敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID_(50)。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I~(-/-)),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I~(-/-)的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID_(50)测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。     

基于CRISPR/Cas9技术的法尼醇X受体缺失株的构建及其对HeLa细胞增殖的影响

试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体（FXR）基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,以PX459质粒为载体,构建真核重组表达质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,再用实时荧光定量PCR检测HeLa细胞FXR基因敲除稳定株中FXR的表达量,并用Western blotting方法鉴定HeLa细胞FXR基因敲除效果。最后用结晶紫染色试验检测FXR基因敲除对HeLa细胞增殖的影响。结果显示,经测序后,3对sgRNA位置与方向均正确插入到PX459质粒载体内,成功构建出重组表达质粒PX459-sgRNA;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,转染后筛选出的细胞中FXR蛋白不表达,表明构建出稳定敲除FXR基因的HeLa细胞株;结晶紫试验结果发现,FXR基因敲除的HeLa细胞染色深度明显低于正常HeLa细胞,FXR基因敲除HeLa细胞孔D_{595 nm}值极显著低于野生型HeLa细胞孔（P<0.01）,说明HeLa细胞FXR基因敲除株的增殖能力较正常HeLa细胞显著降低。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源FXR基因敲除细胞株,且FXR基因敲除对癌细胞增殖具有显著抑制作用,为研究FXR的功能和作用机制提供了细胞模型,并为研究FXR在相关癌症发生发展中的作用奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株及对IFN-β的影响

利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。首先,制备Cas9表达慢病毒,感染RAW264.7细胞,通过Puromycin抗性进行初步筛选,PCR法进行鉴定。其次,设计3条特异性识别TRIF基因的sgRNA(sgTi1、sgTi2、sgTi3),将其转入稳定表达Cas9蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察转入效果,PCR和Western blot法验证基因敲除情况。最后,挑选基因敲除效果最佳细胞株,经TRIF激活剂诱导后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测IFN-β表达水平。结果显示:感染后的RAW264.7-Cas9细胞Cas9基因扩增产物升高,说明成功获得稳定表达Cas9基因的RAW264.7细胞。含目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9细胞后,荧光显微镜下可明显观察到目的基因已成功导入;PCR结果显示,与对照组比较,分别导入sgTi1、sgTi2、sgTi3的3组RAW264.7细胞TRIF表达均受到抑制,Western blot进一步验证3组RAW264.7细胞TRIF蛋白表达均下降且sgTi1组下降最显著,说明TRIF基因敲除成功。经TRIF激活剂诱导,与RAW264.7-Cas9-NC细胞比较,敲除TRIF基因后RAW264.7细胞IFN-βmRNA水平受到明显抑制。结果表明:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。     

ALG5对猪流感病毒复制的影响

在实验室前期利用猪肾细胞(PK-15)CRISPR/Cas9全基因组敲除文库(PK-15-GeCKO)筛选到猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶(ALG5)的前提下,深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA(gRNA)的质粒LentiGuide-puro-ALG5,并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮(NPTr)细胞系,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平,通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID_(50)和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时,检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示:获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系(ΔALG5),ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖,过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后,也可以抑制猪流感毒株F26的复制,无毒株特异性。本研究表明,ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子,为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。     

ALG5对猪流感病毒复制的影响

在实验室前期利用猪肾细胞（PK-15）CRISPR/Cas9全基因组敲除文库（PK-15-GeCKO）筛选到猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶（ALG5）的前提下,深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA（gRNA）的质粒LentiGuide-puro-ALG5,并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮（NPTr）细胞系,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平,通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID₅₀和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时,检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示：获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系（ΔALG5）,ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖,过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后,也可以抑制猪流感毒株F26的复制,无毒株特异性。本研究表明,ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子,为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。     

猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建1株猪TRIM56基因敲除的PAM-KNU细胞系，并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)疫苗毒株中的应用。根据猪TRIM56基因组外显子区域设计合成2对特定的向导RNA引物，将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞，经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养；通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定，最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系，利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID₅₀)以及Western blot检测PRRSV增殖情况。结果显示，TRIM56敲除细胞系构建成功，该敲除细胞系中sTRIM56基因编码区第929～2 120位1 192个碱基缺失，未检测到sTRIM56...     

