小麦种子萌发基因TaJAZ1的克隆和功能研究

小麦品种铭贤169是我国黄淮麦区育种研究广泛应用的条锈病诱发材料，但其种子休眠时间过长，不仅影响播种后均匀发芽和生长发育，其收获掉落籽粒也容易导致秋季育种田的生物学混杂。本研究通过筛选其休眠种子与萌发种子的转录组学数据，克隆获得差异表达基因TaJAZ1，并对其生物信息学特性、亚细胞定位、表达模式进行分析，结合解析拟南芥jaz3（与TaJAZ1同源性最高）突变体、TaJAZ1过表达拟南芥和水稻的表型反应。结果表明,TaJAZ1基因编码区全长1 230 bp，可编码409个氨基酸，在不同物种间保守性较强，与野生二粒小麦JAZ1基因的亲缘关系最近；启动子区含有脱落酸响应元件ABRE 和茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif；该基因定位于细胞核和细胞膜，TaJAZ1基因在种子发育中穗发芽时期表达量达到最高，进入成熟时期表达量显著降低；ABA能诱导TaJAZ1基因的表达，ABA处理下过表达拟南芥的萌发率比野生型和jaz3突变体高，ABA信号通路基因AtABI5的诱导量变低；TaJAZ1过表达水稻的萌发率高于受体水稻， ABA处理后，OsABI5的诱导量也降低。以上结果证明，TaJAZ1基因能促进种子萌发，进一步验证其在ABA信号通路中起负调控作用，为改良铭贤169等强休眠性小麦品种提供参考。     

小麦抗逆相关基因 TaGB1的克隆及其表达特性分析

为了解小麦的 TaGB1基因特性、表达情况及其与双子叶植物同源基因的进化关系,以小麦品种济麦22为研究对象,采用同源克隆的方法获得小麦G蛋白β亚基编码区序列, TaGB1编码区全长1 143 bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41 kD,基因组序列中包含6个外显子和5个内含子,分别位于小麦基因组的4A、4B、4D染色体上,不同拷贝的氨基酸同源性高达99.91%。 TaGB1基因结构中包含7个WD40保守域,表达产物位于胞质和质膜上。经系统发育进化关系分析,单子叶植物与双子叶植物的G蛋白β亚基分化形成两大分支; TaGB1在进化关系上与单子叶植物较近,而与拟南芥等双子叶植物较远。 TaGB1在ABA、盐、热和干旱胁迫条件下上调表达,植物的根、茎、叶等部位均有表达,叶片中表达量较高,说明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1的鉴定及其等位变异分析

为解析小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1的生物学功能，本研究通过同源克隆的方法从普通小麦中克隆了小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1(TaNRT1.1-1A、 TaNRT1.1-1B和 TaNRT1.1-1D)。生物信息学分析表明，这三个同源基因编码的蛋白均为疏水蛋白，含有丰富的α-螺旋和无未见则卷曲，主要定位于质膜上。小麦不同组织qRT-PCR分析表明， TaNRT1.1-1A和 TaNRT1.1-1B基因在根中表达量最高，其次是叶和茎， TaNRT1.1-1D基因在茎中表达量最高，其次是叶和根。因此，推测 TaNRT1.1-1A和 TaNRT1.1-1B基因在硝酸盐吸收过程中发挥了重要作用， TaNRT1.1-1D基因在硝酸盐转运过程中发挥了重要作用。通过对小麦 TaNRT1.1基因多态性筛选发现，在 TaNRT1.1-1A基因启动子上游1 120 bp的位置有一个8 bp(TGCATGCA)的插入位点，该位点可能与小麦氮利用效率相关。不同氮利用效率小麦品种qRT-PCR分析结果表明，氮高效小麦品种（基因型为 TaNRT1.1-1A-b）苗期根中 TaNRT1.1-1A基因的相对表达量显著高于氮低效小麦品种（基因型为 TaNRT1.1-1A-a）。     

