七叶树RAPD反应体系的优化

以七叶树新鲜叶片为材料,研究了七叶树RAPD分析过程中的影响因素包括Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合七叶树RAPD反应的PCR体系。即20μl反应体系中含有dNTP 0.25 mmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.8μmol/L,DNA模板50ng。扩增程序为:94℃预变性5min,然后40个循环(94℃变性30 s,33℃退火40 s,72℃延伸60 s),最后72℃延伸10min,4℃保存。     

油茶随机扩增多态DNA条件的研究

以改进的CTAB法提取油茶嫩叶总DNA,进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析,分别测试了Mg2+浓度、引物浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度和TaqDNA聚合酶用量对反应结果的影响,确定了油茶RAPD分析的最适反应体系:在25μlPCR反应体积中,含20ng模板DNA,2 5mmol·L-1MgCl2,0 2mmol·L-1dNTP,0 3μmol·L-1引物,1UTaqDNA聚合酶。扩增程序为:94℃预变性180s;94℃变性60s,37℃退火90s,72℃延伸120s,反应40个循环;最后在72℃延伸5min。     

香樟ISSR-PCR反应体系的正交优化

应用L9(34)正交表建立了适合于樟树ISSR-PCR的优化反应体系,即20μL ISSR反应体系中含有1×PCR buffer、dNTP0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L、Mg2 2.0 mmol/L、Taq酶1 U和模板DNA50 ng.适宜的扩增条件为:94℃预变性4 min;94℃变性40 s,58℃退火1 min,72℃延伸2 min,42个循环;72℃延伸10 min;4℃保存.     

萱草属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以萱草属的3种植物为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的因素Taq酶用量、Mg2 浓度、dNTP用量、引物用量、模板DNA浓度以及退火温度等指标进行单因子筛选和优化,建立了适合萱草属植物ISSR-PCR分析的最佳PCR反应体系:20μL反应体系中Taq酶0.6U、Mg2 1.8 mmol/L、1×Buffer 2 μL、dNTP0.2 mmol/L、引物0.6mmol/L、DNA模板10 ng/μL.扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性40 s,52℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,共39个循环;72℃完全延伸5 min,4℃保持.该反应体系及扩增程序扩增谱带清晰,产物量多,为利用ISSR-PCR分子标记研究萱草属植物的遗传多样性提供标准反应条件.     

亚侧耳RAPD反应体系的优化

经过RAPD优化试验,确定适合亚侧耳PCR扩增体系(总体积25μL)为:10×PCR Buff-er 2.0μL、2.5mM/L dNTPs3.0μL、5U/μL Taq酶0.20μL、5μM/L引物1.5μL、200ng/μl模板DNA 2.0μL、去离子水16.30μL。PCR扩增程序为:94℃预变性3min,94℃变性30s,37℃退火30s,72℃延伸2min,40个循环,72℃延伸10min。     

葡萄SSR反应体系的优化

以葡萄新鲜幼嫩叶片为材料,研究了SSR分析过程中的影响因素,包括Taq酶、Mg2 、dNTP、引物、模板DNA浓度、退火温度等,建立了适合葡萄SSR反应的PCR体系,即20μl反应体系中含有Taq酶1.0 U、Mg2 浓度为1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.5μmol/L,模板DNA20~30 ng。扩增程序为:95℃预变性4 min;95℃变性50 s、50~60℃退火1 min7、2℃延伸1 min 30 s,30个循环;最后72℃延伸7 min。     

松口蘑与栎松口蘑RAPD反应体系的优化

以长白山松口蘑与栎松口蘑为材料,建立了松口蘑与栎松口蘑RAPD反应优化体系。即在20μl反应体积中,模板DNA 10ng,引物0.3μmol.L-1,dNTP 200μmol.L-1,MgCl22mmol.L-1,Taq DNA聚合酶1unit,1×Buffer;反应程序为预变性94℃5min,94℃45s、36.3℃60s、72℃90s共循环45次,最后72℃延伸7min。     

红花石蒜ISSR-PCR反应体系的建立

以红花石蒜叶片基因组DNA为模板,分析了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2 的浓度及Taq DNA聚合酶的用量对ISSR-PCR扩增结果的影响.建立了石蒜ISSR分析最优化的反应体系及应用程序:即25 μL反应体系中,有20 ng模板DNA、0.5 μmol·L-1随机引物、150 μmol·L-1 dNTPs、2.0 mmol·L-1 Mg2 、1.0 U Taq DNA聚合酶.反应程序为:94 ℃预变性5 min;然后45个循环:每个循环94 ℃变性45 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸2 min;循环结束后72 ℃延伸7 min.     

松口蘑SRAP反应体系的优化

以松口蘑为材料,建立了松口蘑SRAP反应的优化体系。即在20μL反应体积中,模板DNA 10ng,引物浓度0．3μmol／L,dNTP 250mmol／L,MgCl 22．5mmol／L,Taq DNA聚合酶0．5U,1×Buffer;反应程序为：94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,共5个循环;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环：72℃延伸5min。     

麻竹RAPD反应条件的优化

以麻竹DNA为模板,对影响麻竹RAPD扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立麻竹RAPD反应的最适体系。最终得出的麻竹RAPD反应体系为:20μL反应体系,2μL10倍反应缓冲液,模板含量为50ng,2 5mmol·L-1的Mg2+,1 5U的Taq酶,dNTP为1 75mmol·L-1,引物浓度为0 4μmol·L-1。优化后的RAPD反应程序为:94℃3min→[94℃1min→37 5℃1min→72℃1min20sec]40个循环→72℃8min→4℃保持。     

