三例同核异质雄性不育小麦mtDNA差异片段的比较分析

为了从分子水平鉴别三例同核异质小麦雄性不育材料,利用RAPD技术,对细胞核来自同一普通小麦(Triticum aestivum),细胞质分别来自粘果山羊草(Aegilops kotschyi)、二角山羊草(Ae.bicornis)和斯卑尔脱小麦变种(T.spelta)的三例同核异质小麦雄性不育系的线粒体DNA(mtDNA)进行差异片段的比较分析。结果表明:(1)三种不育系在mtDNA上呈现明显差异;(2)对三种不育系的mtDNA差异片段进行回收、克隆、测序和比对,结果片段OPY01-1517和OPP02-750均与普通小麦mtDNA具有较高的同源性,同源性分别为99%和98%。这为进一步从分子水平鉴别含有斯卑尔脱小麦和二角山羊草细胞质的小麦材料奠定了基础,也为区别不同细胞质雄性不育系提供了一定依据。     

利用cDNA-RAPD方法筛选与V型小麦细胞质雄性不育育性相关的线粒体转录产物的研究

为了研究V型细胞质雄性不育小麦的不育机理,以V型细胞质雄性不育小麦的一套近等基因系为材料,利用cDNA-RAPD方法对不育系、保持系和杂种F1线粒体RNA进行了比较分析.共用了284个引物,有104个引物在不育系和保持系间存在扩增差异,22个引物在不育系和杂种F1间存在扩增差异,找到了一个在不育系中特异表达的差异片段S238999,Northern杂交证实该片段在不育系、保持系和杂种F1的转录的确有差异,它的转录本丰度随着恢复基因的导入明显降低,表明该片段与V型小麦细胞质雄性不育具有一定的相关性.通过NCBI数据库的同源性比对,发现该片段仅与一个Hordeum vulgare基因组DNA片段有84 bp的同源序列,表明这是一个新的可能与V型小麦细胞质雄性不育相关的序列.     

簇毛麦新型低分子量谷蛋白亚基的分子克隆与序列分析

为发掘低分子量谷蛋白亚基（LMWGS）新的变异类型,通过设计引物和特异PCR扩增,从簇毛麦TA2127基因组DNA中得到14个LMWGS基因,GenBank登录号分别为HQ615147～HQ615160。序列分析表明,所有基因具有完整编码区,长度为831 bp和846 bp,可编码277和282个氨基酸残基,推导的氨基酸序列分析显示,14个基因编码的蛋白序列都缺少一段N端保守区,且N端序列是一种新的类型;在14个LMWGS基因中检测到19个SNPs和1个16 bp 的缺失。系统进化分析表明,簇毛麦LMWGS与ω醇溶蛋白和HMWGS亲缘关系相对较远,与普通小麦 Glu3的低分子谷蛋白基因进化关系相对较近。     

粗山羊草新型硬度等位基因的克隆及分析

小麦籽粒硬度是其最为重要的品质性状之一,现已发现控制小麦籽粒硬度的主效基因是Pina和Pinb。为了丰富籽粒硬度新型等位基因,根据已报道的小麦Pina和Pinb基因的保守序列,设计了2对特异性引物,对粗山羊草（Aegilops tauschii)进行Pina和Pinb基因的PCR扩增、克隆及序列分析。结果表明,本研究共得到2个新型Pina等位基因和3个新型Pinb等位基因,核酸序列长度均为447 bp,编码148个氨基酸残基,具有麦类作物PINA和PINB蛋白所特有的色氨酸结构域：WRWWKWWK和WPTKWWK。与已知的Pina和Pinb基因序列相比较,这些基因含有多个SNP变异位点,丰富了小麦籽粒硬度改良的遗传资源。[JP]     

三种山羊草细胞质对普通小麦F1代穗部性状的效应

为了研究3种山羊草细胞质对普通小麦穗部性状的遗传效应,以普通小麦品系303,706及利用其曰交转育的粘果山羊草(Ae.kotschyif）、瓦维洛夫山羊草(Ae．vavilavii)和牡山羊草(Ae．juvenalis)细胞质雄性不育系为母本、13个普通小麦品系为父本,进行不完全双列杂交,研究了瓦维洛夫山羊草、粘果山羊草、牡山羊草三种细胞质对普通小麦F1代穗部性状的细胞质效应。试验结果表明,与普通小麦细胞质相比,三种山羊草细胞质对普通小麦有效小穗和无效小穗数不产生正向和负向的细胞质效应。     

