(25℃、30℃、35℃、39℃),对卵母细胞起到一定的缓冲作用,获取A级COC_S的比例和卵母细胞的成熟率较直接用25℃和39℃生理盐水洗涤卵巢高且差异显著,但是卵裂率和囊胚率并没有显著差异;用移液器轻轻吹打精子后,显著提高卵母细胞的受精率和卵裂率;培养方法对黄牛-奶牛IVF胚胎的早期发育有一定的影响。研究结果提示,经过温度递增式的生理盐水梯度洗涤卵巢,以体外成熟的黄牛卵母细胞为受体、以高产奶牛冷冻精子经过移液器轻微反复吹打处理后进行体外受精,受精卵置五孔板中进行IVF胚胎的体外培养,可以获得发育至孵化囊胚的黄牛-奶牛IVF胚胎。     

哺乳动物早期胚胎体外培养各细胞阶段营养需求研究

从哺乳动物早期胚胎体外培养发育阻断机理和早期胚胎的体内环境入手,阐述了胚胎体外培养各细胞阶段胚胎对营养物质的需求,寻求合理的体外培养条件和方法,以便提高体外胚胎早期的囊胚发育率.     

不同因素对牛IVF胚胎体外发育影响的研究

为进一步完善牛胚胎体外发育体系,以体外受精胚胎为研究对象,对精子获能液、胚胎培养液、血清与BSA添加浓度、卵丘细胞共培养等影响体外胚胎发育体系的各个因素进行筛选优化。结果表明,BO获能液比普通获能液能够获得更高的卵裂率;添加葡萄糖、BSA以及不同浓度血清的牛胚胎培养液比未添加组有更好的发育效果,卵裂率、囊胚率分别达到(79.85±0.74)%、(28.69±1.45)%;在此基础上,牛卵丘细胞与牛胚胎共培养可将囊胚率进一步提高至(32.70±1.73)%,并用免疫荧光染色验证其卵丘细胞未发生凋亡。本研究进一步优化了牛胚胎体外发育体系,提高了体外胚胎的囊胚发育率。     

波尔山羊胚胎克隆的研究

以波尔山羊早期胚胎卵裂球作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同发育阶段胚胎的卵裂球对核移植重构胚的融合率的影响,研究Vero细胞对重构胚体外发育的影响,检测重构胚发育成为个体的能力。结果表明:以体内成熟和体外成熟卵母细胞做核移植受体,重组卵的融合率分别为85.7%和88.7%,二者之间差异不显著(P>0.05);以来源于8,16,32细胞阶段的卵裂球做核供体,重组卵的融合率分别为91.6%,86%,89.2%,三者之间差异不显著(P>0.05);融合后的重构胚与Vero细胞单层共培养,卵裂率65.5%和桑椹胚率32.7%均高于单纯TCM199培养的53.1%和10.6%(P<0.05);移植18枚融合后的重构胚于2只受体山羊输卵管,结果未获得妊娠;移植经体内培养得到的3枚桑椹胚于受体山羊子宫内,获得妊娠1只,总体的妊娠率为33%(1/3),怀孕的受体羊维持妊娠到期,产下1只母羔,初生重3.45 kg,一周岁时体重达到42.5 kg。通过自然交配产下一对波尔山羊羔。     

不同冻精处理方法和添加咖啡因对牛体外受精的影响

【目的】为了探讨不同冻精处理方法以及添加精子活力激活剂并孵育不同时间获能对体外受精及受精卵发育的影响。【方法】研究对体外受精前的牛冷冻精液分别采用直接离心法、上游法和Percoll法3种方法处理,并对处理后的精液分别用含2.5mM或5.0mM咖啡因的获能液（BO液＋10μg/ml肝素钠）在培养箱内预先孵育10min或30min进行获能,不同处理的精子经体外受精后。【结果】结果表明：（1）3种冻精处理方法（直接离心洗涤法、上游法、Percoll法）对精子处理获能,IVF后受精卵的卵裂率（依次为51.58%、52.83%、53.20%）均无显著差异（P＞0.05）;桑椹胚、囊胚发育率Percoll法处理组（16.66%、10.18%）与上游法处理组（17.85%、16.07%）以及Percoll法处理组与直接离心洗涤法组（8.77%、7.01%）均无统计学差异（P＞0.05）,同时实验结果还表现出上游法处理组比Percoll处理组的桑囊胚率有所提高,且上游法处理组与洗涤法处理组在桑、囊率上出现了显著差异（P＜0.05）。（2）获能液中添加咖啡因组比非添加组(对照组)卵裂率和桑囊胚率有所增加,其中添加5.0mM咖啡因组精子孵育30min的获能效果最佳,卵裂率、桑囊率达到68.59%、28.50%。【结论】以上结果表明上游法处理牛冷冻精液稍优,更有利于以后的受精卵发育;添加咖啡因能提高精子活力,且高浓度的咖啡因维持精子高活力持续时间较长。     