低温胁迫下漯麦163的生理生化变化及抗寒基因表达分析

为明确拔节期低温对小麦新品种漯麦163的生理生化以及抗寒基因表达特性的影响，以漯麦163及其母本漯麦6010为材料，于拔节期在人工智能低温室进行低温胁迫，分析低温胁迫对两品种叶片叶绿素含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和脯氨酸含量的影响，并对抗寒相关基因（SOD、WCS120、LEA和P5CS）的表达模式进行分析。结果表明，持续低温胁迫下，两个品种的叶绿素含量均显著下降，SOD活性和脯氨酸含量均呈现先升后降的变化趋势。对抗寒相关基因的表达模式进行分析，发现与对照（低温处理0 d）相比,低温胁迫下，SOD和WCS120基因的表达量在两品种中于处理后不同时间点均显著下降；LEA基因的表达量在漯麦6010中于处理后不同时间点显著下降，而在漯麦163中于低温处理1 d后显著提高；P5CS基因的表达量在漯麦163于低温处理3 d后以及在漯麦6010于低温处理2 d和3 d后均显著提高。结合大田观察，发现漯麦163和漯麦6010均具有较强的耐倒春寒能力，可作为抗寒性亲本种质资源。     

荆州黑麦 NPR1同源基因 ScNPR1的克隆与特性分析

为了明确荆州黑麦ScNPR1基因的功能,对荆州黑麦 NPR1同源基因ScNPR1进行克隆并分析了其表达特性。利用同源序列法和RACE技术从荆州黑麦中克隆得到 NPR1同源基因的3 185 bp全长cDNA序列,该基因包含了一个编码507个氨基酸(1 524 bp)的开放阅读框、终止密码子TGA、5′端1 517 bp的非编码区和3′端144 bp的非编码区,命名为ScNPR1。利用生物信息学软件对其结构进行分析,ScNPR1编码的氨基酸序列与已知的小麦、水稻 NPR1基因编码的氨基酸序列具较高的同源性,分别达到92.4%和90.3%。荧光定量PCR发现,ScNPR1基因在小麦不同器官中均有表达,在叶、茎、根中表达较高;ScNPR1基因在植物抗病相关信号分子水杨酸、茉莉酸和乙烯处理后上调表达,在白粉病菌、纹枯病菌和赤霉病菌的诱导下,ScNPR1基因也上调表达。研究结果表明,ScNPR1基因与水杨酸和乙烯信号转导途径有关,参与寄主对病原菌侵染的防御反应。     

小麦CBL基因家族鉴定及表达模式分析

类钙调磷酸酶（CBL）蛋白是植物中独特的Ca²⁺传感蛋白，对植物应对非生物胁迫具有重要作用。为探究小麦CBL基因的功能，利用生物信息学方法从小麦全基因组数据库中共鉴定出68个小麦CBL基因家族成员，并对其进行了理化性质、基因结构、进化树和共线性分析。结果表明，小麦CBL蛋白为酸性亲水性蛋白质，其对应基因分布于18条染色体上，亚细胞定位分布广泛，核中最多；蛋白结构域高度保守，都含有EF hand结构域，且同一类群中的大多数成员具有相似的motif。与水稻进行种间共线性分析发现，二者的CBL基因之间存在较多的共线性关系。以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号和东农冬麦2号为材料，对转录组分析显示出的8个在低温下表达差异显著的CBL进行qRT PCR分析发现，这8个基因在不同小麦品种和不同组织部位都存在明显的差异表达，分蘖节中CBL的表达量在-25 ℃时达到峰值，而叶片中CBL的表达量在-10 ℃时达到峰值，说明CBL基因在低温胁迫调节中起重要作用。     

