螺旋毛壳ND35 β-1,3-葡聚糖酶的诱导、性质及其抑菌作用

 以病原菌Rhizoctonia solani的细胞壁为诱导物,模拟毛壳菌自然的重寄生过程,研究了内生真菌螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35 β-1,3-葡聚糖酶的产酶条件、性质,尤其是不同碳源的调控作用。结果表明,不同种类的真菌细胞壁及几丁质和昆布多糖,均可诱导产生β-1,3-葡聚糖酶,而作为分解代谢产物的葡萄糖则抑制产酶。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Phenyl-Sepharose疏水层析,并通过SDS-PAGE鉴定,纯化了一种分子量约为73 kDa的内切β-1,3-葡聚糖酶GLUC73。其最适反应温度为55℃,在40℃以下较稳定;最适pH值为5.5,在pH 5-9范围内均很稳定;酶活性受Hg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺等金属离子不同程度的抑制,Mn²⁺和Co²⁺对酶有激活作用;以昆布多糖为底物时,该酶的米氏常数K_m为0.412 mg·mL^-1,最大反直速度V_max为3.876 U·mL^-1。粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,离体抑菌试验表明,对苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。通过对β-1,3-葡聚糖进行免疫细胞化学标记和超微结构观察,间接证明了β-1,3-葡聚糖酶在螺旋毛壳重寄生过程中的作用。     

生防芽孢杆菌T2胞外蛋白酶的纯化及其抗真菌作用

 从小麦根际土壤中分离到一株高产蛋白酶并对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f sp.vasinfectum)具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2。采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析,从T2发酵液中分离纯化出一种分子量约为29.0kD的蛋白酶。该酶作用的最适温度为65℃,最适pH为8.0,在低于50℃、pH5.0-7.5范围内较稳定。Na⁺、K⁺Pb²⁺、EDTA对酶有激活作用,Ca²⁺、Ba²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Hg²⁺、SDS对酶有部分抑制作用,而PMSF可完全抑制酶活,推测该酶是一种丝氨酸蛋白酶。抗菌活性显示,该酶对棉花枯萎病菌的孢子萌发、菌丝生长有明显抑制作用。     

烟草赤星病菌(Alternaria longipes)角质酶的纯化和特性

 本文对烟草赤星病菌Alternaria longipes产生的角质酶进行了纯化及性质测定。在含有苹果角质(诱导物)的液体培养基中培养A. longipes,第8 d达到产酶高峰。发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE(diethylaminoethyl)Sepharose、Sephacryl S-100 HR和Phenyl-Sepharose 6 fast flow(high sub)进行纯化。通过SDS-PAGE测得蛋白分子量为59.5 kDa。该酶的最适温度为35℃,最适pH为9.0,在温度20℃~40℃及pH 4.0~10.0范围内,酶活较稳定。一些金属离子如Na⁺、Cu²⁺和Mn²⁺可以部分抑制角质酶活性。     

拮抗链霉菌R15β-葡萄糖苷酶的纯化及特性研究

 从山东泰安郊区大白菜植株根际土壤中分离筛选获得一株拮抗链霉菌(Streptomyces spp. )R₁₅菌株。采用固体发酵、粗酶液 (NH₄)₂SO₄分级沉淀、DEAE-52阴离子交换柱层析和Sephadex G75凝胶柱层析等步骤从链霉菌(Streptomyce spp.)R₁₅中分离纯化获得β-葡萄糖苷酶。结果表明, 纯化倍数16.28, 回收率为14.59％, SDS-PAGE电泳测得相对分子量为63.89 kDa。经TLC分析酶解产物, β-葡萄糖苷酶与水杨苷反应生成D-葡萄糖和水杨醇。以水杨苷为底物时, 该酶的Km值为10.644 mmol/L, Vmax为0.525 μmol·L^-1·min^-1。该酶的最适温度为65℃, 70℃以下相对稳定;最适pH为5, pH 3~7之间相对酶活在75％以上。Cu²⁺、Hg²⁺和Fe²⁺对酶有抑制作用, 其中Hg²⁺和Cu²⁺的抑制作用最强, 酶活力完全丧失;而Ca²⁺, Mn²⁺对酶均有激活作用, 相对酶活分别高达137.18%和119.52%。     