粗皮桉 ISSR-PCR 反应体系优化

为建立粗皮桉 ISSR-PCR 优化反应体系,先通过单因素试验确定影响粗皮桉 ISSR-PCR 5个因素(Mg²⁺、dNTP、Taq DNA 聚合酶、DNA 模板、引物)的较适宜浓度范围,在此基础上进一步通过正交试验对5个因素4个水平进行优化,并用 DPS 软件分析试验结果。结果表明粗皮桉 ISSR-PCR 的优反应体系为：在25μL 反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL、MgCl 2.0 mmol·L^-1、dNTPs 0.3 mmol·L^-1、Taq DNA 聚合酶1.25 U、DNA 模板60 ng、引物0.8μmol·L^-1。通过梯度试验确定的扩增程序为：94℃预变性5 min,然后按94℃变性1 min,51℃退火3 min,72℃延伸2 min,进行35个循环,最后72℃延伸5 min,4℃保存。     

濒危植物巴东木莲RAPD扩增反应体系的建立

以巴东木莲叶片为材料,通过对反应体系中Mg2+、dNTP、Taq酶、模板、引物浓度等影响因素的优化,确定了一套适于巴东木莲RAPD分析的稳定反应体系,即25μl的总反应体系中:模板DNA 100 ng,Mg2+2.1 mM,引物0.7μM,dNTP0.20 mM,TaqDNA聚合酶3 U。     

湿加松的SSR反应体系优化

对湿加松SSR反应体系中模板DNA的用量、Mg^2＋浓度、dNTPs及Taq酶的用量、变性温度、退火温度、反应循环次数共7个影响SSR扩增效果的因素,逐一设置单因素多水平进行试验,以目测比较确定谱带条数、亮度、清晰度、背景透明度以及结果的重复性等为判定反应条件适合程度的指标,其反应体系为25uL,扩增程序经优化后确定为：10ng的模板、1×PCR缓冲液、2．5mM的Mg^2＋、0．2mMdNTPs、0．6UTaq酶、正反向引物各0．2uM;最优反应程序为94℃预变性2min之后进入循环,每个循环94℃变性45s,退火45S,72℃延伸45S。退火温度从Tm开始,每隔2个循环降低1℃,直至（Tm-10℃）,维持40个循环。循环结束,72℃延伸5min。     

八角RAPD-PCR反应体系的建立及引物筛选研究

在提取高质量八角基因组DNA的基础上,通过对其RAPD反应体系的Taq DNA聚合酶、dNTPs浓度、Ｍg2+浓度、引物浓度等因子的优化,建立了稳定、重复性高的八角RAPD-PCR反应体系.研究结果表明,在25 μL PCR反应体系中,含1.0 UTaq DNA聚合酶,0.15 mmol·L-1 dNTPs,2.0mmol·L-1 Mg2+,2.0 μmol·L-1引物,20～ 80 ng模板.最佳反应程序为,94℃预变性5 min,扩增后94℃变性30 s,31 ～37℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃完全延伸7 min,4℃保存.在建立RAPD-PCR反应体系的基础上,从240条RAPD引物中筛选出15条扩增条带清晰、稳定性好的引物,并通过各引物的退火温度梯度实验,确定了各引物的最适退火温度.     

漾濞核桃RAPD反应优化体系的建立

以漾濞核桃中的大姚三台核桃为实验材料,通过对影响RAPD扩增结果的主要因子Tag酶、Mg+2、引物、模板DNA、dNTPs等不同的浓度和组合的试验研究,确定了漾濞核桃的最适反应体系和扩增程序,即在25μL反应体系中,0.75 u.L-1Taq DNA聚合酶,3.0 mmol.L-1Mg+2,0.3 mmol.L-1引物,含1.6 mg.L-1模板,2.5 ul 10×Buffer,dNTPs各0.2 mmol.L-1。扩增程序为:94℃预变性300 s,94℃变性40 s,36℃退火60 s,72℃链延伸120 s,45次循环后,72℃延伸600 s。     

云南松SSR—PCR反应体系的优化研究

本项研究以云南松实生苗幼嫩针叶为材料,采用单因素试验设计,分析云南松SSR—PCR扩增反应体系中各组分对扩增结果的影响,并进一步采用正交试验设计对SSR—PCR扩增反应程序进行优化。结果表明,在15μL SSR-PCR反应体系中包括,1×TaqPCRBuffer,模板DNA用量30ng,Taq聚合酶用量1．0U,0．2mmol L-1dNTPs,3．0mmol·L-1Mg2＋以及正、反引物各0．2μmol．L-1;扩增反应程序为,94℃预变性4min;94℃变性30s,退火30s,72℃延伸45s,35个循环;最后72％延伸10min,4℃保存。该反应条件的建立为开展云南松种质资源SSR分子标记研究提供了参考依据。     

赤松外生菌根ITS-PCR体系的建立及优化

以CTAB法提取的赤松外生菌根DNA为模板,应用单因子试验及L16（4^5）正交试验,系统的分析了DNA模板、Mg^2＋、dNTPs、引物和Taq酶对ITS-PCR扩增结果的影响,并建立了赤松外生菌根rDNA ITS扩增反应的优化体系,最优反应体系为：20μL体系中,1×PCR buffer 2μL、DNA模板30 ng、Mg^2＋2.0 mmol/L、dNTPs0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq酶0.5 U。