用叶片和种子DNA对玉米M5P型与YⅡ-1型雄性不育细胞质进行归群

利用GenBank上公布的玉米T、C、S群不育细胞质线粒体DNA特异基因T-urf13、atp6-C、orf355的片段序列设计引物,以玉米自交系B77、U8112和150为核背景的3组同核异质系(N、T、C、S、M_5P型和Y_Ⅱ-1型)叶片总DNA和种子总DNA以及线粒体DNA为模板,经PCR扩增对新型雄性不育胞质M5P型和YⅡ-1型进行归群研究。结果表明：①M_5P型和Y_Ⅱ-1型不育胞质的PCR扩增产物与T群、S群有很大差别,与C群不育胞质的PCR扩增结果相同,M_5P型和Y_Ⅱ-1型不育胞质可归为C群;②设计的胞质鉴定特异引物以从叶片中提取的总DNA和从种子中提取的总DNA为模板扩增,与以线粒体DNA为模板扩增的结果一致,表明只要提取基因组总DNA就可以用于玉米胞质类型的归群;③基于PCR策略用玉米胞质特异引物对胞质进行归群,不受供试材料核背景的影响。     

小麦Wx-A1和Wx-B1亚基的生化与分子标记检测

为了解小麦品种(系)Wx亚基的缺失类型,为品质育种提供依据,利用SDS-PAGE和STS分子标记技术对99份国内外小麦品种(系)Wx-A1和Wx-B1亚基的缺失型进行检测.结果表明,供试小麦品种(系)中Wx-B1亚基缺失的有19份,未检测出Wx-A1亚基缺失材料.STS标记结果中,Wx-7A位点的显性标记引物在野生型中扩增出一条1 172 bp的特异带,即Wx-A1a基因出现;Wx-7A位点的共显性标记引物在野生型中扩增出一条593 bp的特异带,在缺失类型中扩增出一条574 bp的特异带.Wx-4A位点的显性标记引物在野生型中扩增出一条425 bp的特异带,即Wx-B1a亚基出现,而在缺失该亚基的突变材料中没有扩增出该特异带.     

利用多重PCR技术鉴定小麦背景中的1BL·1RS易位和Glu D1d基因

高分子量谷蛋白亚基（HMWGS）对小麦面粉加工品质有促进作用,尤其是GluD1d 基因编码的1Dx5+1Dy10亚基能增加面团的筋度和弹性。小麦背景中的1BL·1RS易位对小麦面粉加工品质有显著的负面影响。因此,在小麦品质育种中如何判定小麦背景中是否含有1BL·1RS易位和HMWGS的GluD1d基因具有重要意义。本研究利用3对分别检测1BL·1RS易位、GluB3和GluD1位点的共显性特异标记,结合SDSPAGE鉴定,对16份已知遗传背景和GluD1x等位基因材料及38株（周麦18×烟农19）F₂群体进行了分析,探索出适合同时鉴定小麦背景中1BL·1RS易位和GluD1d基因的多重PCR技术实验体系,并采用该体系对国内外352份小麦品种（系）进行了鉴定。结果表明,该体系是同时鉴定小麦背景中1BL·1RS易位和GluD1d基因的一种非常有效、简便可行的实验方法,可在标记辅助选择（MAS）育种中应用。     

小麦隐性核不育保持系表达载体的构建及拟南芥遗传转化

利用小麦杂种优势能够创制稳定的雄性不育系。相比于细胞质雄性不育系和光温敏雄性不育系,细胞核雄性不育具有育性稳定、易恢复、不受环境影响等特点。小麦隐性核不育基因 ms1的克隆以及杂交制种技术（hybrid seed production technology,SPT）的开发,为雄性不育的保持和杂种优势利用奠定了基础。本研究将小麦花粉育性恢复基因 Ms1、花粉致死基因 ZmAA1、红色荧光蛋白基因 DsRed2及其特异性启动子和终止子连接到表达载体pGEII上,转化野生型拟南芥,得到6株转基因拟南芥。通过荧光显微镜观察拟南芥种子,发现野生型拟南芥种子表面平滑,不能发出红色荧光;而转基因种子表面呈现颗粒状,能够发出红色荧光。这说明表达载体构建成功,并能够在拟南芥中成功表达。这为创制人工小麦隐性核不育系奠定了理论和材料基础。     