一株抗马铃薯坏疽病生防细菌B-401产抑菌物质条件优化及稳定性

以马铃薯坏疽病菌为靶标菌株,采用含药平板法对高寒草地禾草内生细菌B-401产抑菌物质条件及抑菌物质的稳定性进行了研究。结果表明,生防菌株B-401产抑菌物质的最佳培养基配方为牛肉膏8g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖10g、水1000mL,最适温度为23.4℃,最适pH值为7,最佳装液量为35.2mL/150mL三角瓶,最佳培养方式为光照条件下振荡培养24h,最适发酵时间为96h,优化验证试验结果表明,其对马铃薯坏疽病菌的EC₅₀＝0.111μL/mL,是优化前EC₅₀＝3.196μL/mL的3.47%。菌株B-401所产抑菌物质在25~90℃具有较好稳定性,抑菌活性均大于75%,在100℃及以上高温处理后抑菌物质活性降低;对酸碱性和紫外照射稳定,相对活性分别在77.45%和98%以上;对金属离子Na⁺、Mg²⁺和Mn²⁺稳定,相对活性达99%以上,而对Ag⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Fe³⁺较不稳定。     

重寄生真菌盾壳霉胞外蛋白酶产生条件及酶活影响因子

重寄生真菌盾壳霉Coniothyrium minitans是核盘菌Sclerotinia sclerotiorum的重要生防菌。为了探讨盾壳霉胞外蛋白酶在寄生核盘菌过程中的作用,采用明胶平板法对盾壳霉寄生核盘菌菌核产生的蛋白酶活性进行了检测,并进一步采用福林酚法定量测定蛋白酶活性,研究盾壳霉产生胞外蛋白酶的培养条件及影响蛋白酶活性的因子。试验结果表明,在被盾壳霉寄生的核盘菌菌核中检测到蛋白酶活性,表明蛋白酶可能参与盾壳霉重寄生作用。发现核盘菌菌核浸出液培养基适合盾壳霉产生胞外蛋白酶,摇培(20℃、200r/min)5d时蛋白酶活性最高,达到0.22U/mL。盾壳霉胞外蛋白酶酶促反应的最适温度为60℃,最适pH7.0。当温度不高于40℃时,蛋白酶酶活较稳定。5mmol/L的金属离子Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Li⁺和K⁺等对蛋白酶酶活没有显著影响(P>0.05),而Fe²⁺(5mmol/L)显著(P<0.05)提高了蛋白酶活性。盾壳霉蛋白酶对苯甲基磺酰氟(PMSF)敏感,说明盾壳霉产生的胞外蛋白酶可能主要是丝氨酸蛋白酶。这些结果为盾壳霉胞外蛋白酶的分离纯化和功能研究奠定了基础。     

几丁质酶活性与大豆抗疫霉根腐病的关系

测定了大豆不同抗性品种接种大豆疫霉菌后的几丁质酶活性的变化情况。结果表明：未接种的不同大豆品种中的几丁质酶活性无明显区别。大豆疫霉菌侵染后不同抗性的大豆品种的几丁质酶的含量和活性均有不同程度的提高。抗病品种酶活性上升的速度比感病品种快,酶的高活性维持的时间较长。抗病品种在接种后24 h酶活性达到峰值,中感和感病品种在接种后48 h达到峰值。说明大豆疫霉菌可诱导几丁质酶产生,大豆品种的抗病性与几丁质酶的活性呈正相关关系。酶学特性的研究结果表明,酶反应的最适温度为45 ℃,最适pH为5。该酶在45 ℃以下,pH在4~6时酶活性稳定,超过60 ℃,pH超过7时酶活性丧失较快。Mn2+、Zn2+、Ba2+、Fe3+、Ca2+对酶活性有激活作用,Al3+、Ag+、Fe2+、K+、Mg2+、Cu2+、Hg2+对酶活性有抑制作用。     