小麦木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆及赤霉病菌诱导下的表达分析

木瓜类半胱氨酸蛋白酶（PLCPs）作为一类重要的蛋白水解酶，在植物生长发育以及胁迫应答过程中都发挥着重要作用。本研究从抗、感赤霉病小麦品种差异表达基因谱中获得1个注释为RD21 Cysteine proteases的EST（表达序列标签），以此序列检索小麦最新基因组数据库并设计引物，从小麦中克隆到3个基因，分别命名为TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D，属于PLCPs RD21家族。序列分析表明，3个基因的开放阅读框长度分别为1 410、1 428和1 419 bp，分别编码469、475和472个氨基酸。序列比对发现，3个基因的序列相似性为89.3％，所编码蛋白的氨基酸序列相似性为95.6％。系统进化分析表明，TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白的同源性较高，且与乌拉尔图小麦TuRD21A蛋白聚为一类。qRT-PCR分析表明，3个TaRD21基因均受水杨酸(SA)、乙烯利(ETH)以及赤霉病菌诱导表达;感病品种中,TaRD21-2A对SA和赤霉病菌的响应更迅速，且表达量较高；抗病品种中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对ETH的响应更迅速。     

玉米耐旱相关基因dbf1的序列变异分析

玉米dbf1 基因在干旱胁迫下的编码产物与DIP₁蛋白相结合,调控植物激素脱落酸（ABA）响应基因rab17 的表达,从而提高耐旱性。以B73的dbf1 基因组序列为模板,对104个玉米自交系的dbf1 基因进行测序,研究玉米dbf1 基因的序列多态性。多态性分析表明,在全长为2 118 bp的序列中共发现48个SNP和12个InDel。尽管大部分变异位点集中在非编码区,但编码区的1个InDel和3个非同义突变位点的变异可以产生氨基酸序列改变。玉米dbf1 基因的全长序列和编码区序列的变异位点可以分别将该基因划分成33和11种单倍型,并且编码7种蛋白质。在供试材料中,dbf1 基因至少经历了9次重组,中性检测表明,该基因的进化没有偏离中性选择。     

油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦 wrab17基因表达的影响

为了探索油菜素内酯（BR）对低温胁迫下 wrab17基因表达模式的影响,以寒地冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）为试验材料,利用qRT-PCR技术克隆得到 wrab17基因的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该序列的特征,采用qRT-PCR技术检测低温（5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃）胁迫下该基因在冬小麦叶片和分蘖节中的表达情况以及BR对 wrab17基因表达量的影响。结果表明, wrab17基因的编码区序列长度为735 bp,包含500 bp的完整开放阅读框,可编码167个氨基酸,属于稳定蛋白质,该蛋白质无跨膜区和信号肽。qRT-PCR分析表明,低温胁迫下对照组和BR处理组的Dn1叶片和分蘖节中, wrab17基因的相对表达量分别在-10 ℃和-25 ℃时最高,且BR处理组 wrab17基因的相对表达量均高于对照组,推测BR可通过提高 wrab17基因的表达量来增强冬小麦的抗寒能力。     

小麦 TaCSL1基因的克隆及表达模式分析

Clavaminate Synthase-Like（CSL）是生物体内的一种氧化还原酶,可催化氨基酸羟基化。为初步了解小麦CSL基因并探究其相关生物学功能,利用同源克隆的方法,以拟南芥 At3g21360（GenBank Accession：NC_003074.8）基因CDS序列为探针搜索小麦基因组核酸序列数据库,得到小麦A、B、D三个亚基因组上的部分同源基因序列。对上述三条序列的全长与编码区进行克隆和测序,经生物信息学分析,发现这三个基因编码的蛋白属于CSL家族。命名该基因为 TaCSL1,来自A、B、D三个亚基因组的部分同源基因分别命名为 TaCSL1-3A、 TaCSL1-3B、 TaCSL1-3D。实时荧光定量PCR分析表明,这三个部分同源基因在小麦不同生长发育阶段和不同组织部位均有表达,除叶鞘组织外,其相对表达水平在各时期叶片中均高于其他组织。分析该基因在小麦不同生长发育时期叶片的相对表达水平发现,该基因的相对表达量在幼苗期至孕穗期持续提高,抽穗期显著下降,开花后再次提高,生育末期降低。就三个部分同源基因的表达水平而言, TaCSL1-3A相对表达量均较低,而 TaCSL1-3B的相对表达量在孕穗期之前最高, TaCSL1-3D在孕穗期之后最高。本研究明确了 TaCSL1的时空表达特征,可为深入研究小麦氨基酸羟基化过程和植物抗病机理研究提供新思路。     

