拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6克隆及功能分析

为了研究拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYS6基因在植物生长发育过程中的作用与功能,从拟南芥中克隆了半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYS6基因,并对该基因进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,蛋白质诱导、表达、纯化及功能研究。结果表明,AtCYS6蛋白等电点为5.85,化学式为C_(1179)H_(1848)N_(322)O_(348)S_6,共含有3 703个原子数,为亲水性蛋白;AtCYS6与十字花科的荠菜、荠蓝的同源性较高,同源性分别为81.1%,80.3%,同水稻、玉米和大豆的同源性较低,同源性分别为55.5%,54.3%,56.6%,且在氨基酸序列中间具有高度保守的Q-V-G(Gln-Val-Gly)序列;同时进化树分析显示AtCYS6与同属于十字花科的荠菜、荠蓝的亲缘性较近,同水稻、玉米、高粱、谷子等禾本科植物的亲缘性较远;亚细胞定位结果显示其定位于细胞质,与预测结果相符合;蛋白质诱导、表达和纯化得到大小约为52 ku的融合蛋白,其中AtCYS6蛋白质的分子量约为26 ku,与预测值相符合;Western Blot分析显示,诱导表达的融合蛋白正确翻译表达,且没有出现结构上的断裂或者降解的情况;蛋白酶活性分析表明,AtCYS6对木瓜蛋白酶具有抑制作用。研究结果可以为下一步在植物体内研究该基因的相关机理作用提供基础。     

拟南芥转录因子MYB54的体外纯化及功能初探

为了对MYB54基因的功能进行初步探究,对MYB54的进化保守性,蛋白质的二、三级结构,空间组织的特异性表达,高温胁迫响应,体外蛋白纯化和Western Blot检测以及转录激活活性进行了研究。结果表明,拟南芥中的MYB54与十字花科中的芥蓝、白菜、亚麻荠等同源性比较接近,分别达到了87%,87%,81%;与禾本科植物高粱、谷子和水稻的同源性较低,分别为54%,57%,47%;与小麦和番茄的同源性为42%。小麦中MYB54与拟南芥中MYB54在保守结构域,亲水性,二、三级结构都十分相似。RT-PCR结果表明,拟南芥中MYB54基因在果荚中表达量最高,暗示MYB54可能在生殖发育过程中发挥了一定的作用,并且拟南芥MYB54和小麦中的MYB54在高温胁迫下的表达量都显著降低,表明该基因在响应热胁迫中也发挥了重要功能。拟南芥中MYB54在18,30,37℃条件下,均可被成功诱导,在37℃条件下诱导纯化的蛋白量最高,Western Blot结果检测MYB54蛋白可以被正确翻译表达。利用酵母GAL4系统对MYB54的转录激活活性进行探究,发现MYB54在不与转录激活结构域结合的情况下,依然可以激活下游报告基因的表达,表明MYB54确实具有转录激活活性。初步对MYB54蛋白进行了结构、组织表达、蛋白诱导纯化、转录活性以及逆境表达分析,为MYB54在拟南芥及小麦生长发育过程中的功能研究提供一定的理论基础。     

亚麻荠油脂相关转录因子CsLEC2基因家族的鉴定及表达分析

对亚麻荠CsLEC2家族进行全基因组鉴定、半定量RT-PCR、qRT-PCR,检测CsLEC2基因的时空表达特性并通过转录组数据预测CsLEC2下游靶基因,以解析CsLEC2调控亚麻荠种子油脂合成和积累等生物学功能。结果表明,在亚麻荠基因组中共鉴定到3个亚麻荠CsLEC2基因（CsLEC2.1、CsLEC2.2和CsLEC2.3）。蛋白理化性质和高级结构分析显示,亚麻荠CsLEC2蛋白具有与拟南芥AtLEC2相似的理化性质,且其二级结构的主体也相似。系统进化分析表明,亚麻荠CsLEC2蛋白与模式植物拟南芥AtLEC2蛋白及拟南芥琴亚种AlLEC2蛋白亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示亚麻荠CsLEC2在未成熟的种子中高表达。转录组数据分析显示下游基因CsWRI1和CsOLE3高表达,推测CsLEC2可能直接上调CsWRI1和CsOLE3的转录表达,参与油脂代谢调控。     

拟南芥未知基因At018融合蛋白原核表达条件的优化及纯化

本课题组在前期的研究中利用Al Cl3胁迫筛选碱茅全长c DNAs酵母表达文库获得到一个与铝毒害相关的未知基因(基因编号为018,用put018表示),该基因与拟南芥中未知基因(基因号为At5g57345,本研究中用At018表示)有较高的同源性。为了获得At018的纯化蛋白,本研究将拟南芥At018基因克隆后构建原核表达载体p GEX-6p-3-At018,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。同时运用传统方法优化诱导条件,以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分析结果表明,30℃下0.1 mmol/L IPTG的条件下诱导3 h后,GST-At018融合蛋白的表达量最大,蛋白分子质量与预测值相符,该蛋白主要以可溶性形式存在;接着利用Glutathione Sepharose4 Fast Flow亲核层析树脂纯化最终获得GST-At018融合蛋白。本研究可为进一步进行At018的功能解析提供基础。     