CRISPR/Cas9系统敲除山羊TLR4基因载体构建及检测

TLR4是天然免疫系统中的一种重要模式识别受体,可选择性地识别病原微生物而启动天然免疫,在宿主天然免疫和获得性免疫中具有重要作用。山羊TLR4基因与多种疾病相关,然而,目前在山羊上关于TLR4基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。采用CRISPR/cas9系统,首先设计TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,构建同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,最后对转化子进行验证,提取质粒并转染山羊成纤维细胞,通过测序进行敲除检测。结果表明:酶切和测序鉴定证明TLR4基因敲除载体构建正确。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续研究TLR4在支原体肺炎感染的免疫应答分子机制提供理论依据。     

宿主细胞erp57基因敲除抑制流感病毒复制的研究

ERp57是细胞内质网内的蛋白二硫键异构酶家族成员,可以催化蛋白二硫键的合成以促进蛋白折叠。为研究erp57基因敲除对流感病毒复制的影响,本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了erp57基因的向导RNA(g RNA)敲除质粒p GEM-erp57g RNA,并将其与p Cas9-EGFP共转染至人肺腺癌细胞A549中,采用流式分选及限制性稀释的方法筛选单细胞克隆株,通过靶基因组测序及western blot检测,筛选获得了erp57基因敲除的A549细胞系。erp57基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。此外,将H1N1亚型流感病毒分别感染野生型和erp57基因敲除细胞系以测定erp57基因敲除对流感病毒复制水平的影响。结果显示流感病毒在erp57基因敲除细胞中的复制显著地受到了抑制,表明ERp57是流感病毒复制过程中的一个关键蛋白。本研究为开发新的抗流感病毒手段提供了相关的实验依据。     

CRISPR/Cas9系统敲除山羊CDK2基因载体构建及转染效率检测

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(CDK2)是细胞通过和进入S期所必须的细胞周期调节激酶,与许多癌细胞的生长有关。然而,目前在山羊上关于CDK2基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。研究采用CRISPR/cas9系统,首先设计CDK2基因的sgRNA片段,在合成CDK2 sgRNA核苷酸序列后,构建能够同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-CDK2 sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对转化子进行验证,最后转染HEK293T细胞,检测细胞荧光和细胞增殖。酶切和测序结果证明,CDK2基因敲除载体构建正确;荧光显微镜检测显示,细胞转染效率在75%以上;细胞增殖检测表明,山羊CDK2敲除质粒不会对人源细胞增殖产生影响。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续获得山羊CDK2基因缺失型细胞系,研究支原体肺炎感染引发的细胞凋亡分子机制提供理论依据。     

干扰素诱导跨膜蛋白3基因敲除Caco2细胞株的构建及其对水泡性口炎病毒复制的影响

通过CRISPR/Cas9系统，旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒，经测序后将正确连接sgRNA的重组质粒及辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装并感染Caco2细胞，然后进行嘌呤霉素加压筛选，利用有限稀释法获取IFITM3基因敲除单克隆细胞。利用DNA测序和Western blot对所获得单细胞克隆进行鉴定，鉴定正确的细胞命名为Caco2-△IFITM3。用表达绿色荧光蛋白的VSV(VSV-EGFP)感染Caco2-△IFITM3细胞，通过荧光显微镜观察IFITM3敲除对VSV复制的影响。基因组DNA测序结果表明，在IFITM3基因开放阅读框产生了碱基缺失，细胞中IFITM3蛋白表达消失，但细胞活性未受明显影响。病毒感染试验可观察到Caco2-△IFITM3细胞感染比例显著高于Caco2细胞，表明敲除IFITM3使其抗病毒功能减弱。本研究通过CRISPR/Ca...     