小麦 TaGF14m基因的克隆及其盐胁迫响应分析

14-3-3蛋白家族在真核生物中广泛存在且高度保守,可结合多种靶蛋白参与植物代谢、发育以及胁迫响应等多种生理过程和信号途径。 TaGF14m基因是14-3-3基因家族成员之一。本研究以中国春为材料,对其进行了克隆和分析,并通过在拟南芥中过表达,分析该基因在盐胁迫下的功能。结果表明, TaGF14m基因含有5个外显子和4个内含子,开放阅读框为789 bp,编码262个氨基酸;小麦幼苗叶片中 TaGF14m基因在盐胁迫下上调表达;与野生型拟南芥相比,过表达 TaGF14m的转基因拟南芥在盐胁迫下生长受到明显抑制,根长也显著变短;SOS途径相关基因表达分析显示, TaGF14m基因可能通过SOS途径负调控盐胁迫耐受性。     

小麦细胞色素P450(TaP450)基因的克隆与序列分析

细胞色素P450是一种多功能氧化酶,在植物体内担当着生物合成、代谢解毒以及抗逆等重要功能。本研究采用RACE方法从普通小麦中同源克隆到一个新的P450基因,命名为TaP450(Genbank No.KJ541960)。该基因基因组序列全长为2 643bp,含有2个外显子和1个内含子,cDNA全长为2 033bp,含有一个1 557bp的开放读码框,推导蛋白含518个氨基酸;序列分析发现其具有保守的P450结构域,但该蛋白与已报道的小麦P450蛋白序列有较大差异,表明它是小麦P450家族的新成员;蛋白结构特征分析发现,该蛋白的分子量为57.092kD,等电点为8.63,N端具有一个含29个氨基酸的跨膜结构和一个含22个氨基酸的信号肽,亚细胞定位分析表明该蛋白属于分泌蛋白。其在小麦叶片、茎、根与种子中均有表达,但在叶片和茎中表达量最高;在胁迫处理下,该基因的表达量均上调,且在盐胁迫处理下上调尤为显著,表明该基因与盐胁迫密切相关。     

小麦TaDHN2基因及其启动子的克隆与功能研究

为给深入研究Ta DHN2基因在小麦抗旱机制中的作用机理奠定基础,并为进一步丰富小麦DHN基因研究内容提供参考,本研究通过筛选石麦15基因组BAC文库和BAC克隆测序方法克隆了Ta DHN2基因及其启动子,并对Ta DHN2基因序列特征、表达模式和启动子功能等进行了分析和探讨。结果表明,Ta DHN2基因含有1个88 bp的内含子,开放读码框长为696 bp,编码1个含有231个氨基酸的脱水素蛋白。Ta DHN2蛋白具有Y-segment、S-segment和K-segment结构域,属于YSK2类型脱水素蛋白。此外,该蛋白含有明显的核定位信号序列S-segment和基序RRKK。Ta DHN2基因受渗透胁迫诱导表达,在根和叶中表达模式类似,叶中表达量显著高于根中。Ta DHN2基因启动子序列长为2 025 bp,预测含有9个脱水响应顺式元件。在转基因拟南芥中,Ta DHN2基因启动子能够启动GUS基因表达,并在渗透胁迫下诱导GUS基因上调表达。以上结果说明,Ta DHN2基因为脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫强诱导启动子。     