小麦耐冷相关基因TaCTR的克隆及其表达特性分析

低温冷害是小麦生长发育过程中面临的重要非生物逆境因素。为了挖掘小麦耐冷功能基因,本研究采用同源克隆的方法从普通小麦品种小偃22中分离到一个耐冷相关基因TaCTR,该基因序列全长2 192 bp,含有12个外显子、11个内含子,编码区全长为1 407 bp,编码468个氨基酸,分子量约为53.43 kDa;系统进化树分析表明,该基因在进化关系上与山羊草最近;亚细胞定位结果显示,该基因编码的蛋白为膜蛋白;实时荧光定量PCR（RT-PCR）结果表明,TaCTR在不同品种、不同组织和不同发育阶段低温特异表达;在干旱、高盐及GA处理下,TaCTR的表达量显著上升,说明该基因可能参与调控小麦的抗逆反应。     

粘类小麦雄性不育系雌雄不育配子传递率研究

为了给粘类小麦雄性不育系的利用提供理论依据,对偏、粘、易、二角型小麦雄性不育系及其杂种F1雌雄不育配子的传递进行了研究.结果表明,雌雄不育配子传递率均低于50%,粘、易、偏型不育系F2代供试群体全部可育,并且正反交不育配子通过雄配子的传递率都为0,初步认为符合配子体不育的特点;二角型不育系正反交雌雄不育配子传递率也都低于50%,但不育雄配子传递率要高于雌配子传递率,并且正反交都有不育株出现.所以二角型不育系是配子体不育还是孢子体不育尚有待进一步研究.     

粘类小麦CMS育性基因分布区研究

为更有效地选育小麦不育系的高恢复系,以8个粘类小麦细胞质雄性不育系（Cytoplasmic malesterility,CMS）为测验种,对310份来自国内外不同地区的普通小麦品种及亲本材料对粘类小麦CMS系的育性恢保关系进行调查,并采用聚类分析法研究了粘类小麦CMS育性基因的地区分布。结果表明：（1）高恢复能力的品种在中国春麦区和南方冬麦区的分布比例均超过50%,具有保持性的品种在加拿大分布最多,我国北方冬麦区次之,春麦区分布最少。（2）不同地区品种恢复度存在差异。（3）将48个普通品种聚为3类：第1类品种对粘类CMS的平均恢复度均低于20%,属全不育和高不育类型;第2类品种的平均恢复度在20%～55%范围内,基本属于半不育类型;第3类品种的平均恢复度均大于55%,属高可育和全可育类型。（4）对不育系进行聚类：90-110核背景下,K型和V型聚为一类,Ven型和B型聚为一类;224核型下V型和B型聚为一类,再和K型聚为一类,与Ven型距离最远;相同细胞质背景下,90-110和224两种核型分别在一定水平上被分为2个类别。     

F型小麦雄性不育系测恢研究及杂种优势分析

小麦F型雄性不育系是具有普通小麦细胞质的新型细胞质雄性不育系。本研究利用364个普通小麦品种(系)与F型雄性不育系FA杂交配制F1,测定其育性恢复性。结果表明,49个小麦品种(系)对F型不育系具有完全恢复性,其F1的自交结实率(国际法)达到甚至超过对照(黄淮冬麦区主栽品种周麦18),这些材料可作为FA的恢复系供进一步研究利用。这一结果说明,小麦F型雄性不育系的育性较易恢复。另外,7个小麦品种(系)对不育系FA不具有恢复力,可用于转育新不育系。从364个组合初选出15个组合,经超标杂种优势分析,7个组合表现更优,具有不同程度的增产潜力,需进一步升级试验、筛选鉴定。     

Development and Application of SCAR Markers for Discriminating Cytoplasmic Male Sterile Lines from Their Cognate Maintainer Lines in Indica Rice