维生素E和脂肪来源对番鸭胸肌脂肪酸组成及脂质稳定性的影响

本试验旨在研究不同油脂(大豆油和鱼油)来源日粮添加不同水平的维生素E对番鸭生长和屠宰性能以及胸肌脂肪酸组成的影响。选择120只1日龄的雌性番鸭随机分为4个处理组,试验基础日粮维生素E水平为20 mg/kg,其中两个处理组分别添加20 g/kg的鱼油和大豆油,另外两个处理组在油脂日粮的基础上分别添加200 mg/kg维生素E,试验分为两个阶段,1~42 d和43~66 d,测定试验期间番鸭的体重、日增重和料比以及屠宰性能和胸肌脂肪酸组成。结果显示:日粮各处理对番鸭生长和屠宰性能均无显著影响(P> 0.05),同时对胸肌成分及屠宰24 h后pH值无显著影响(P> 0.05)。肌肉储存1和7 d后,高水平维生素E均显著降低了丙二醛含量(P <0.05)。鱼油组较大豆油组显著提高了胸肌二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸比例(P <0.05),同时n-6脂肪酸比例显著降低(P <0.05),n-3脂肪酸比例显著升高(P <0.05),导致n-6/n-3显著降低(P <0.05)。结论:本试验条件下,番鸭与其他家禽品种一样,饲粮中脂肪酸成分的变化对其肌肉脂肪酸组成有显著的影响。此外,日粮添加的维生素E水平超过生理需要水平时可以延长肉的货架期。     

HPLC-DAD法检测桑叶中的1-脱氧野尻霉素

本实验旨在建立检测桑叶中1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)方法。以0.05mol/LHCl为提取溶剂,芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)为衍生剂,在pH8.5的硼酸盐缓冲液中进行衍生化反应,生成具有紫外吸收的1-DNJ-FMOC络合物,采用C18色谱柱,乙腈和水为流动相,最大吸收波长为265nm处对目标物进行检测。结果表明:1-DNJ的色谱图分离效果良好,线性相关系数为0.9997,检出限为0.015mg/mL。样品平均加标回收率为81.3%~92.1%,相对标准偏差(RSDs)为4.7%~6.5%(n=5)。     

玉米秸秆青贮、羊草、燕麦草与精饲料组合效应的研究

本试验旨在利用体外产气法探究混合粗饲料(玉米秸秆青贮+羊草+燕麦草)与精饲料间的最优组合效应。试验采用单因素试验设计进行组合效应筛选,混合粗饲料玉米秸秆青贮∶羊草∶燕麦草为20∶30∶50,与精饲料以100∶0、80∶20、60∶40、50∶50、40∶60、20∶80以及0∶100的比例进行组合,每个组合3个重复。采用体外产气法分析累积产气量和不同组合比例时pH、干物质降解率(DMD)及微生物蛋白(MCP)、氨态氮(NH3-N)、挥发性脂肪酸(VFA)含量变化,计算各组合的单项组合效应指数和多项组合效应指数。结果表明:1)混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对产气量均有显著影响(P<0.05),其中48 h产气量的单项组合效应指数在80∶20组最大。2)混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对pH影响显著(P<0.05),且0∶100组最低。3)混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对DMD影响显著(P<0.05),DMD的单项组合效应指数在20∶80组最大。4)NH3-N含量受混合粗饲料和精饲料的不同组合比例影响显著(P<0.05),以50∶50组NH3-N含量的单项组合效应指数最大。5)混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对M CP含量具有显著影响(P<0.05),MCP含量的单项组合效应指数最高值出现在50∶50组。6)混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对乙酸、丙酸、丁酸含量均有显著影响(P<0.05)。根据多项组合效应指数得出玉米秸秆青贮∶羊草∶燕麦草∶精饲料最优组合比例为10∶15∶25∶50。     