小麦LEAsm基因及其启动子的克隆与功能研究

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一个小的高亲水性的蛋白家族,该蛋白家族在逆境胁迫下大量积累,保护植物免受逆境胁迫。LEA蛋白可分为7组,其中重复的11-氨基酸基序是第3组LEA蛋白的特征。为深入分析第3组LEA蛋白在小麦响应逆境胁迫中的作用机制,利用芯片技术从小麦表达谱中筛选出一个渗透胁迫诱导表达的第3组LEA蛋白基因TaLEAsm,然后根据该基因序列设计引物筛选石麦15的BAC文库,获得1个含有该基因的BAC单克隆,以该BAC单克隆质粒为模板,通过BAC延伸测序克隆了TaLEAsm基因及其启动子序列,并对TaLEAsm序列特征、表达模式和启动子功能进行了初步分析。结果表明,TaLEAsm基因序列仅含有1个105bp的内含子,其开放读码框长675bp,编码224个氨基酸。TaLEAsm含有10个11-氨基酸重复序列,属于第3组LEA蛋白。低温、高盐和渗透胁迫均诱导TaLEAsm基因上调表达,但在根和叶中表达模式不同。在TaLEAsm基因起始密码子上游1 500bp序列中,预测含有14个逆境响应顺式元件。在拟南芥中,TaLEAsm基因启动子能够启动GUS基因表达,渗透胁迫诱导GUS基因明显上调表达。以上结果表明,TaLEAsm为小麦脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫诱导启动子。     

小麦逆境胁迫基因TaSKIP的克隆、定位及初步表达分析

非生物逆境是小麦生长、发育及产量形成的主要限制因子之一。为揭示小麦抗逆胁迫响应机制,并为培育转基因抗逆种质奠定基础,本研究利用同源克隆的方法从普通六倍体小麦中国春中克隆出TaSKIP基因并进行序列分析及基因定位,同时对TaSKIP基因在PEG6000胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,共克隆得到3个TaSKIP基因,其中2个基因被定位于6A和6D染色体上。序列分析表明,TaSKIP-6A编码区长为1 827bp,编码608个氨基酸,TaSKIP-B和TaSKIP-6D编码区长均为1 824bp,编码607个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,小麦TaSKIP蛋白与水稻、玉米和大麦等禾本科植物SKIP蛋白的同源性均大于88%,而且含有相同的SKIP/SNW结构域。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRTPCR)检测结果表明,TaSKIP在模拟干旱胁迫条件下表达量上调,暗示该基因在小麦非生物逆境胁迫响应中起重要作用。     

普通小麦TaADF8基因的克隆及表达分析

肌动蛋白解聚合因子(actin-depolymerizing factor,ADF)普遍存在于真核细胞中,为低分子量的肌动蛋白结合蛋白,在调控细胞内肌动蛋白纤维的聚合和解聚中起关键作用。为给深入研究TaADF8基因在小麦中的功能机理奠定基础,并为进一步丰富小麦ADF基因研究内容提供理论参考,本研究利用电子克隆策略从小麦品种CP53中克隆出TaADF8基因(GenBank登录号为KJ864962)后对其进行序列分析,并进一步采用荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术对其在小麦不同组织间的表达差异及不同非生物胁迫下的表达模式进行分析。核酸序列分析表明,该基因全长695bp,拥有完整的ORF,编码142个氨基酸。氨基酸序列分析表明,该蛋白含有保守的ADF同源区和PIP2结合结构域,且在氨基端有核定位信号。进化和聚类分析表明,小麦TaADF8基因与大麦HvADF2基因、HvADF3基因和水稻OsADF3基因亲缘关系较近,蛋白相似度分别为75.35%、93.66%和67.86%。qRT-PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶、颖壳和雄蕊中均表达,且在根、叶和雄蕊中表达量较高;该基因表达受低温的强烈诱导,同时也受水分、高盐和外源脱落酸胁迫诱导。     

小麦CO-like基因TaCO9的克隆及分析

CO蛋白(CONSTANS)是光周期途径中重要的调控因子,为了从普通小麦中进一步挖掘COlike基因,利用同源克隆的方法得到与大麦HvCO9基因同源的小麦TaCO9基因。结果表明,在冬性品种西农889中,初步克隆得到TaCO9基因的三个同源序列,分别命名为TaCO9-1、TaCO9-2、TaCO9-3。其cDNA序列全长均为870bp,开放阅读框为1 977bp,编码289个氨基酸,含有CO-like蛋白家族典型的CCT结构域,但不含B-box结构域;而在春性品种中发现TaCO9-1序列的第二外显子区域有6个碱基的插入,利用中国春缺-四体材料将该序列定位于小麦的1A染色体,命名为TaCO9-1A。系统发育分析表明,TaCO9蛋白与水稻Ghd7及大麦HvCO9位于同一分支。空间结构分析表明,其CCT结构域的NF-YA2区域较为保守,而该区域与CCAAT box互作相关。本研究克隆得到的TaCO9基因可能是小麦CO-like基因家族的新成员,与大麦HvCO9基因的结构相似,可作为新的小麦光周期候选基因加以研究利用。     