The DNA fragments about 1 600 bp were amplified using random amplified polymorphism DNA (RAPD) primer OPA12 with the templates of mitochondrial DNA of Zhenshan 97A and Zhenshan 97B,and were sequenced.The nucleotide sequences and lengths of the fragments from Zhenshan 97A and Zhenshan 97B showed no difference.The precise length of the fragment was 1 588 bp.Sequence characterized amplification region (SCAR) primers were then developed to discriminate the cytoplasmic male sterile (CMS) lines and their maintainer lines.A specific 1 588 bp fragment could be amplified with SCAR primers,CHI19F2/CHI19R2 and CHI20F3/CHI23R3,in the mitochondrial DNA of Zhenshan 97A,but not Zhenshan 97B.Furthermore,the specific fragment could be also amplified from the total DNA from green leaf tissues of Zhenshan 97A with SCAR primers,but not Zhenshan 97B.With the corresponding primers,the specific fragment could also be amplified from the total DNA of green leaves of other two CMS lines with wild abortive type cytoplasm (CMS-WA),namely Zhenpin A and Tianfeng A,but not in their maintainer lines.Moreover,using total DNA as template,each of the four pairs of SCAR primers could also be used to amplify the 1 588 bp fragment in CMS-ID (Indonesia paddy type) line Ⅱ-32A,but not in II-32B,and the specific fragment was amplified from the DNA of both F1 and F2 seedlings of Shanyou 63.The results of detecting the genetic purity of a man-made mixture of the seeds of Zhenshan 97A using CHI20F3/CHI23R3 were completely consistent with the phenotypes.Taken together,these results indicated that the specific 1 588 bp-fragment amplified by CHI20F3/CHI23R3 was the unique amplification products of CMS mitochondrial DNA,and could be used to distinguish CMS-WA and CMS-ID lines from their corresponding maintainer lines at the seedling stage.     

普通小麦-欧山羊草异附加系对干旱胁迫的生理生化响应

为探究异源染色体对小麦抗旱能力的影响,选取3个普通小麦-欧山羊草异附加系和3个普通小麦为试验材料,以聚乙二醇(PEG6000)模拟干旱胁迫,在苗期测定干旱胁迫下叶片丙二醛(MDA)积累量、可溶性蛋白含量和酶促防御系统(SOD、POD和CAT)活性变化。结果表明,随着干旱胁迫程度的加重和时间的延长,供试基因型所测定的五个生理指标的变化趋势较为一致。MDA含量都不断升高,三个普通小麦-欧山羊草异附加系(Ae9013、Ae9041和Ae9061)的MDA积累幅度较抗旱性最好的小麦对照晋麦47小,积累量也较少。三个异附加系的可溶性蛋白含量受干旱胁迫影响较小,虽有小幅度的下降,但保持着较高的含量。干旱胁迫下,各基因型的SOD、POD和CAT活力增加,在一定时间内,随着干旱胁迫的持续,晋麦47表现出先上升后下降的趋势,而Ae9013、Ae9041和Ae9061的SOD和POD活力随着胁迫程度的加重和时间的延长呈现不断上升趋势;Ae9013、Ae9041的CAT活力在15%PEG6000胁迫下不断增加,在25%PEG6000胁迫下先增加后下降,而Ae9061的CAT活力在高浓度PEG6000胁迫下仍持续增加。由此可见,普通小麦-欧山羊草异附加系具备更有效的酶促防御系统和渗透调节能力,说明U组染色体附加提高了小麦的抗旱能力。     

小麦-近缘物种染色体系的高分子量麦谷蛋白亚基组成及白粉病抗性

为了挖掘小麦近缘物种的高分子量麦谷蛋白新亚基和抗白粉病基因新类型,以小麦品种中国春和Alcedo(来自德国)为对照,对133份小麦-近缘物种染色体系进行了高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)分析和白粉病抗性调查。HMW-GS分析发现,25份材料与对照小麦的HMW-GS类型不同,其中,含外源染色体HMW-GS的有16份;亲本部分HMW-GS发生沉默的有2份;含外源染色体HMW-GS且亲本的部分HMW-GS发生沉默的有7份。在含外源HMW-GS的材料中,73.9%的HMW-GS来自于小麦近缘物种第1同源染色体,17.4%的HMW-GS来自第2、3和5同源染色体。白粉病抗性调查显示,尾状山羊草E#1、两芒山羊草2Mbi#1、沙融山羊草4Ssh#8、高大山羊草6Sl#3和簇毛麦5V#3S染色体上可能含有抗小麦白粉病新基因,值得进一步向小麦转育。本研究发现的新HMW-GS和潜在抗小麦白粉病新基因为利用这些资源进行小麦抗病育种与品质改良打下了坚实的基础。