EGF对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液（含FSH）中分别添加10,30,50ng/ml表皮生长因子（EGF）,24h检查成熟率,并进行孤雌激活。结果表明：添加10ng/ml、30ng/ml EGF组牛卵母细胞成熟率较对照组（未添加EGF）无显著差异（79.8% vs 71.5% vs 70.4%,p>0.05）,但EGF添加至50ng/ml时牛卵母细胞第一极体排出率显著提高,达85.4%（P<0.01）;在实验1的基础上,比较培养液中添加10ng/ml、30ng/ml 、50ng/ml EGF对牛孤雌激活胚胎体外发育的影响,结果发现在培养液中添加EGF并不能显著提高牛卵母细胞体外孤雌发育囊胚率（P>0.05）,但可显著提高其囊胚孵化率（P<0.01）。     

牛活体采卵及其在体外受精中的应用

利用超声波活体采卵技术(ovum pick-up, OPU)对奶牛的活体采卵技术进行了研究,探讨活体采卵频率以及用FSH处理后对卵母细胞回收的影响,并对比了活体采卵与屠宰场采卵体外受精后胚胎的发育。结果表明：每周采2次与每周采1次可获卵母细胞数差异显著;用FSH在采卵前3d处理不发情母牛和发情母牛,发现两组平均获卵数差异不显著,且回收率和优质卵母细胞率差异不显著;活体采卵和屠宰场采卵的优质卵母细胞数和囊胚率差异显著。     

EGF和GSH对牛卵母细胞体外受精的影响

研究了牛卵泡卵母细胞体外受精时向成熟液中加入EGF(表皮生长因子),受精液中加入GSH(谷胱甘肽)对受精率和囊胚率的影响。成熟液以M-199为基础液并加入一定浓度的促性腺激素和OCS,作为成熟液的对照组,试验组加入不同浓度的EGF。受精液以改良TALP为基础液并加入一定浓度的BSA、肝素和咖啡因,作为受精液的对照组,试验组加入不同浓度的GSH。早期胚胎培养液为SOFaa。在成熟液中加入10ng/mlEGF和50ng/ml EGF组时,试验组与对照组的受精率分别为76.00%(114/150)、76.71% (112/146)和60.70%(85/140);囊胚率分别为23.68%(27/114)、24.11%(27/112)和17.64%(15/85);在受精液中加入1mMGSH和10 mM GSH组时,试验组与对照组的受精率分别为71.66%(86/120)、63.28%(81/128)和76.00%(114/150);囊胚率分别为34.88%(30/86)、24.69%(20/81)和23.68%(27/114)。结果表明,成熟液中加入EGF对牛卵母细胞的体外成熟和受精后的早期胚胎的发育都有促进作用,在一定范围内增加EGF浓度,不会 提高受精率和囊胚率;受精液中加入一定浓度GSH能够提高受精率和囊胚率,但是在高浓度的GSH时则影响受精率。     

花粉在植物遗传研究中的应用

高等植物的花粉是一种理想的植物遗传转化材料。将花粉作为外源DNA的受体或媒介进行转基因研究,已成为现代植物遗传转化技术中的重要部分。小孢子花粉可以在植物体内自然发育为成熟花粉然后参与受精作用,或者经过小孢子培养进行孤雌生殖从而形成单倍体植抹,还可以在离体培养条件下使未成熟花粉发育成为可育花粉。笔者分别简要介绍了以上3种途径的研究现状、花粉培养方法以及在植物遗传转化中的应用,并通过对各方法优缺点的综合评价,为科研人员和育种工作者进行花发育机制研究、功能基因表达和作物遗传改良提供了一条新的思路。