白粉菌诱导下小麦TaNHO1基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

非寄主抗性基因 NHO1(non-host resistance 1)编码的甘油激酶(glycerol kinase,GK),是甘油代谢中的限速酶之一,参与植物对多种病害的抵御过程。为进一步探究其响应小麦白粉菌侵染的表达模式,利用RT-PCR方法克隆获得了转录自抗病种质N9134的三个部分同源染色体的小麦 NHO1基因(分别命名为 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B和 TaNHO1-2D),分析三个 TaNHO1同源基因的序列、启动子组成元件和表达模式,并明确了其亚细胞定位。序列分析结果表明,小麦 TaNHO1-2A/2B/2D基因CDS区序列全长分别为1 605、1 599和1 605 bp,分别编码534、532和534个氨基酸残基;3个同源基因均含有与 AtNHO1(AT1G80460.1)基因以及 OsNHO1(Os04G0647800)基因高度相似的FGGY_N端和FGGY_C端结构域。经对启动子区结构分析,该基因启动子区含有大量与植物激素及逆境响应相关的顺式作用元件,意味着 TaNHO1可受到多种植物激素诱导并参与小麦抗病过程。qRT-PCR结果表明,在N9134抗病近等基因系响应白粉菌(Blumeria graminis f. sp.tritici,Bgt)侵染过程中,三个同源基因在不同时间点表达模式不同,其中 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B基因在侵染早期均上调表达,而 TaNHO1-2D则表现出多次波动的表达模式;在N9134感病近等基因系遗传背景下,同源基因的表达水平在病菌侵染后48 h均表现出下调,说明该基因能够响应白粉菌侵染。经亚细胞定位分析,该基因主要作用于细胞质、细胞膜以及核膜。     

小麦 TaFer A1基因抗旱相关分子标记的开发

铁结合蛋白(Ferritin,Fer)参与干旱胁迫应答反应,开发Fer基因抗旱相关的分子标记可为抗旱小麦品种选育提供依据。本研究依据2个强抗旱性和2个弱抗旱性小麦品种1A染色体上铁结合蛋白基因(TaFer-A1)序列的差异,开发TaFer-A1基因抗旱相关的分子标记,用150份萌发期抗旱性不同的小麦品种(系)对标记的有效性进行验证。克隆序列比对发现,TaFer-A1基因在4份抗旱性极端品种间仅存在7个变异位点,包括6个SNP位点和1个3bp碱基Del/Ins位点,其中仅在基因第1个内含子区域的3个连续碱基TCT的Del/Ins位点变异与4份品种抗旱性的表型相对应,而其余6个SNP位点在强与弱抗旱性品种之间随机发生。根据两组抗旱性极端品种间TCT碱基的差异,设计1对引物开发出了分子标记FerA1i-ntr1。该分子标记在2个强抗旱性品种中扩增出了167bp特异性条带,定名为TaFer-A1a等位变异;在2个弱抗旱性品种中扩增出了170bp特异性条带,定名为TaFer-A1b等位变异,表明FerA1i-ntr1为共显性标记。在分子标记FerA1i-ntr1检测的150份小麦品种(系)中,有73份被检测为TaFer-A1a等位变异类型,平均相对发芽率为70.1%;77份被检测为TaFer-A1b等位变异类型,平均相对发芽率为55.1%。TaFer-A1a等位变异类型品种(系)的平均相对发芽率极显著高于TaFer-A1b等位变异类型的(P<0.01),说明该共显性标记FerA1-intr1可用于小麦抗旱性的鉴定和筛选,也表明TaFer-A1基因与小麦抗旱性有关。