亚麻糖基转移酶基因LuUGT72E1的克隆与表达分析

以亚麻茎部组织总RNA为模版,通过反转录PCR获得糖基转移酶Lu UGT72E1基因的全长开放读码框序列。序列分析结果表明:开放读码框全长1 476bp,共编码491个氨基酸。通过多氨基酸比对发现,该蛋白与亚麻UGT72N2蛋白亲缘关系最近,相似度达99%,与毛果杨、巨桉、木薯、雷蒙德氏棉及拟南芥UGT72E1蛋白的氨基酸序列相似性在58%~51%。分子进化分析表明,该蛋白与拟南芥UGT72E1~3聚为一类,推测该蛋白参与木质素单体的糖基化修饰过程。基因表达谱结果表明,该基因被BR、Brz诱导下调表达。本研究为亚麻的纤维品质改良提供了候选基因。     

木薯Linamarase基因的克隆、表达及酶学特性分析

亚麻仁苷酶(Linamarase)是存在于木薯、巴豆等作物中的降解生氰葡萄糖苷Linamarin（亚麻仁苷）的酶,在结构上与芥子酶有很大的相似性,对它的研究有利于揭示生氰葡萄糖苷酶和芥子酶之间的关系以及芥子酶的起源问题。通过真核表达的方法,克隆了木薯Linamarase基因,构建酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115,经诱导表达和亲和纯化,获得纯化的Linamarase重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在71 kD左右。该酶最适反应温度在37℃左右,最适pH约为5。以pNPG为底物时,Km为1.70 mmol/L,最大反应速率Vmax为8.36 μmol/(min?mg)。     

玉米干旱诱导表达基因ZmCKS2的克隆与表达分析

在本实验室前期研究的干旱胁迫相关的抑制差减文库(SSH)中,发现一个玉米干旱胁迫诱导表达的EST序列,与拟南芥AtCKS2和AtCKS1基因有较高的同源性。应用生物信息学手段和同源克隆的方法,分离得到该基因,命名为ZmCKS2。序列分析表明该基因开放阅读框区267bp,编码88个氨基酸。ZmCKS2蛋白含有真核生物中高度保守的CKS(cyclin-dependent kinase regulatory subunit)结构域。应用在线分析软件预测该基因上游2kb序列表明,该序列具有启动子的核心序列和增强子序列,同时还具有与干旱等多种逆境胁迫相关的调控序列。应用实时荧光定量PCR分析表明该基因在幼穗中表达量最高,且受干旱和MeJA诱导上调表达,受低温和外源ABA诱导下调表达。     

牡丹DNA甲基结合域蛋白基因PsMBD5的克隆和表达特性分析

前期通过转录组结合表达谱分析发现一类MBD片段在低温解除牡丹花芽内休眠中的差异表达,为了进一步研究MBD基因特征及其在牡丹休眠解除中的作用,利用RACE扩增获得1204bpPsMBD5全长cDNA,其中编码框1056bp,推测编码351个氨基酸。生物信息学分析结果显示,PsMBD5蛋白分子量约为38.1274kDa,等电点为5.14,不稳定系数为44.27,推测该蛋白为不稳定蛋白。同源性分析表明,牡丹PsMBD5与梅PmMBD5的同源性最高,为38.1%,与亚麻荠CsMBD5的同源性最低,为25.8%,与13种拟南芥MBD蛋白同源性最高的是AtMBD5。实时荧光定量PCR分析表明,PsMBD5基因在牡丹不同组织中均有表达,在初花期牡丹的根中转录水平最高,在花瓣、心皮和萼片中次之,在雄蕊中最低;PsMBD5基因在牡丹花芽中受低温诱导,且转录水平在低温处理14d时达到最大值,之后维持较高的转录水平。研究结果为进一步解析PsMBD5基因对牡丹花芽的休眠解除的调控机制奠定基础。     

小麦籽粒胚乳基因sbe2b cDNA的克隆与原核表达条件的优化

本研究采用RT-PCR技术克隆了小麦胚乳基因sbe2b全长cDNA序列。序列分析表明,该序列与已报道的sbe2bcDNA序列(登录号:AY740401)同源性为98%。同时构建了原核生物表达载体pET28(a+)-sbe2b,对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,37℃8h能诱导sbe2b融合蛋白的最大量表达,在0.5mmol/LIPTG浓度下可以成功表达出sbe2b蛋白。为进一步体外研究sbe2b的物理化学性质及催化机理奠定基础。     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的克隆与序列分析

为了研究木薯(Manihot esculenta Crantz)的抗逆境胁迫机制,从水稻低温诱导及抗旱基因OsLTI6A出发,同源克隆了木薯的抗逆基因MeLIT6A,并对其序列和功能进行了分析研究。MeLIT6A的基因组序列全长为273 bp,其中ORF长度为173 bp,内含子长度为99 bp;编码1个含有57个氨基酸残基的蛋白,含有1个与Pmp3超级家族同源性极高的保守区域。该基因推导蛋白MELTI6A与蓖麻的、拟南芥的、水稻的、玉米的低温诱导蛋白基因6A (LTI6A)的推导蛋白的同源性分别为：89.7%。81.0%、74.1%和87.9%。蛋白功能分类预测MELTI6A是1个非酶类的、疏水性较高的、有2个透膜区域的蛋白,可能有转运蛋白和作为受体蛋白的功能,与拟南芥的AtLTI6A的功能相似。