淡紫拟青霉M-1固体发酵工艺优化及基于自动化种曲机的中试生产

淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus在线虫生物防治上表现出巨大的潜力，但大规模生产技术的不成熟以及产品货架期短限制其工业化生产。为获得淡紫拟青霉M-1固体发酵的最佳条件，并建立其规模化生产工艺，本研究采用单因素和正交试验对淡紫拟青霉M-1固体发酵培养的组成、发酵条件以及烘干条件进行了优化，结果表明淡紫拟青霉M-1固体发酵最佳的培养基组成为麸皮：玉米粉为1：1、蔗糖添加量5%、尿素添加量0.1%、硫酸铵添加量0.1%、料水比1：0.67，固体发酵最佳的培养条件为培养温度28℃、培养时间为7 d、液体接种量为5%、固体接种量为0.5%，固体菌剂最适烘干条件为在35℃烘干24 h，在此条件下淡紫拟青霉M-1固体菌剂的有效活菌数为9.47×10⁹ CFU/g。在此基础上，基于自动化种曲机，建立淡紫拟青霉M-1规模化固体发酵工艺，并通过3个批次规模化生产进行验证，获得将近2 t淡紫拟青霉M-1固体菌剂产品，菌剂有效活菌数能达到15.6×10⁹ CFU/g，杂菌率极低（<0.01%），水分含量为9.68%。由此说明，该工艺可用于淡紫拟青霉M-1工业化生产，且产品质量优异。     

粉红聚端孢菌胞外几丁质酶纯化、特性及抗菌活性

 粉红聚端孢菌(Trichothecium roseum)在SMCS中恒温摇床(200 r/min,28℃)上培养12 d,诱导产生了大量的胞外几丁质酶。培养滤液经(NH₄)₂SO₄分级沉淀、DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析和CM-Sepharose FF阳离子交换柱层析获得了SDS-PAGE纯的胞外几丁质酶,分子量约为39k Da。几丁质酶最适作用温度为40℃,最适pH范围为4.0~7.0。抗菌活性显示,纯酶对供试病原菌都有不同程度的抑菌作用,其中对棉花黄萎菌的抑制作用最强。     

中华根瘤菌L03几丁质酶纯化及其酶学性质研究

中华根瘤菌Sinorhizobium sp.菌株L03是1株能产生几丁质酶的生防细菌.采用90%饱和度硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等方法获得了菌株L03的几丁质酶.SDS-PAGE检测发现该酶已被纯化,其分子量约为41.3kD.该酶反应的最适温度为45℃;最适反应的溶液pH值为6;酶液在pH5～8条件下和40℃下分别保存1h,酶活力基本保持稳定;Mg2+和Ba2+能显著促进几丁质酶活性上升,而Zn2+、Cu2+和Fe3+等对酶活力有明显的抑制作用.功能分析结果显示,该几丁质酶对供试的几种病原真菌细胞壁都有明显的降解作用.     

水稻簇矮病的研究Ⅲ.病毒的体外抗性及其在寄主体内的分布

 以水稻簇矮病株或带毒昆虫的榨出液,注射于Nephotettix cincticeps体内,依其日后对稻苗的侵染力,测得水稻簇矮病毒(RBSV)的致死温度为60~70℃,稀释限点为10^-4~10^-5(病叶榨出液)或10^-3~10^-4(带毒虫榨出液),体外存活期为4~5天(在4℃下)或2~3天(在22℃下)。     

温度和植株叶面湿润时数对大豆灰斑病菌(Cercospora sojina)侵染的影响

 在人工气候箱内,控制接种温度(T)及植株叶面湿润时数(WD),研究了T及WD对大豆灰斑病菌(C.sojina)侵染的综合作用。温度、叶面湿润时数及其互作是病菌侵染的主要因素,病菌侵染温度范围为15~32℃,最适25~28℃,在适宜温度范围内,接种后保湿2小时病菌即可侵入。报导了大豆灰斑病菌侵染概率(IP)与T及WD的关系,组建了侵染概率预测模型。     

阳春砂仁(Amomum villosum lour.)叶枯病菌基本生物学特性研究

 砂仁叶枯病菌生长发育温度是10~38℃,孢子发芽温度为5~38℃,而以20~35℃萌发较好。致死温度54℃ 10分钟。孢子萌发要求RH96%以上的高湿度,饱和湿度最佳。病菌在pH3.1~11.05之间都能生长,在pH5.22~10.13时产孢量较多,孢子萌发率则在pH5.0~8.0时为高。砂仁果浸出液能刺激孢子发芽。病菌存活期在16个月以上。该菌对多种单糖、双糖、多糖都能利用,而氮源则以硝态氮和氨基酸态氮利用较好,氨态氮抑制病菌生长。该菌对碳、氮源的利用还受光照条件的影响。     

芒果疮痂病菌生物学特性研究

 本文主要研究了温度、pH、光照、维生素对芒果疮痂病菌(Sphaceloma mangiferae Bit.&Jenk.)孢子萌发、营养生长及孢子形成的影响,在14种半固体、固体培养基上对产孢量作了比较,还对湿度和营养对孢子萌发的影响做了试验。湿病原菌分生孢子萌发的温度范围为12℃~37℃,最适28℃;pH值范围为3~9,最佳pH 5;以自由水或饱和湿度条件下萌发率最高;连续黑光灯光照促进萌发;1%的葡萄糖液在28℃或33℃下明显增加了萌发率。该菌营养生长的温度范围为4℃~37℃,22℃~33℃生长良好,最适为28℃,与Bitancourt的报道基本相似;pH值范围为2~11,最佳为pH 5;黑光灯连续光照有利生长,VB₂、VB₆及V A对生长均有促进作用,在试验的培养基中PDA是生长最好的。该菌孢子形成的温度范围为12℃~33℃,最适温度为28℃;pH值范围为5~9,最佳为pH 7;光暗12 h交替处理比连续光照更利于产孢;VB₁及VA可促进产孢,但只有VA (50μg/L)既促进生长,又促进产孢;所试验的培养基中以PDA₊牛肉浸膏及PDA的产孢量最多,胡萝卜块是固体培养基中较理想的。     

利用马铃薯全粉加工废水培养解淀粉芽胞杆菌产抗菌脂肽条件优化

为实现马铃薯全粉加工废水资源高值化利用，以马铃薯全粉加工废水为基础培养基，采用Plackett-Burman设计和Box-Behnken响应面设计，对解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens PC2利用马铃薯全粉加工废水发酵产抗菌脂肽的培养基进行优化。结果表明，马铃薯全粉加工废水蛋白质、游离氨基酸、游离淀粉和还原糖含量分别为16.0、2.11、0.18和1.29 mg/mL，钾、钙和镁含量分别为1.07、0.05和0.10 mg/mL，铁、锌、锰和铜含量分别为7.10、2.34、0.25和0.09 μg/mL。蔗糖、谷氨酸钠和硫酸铵是影响菌株PC2发酵抗菌脂肽的3个主要因素。菌株PC2以马铃薯全粉废水为基础培养基无抗菌脂肽产生，采用响应面法优化获得了产抗菌脂肽的最佳培养基配方为：蔗糖30.2 g，谷氨酸钠3.96 g，硫酸铵6.0 g，马铃薯全粉加工废水1000 mL，所得抗菌脂肽粗提物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为21.74 mm。采用单因素试验结合响应面法，获得最适发酵条件为：接种量6.0%，装液量50 mL/250 mL，初始pH 6.8，发酵温度31℃，摇床转速170 r/min，发酵时间35 h。获得的抗菌脂肽粗提物抑菌圈直径可达22.81 mm，较优化前增加了1.08 mm，发酵液活菌数由优化前的2.6×10⁸ CFU/mL提高至3.2×10¹⁰ CFU/mL。试验结果为马铃薯全粉加工废水资源化利用奠定了基础。     

暗黑链霉菌PY-1抑菌活性产物的结构鉴定及其对葡萄霜霉病菌的抑制作用

 从暗黑链霉菌(Streptomyces atratus)PY-1菌株发酵液中分离鉴定抑菌活性产物,评价其对葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的抑制作用,为该菌株及其产生的抑菌活性物质的应用提供依据。PY-1菌株发酵液经二氯甲烷萃取,减压浓缩获得抑菌粗提物,稳定性测定结果显示,避光条件下,15℃~65℃、pH 6~10、4℃或常温保存6个月,抑菌活性稳定。采用硅胶柱层析、Sephadex LH-2柱层析、薄层层析和HPLC等技术,对抑菌粗提物进一步分离纯化,得到2种抑菌活性组分;采用ESI-MS、¹H NMR、¹³C NMR等波谱分析技术,对活性组分进行结构鉴定,2种活性组分分别鉴定为5-乙酸环已基酰亚胺(5-acetoxycycloheximide)和环己酰亚胺(cycloheximide)。采用离体叶片法测定2种组分的抑菌活性,不同浓度(10⁴ ng·mL^-1、10² ng·mL^-1、1 ng·mL^-1)的5-乙酸环已基酰亚胺和环己酰亚胺对葡萄霜霉病菌的抑制作用分别为92.59%、86.30%、64.81%和97.04%、91.85%、84.07%。