不同蛋白质水平高精料饲粮对荷斯坦奶公牛育肥性能、养分表观消化率及血清生化指标的影响

本试验旨在研究不同蛋白质水平高精料饲粮对荷斯坦奶公牛生长性能、养分表观消化率及血清生化指标的影响。选取体重(197.07±11.11)kg和体况相近的荷斯坦奶公牛90头,随机分为3组,每组30头,各组间平均体重差异不显著(P>0.05)。试验分3个体重阶段(200~300 kg、300~400 kg、400~500 kg)进行。在每个体重阶段,Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组分别饲喂低、中和高蛋白质水平饲粮。在同一体重阶段各组饲粮能量水平相同,精粗比均为90∶10。试验期193 d。结果显示:1)试验各组各体重阶段及全期平均日增重(ADG)、干物质采食量(DMI)、可消化干物质采食量(DDMI)、DDMI/ADG和DMI/ADG均差异不显著(P>0.05)。2)200~300 kg体重阶段,Ⅰ组中性洗涤纤维(NDF)的表观消化率显著高于Ⅲ组(P<0.05);300~400 kg体重阶段,Ⅲ组粗蛋白质(CP)的表观消化率比Ⅰ组提高了4.27%(P<0.05),Ⅰ组的NDF表观消化率比Ⅱ、Ⅲ组分别提高了16.06%和10.42%(P<0.05)。3)200~300kg体重阶段,Ⅲ组CP消化量极显著高于Ⅰ组(P<0.01);300~400kg体重阶段,各组间CP消化量差异极显著(P<0.01),Ⅰ组NDF消化量显著高于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.05);400~500kg体重阶段及全期,各组间CP消化量差异极显著(P<0.01)。4)各体重阶段,血清生长激素(GH)含量随饲粮蛋白质水平的升高有所增加,但各组间差异不显著(P>0.05);200~300 kg体重阶段,Ⅲ组血清甲状腺素(T4)含量显著高于Ⅰ组(P<0.05);300~400 kg体重阶段,Ⅲ组血清葡萄糖(GLU)含量显著高于Ⅰ组(P<0.05),Ⅱ、Ⅲ组血清谷草转氨酶(AST)活性比Ⅰ组分别提高了8.63%和10.98%(P<0.05)。综合分析各项指标得出,在本试验条件下,6~12月龄不同体重阶段奶公牛的饲粮蛋白质水平建议值(干物质基础)如下:200~300kg体重阶段,饲粮蛋白质水平为15.00%;300~400kg体重阶段,饲粮蛋白质水平为15.00%;400~500kg体重阶段,饲粮蛋白质水平为14.00%。     

不同复合微生物制剂对薯渣与大豆秸秆混贮发酵品质、营养成分及瘤胃降解率的影响

本试验旨在研究4种不同复合微生物制剂对薯渣与大豆秸秆混贮发酵效果的影响。试验采用密封塑料桶进行混贮,将薯渣与大豆秸秆按照1∶3的重量比混合,采用单因素试验设计,分别设置对照组(不含微生物制剂)及试验1、2、3和4组(分别添加微生物制剂1、2、3、4),每组3个重复。贮存60 d后取样分析,采用实验室化学分析法测定混贮饲料的发酵品质和营养成分,采用半体内法测定48 h瘤胃降解率,同时进行有氧稳定性测试。结果表明:1)各复合微生物制剂组的感官评定结果无明显差异,均为一级优良。2)经发酵品质的分析测定,各复合微生物制剂组的混贮饲料发酵品质均得到改善,以试验2组的pH最低(P<0.01),乳酸含量最高(P<0.01),氨态氮/总氮最低(P>0.05)。3)除试验4组外,各复合微生物制剂组的干物质损失率(DML)均高于对照组(P>0.05),与对照组相比,各复合微生物制剂组粗蛋白质(CP)含量提高(P>0.05),而可溶性碳水化合物(WSC)含量极显著降低(P<0.01),中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量无显著差异(P>0.05)。4)各复合微生物制剂组的有氧稳定性较对照组均得到提高,其中以试验2组的效果最好(P<0.01),其次是试验1组(P<0.01)、试验3组(P<0.01)和试验4组(P<0.05)。5)各复合微生物制剂组的干物质(DM)48h瘤胃降解率极显著高于对照组(P<0.01),CP瘤胃降解率(P<0.05)、NDF瘤胃降解率(P<0.01)与对照组相比均以试验2组最高,且试验2组的ADF瘤胃降解率显著高于对照(P<0.05),但与其他组差异不显著(P>0.05),各复合微生物制剂组的淀粉瘤胃降解率较对照组均得到提高,试验2组的淀粉瘤胃降解率较对照组提高3.34%(P<0.01)。综上,在本试验条件下,经发酵处理后,薯渣混贮饲料质地松软,呈酸香味,无黏手现象,试验2组对薯渣与大豆秸秆混贮饲料的发酵品质有明显的改善作用,处理效果最好。     

狐和貉源大肠埃希菌药敏试验及耐药基因检测

为了解秦皇岛昌黎县狐和貉源致病性大肠埃希菌耐药性及耐药基因的情况,以昌黎县分离的15株狐和貉源致病性大肠埃希菌为试验菌株,采用药敏纸片法对抗菌药物进行药敏试验,并对四环素类耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD,氨基糖苷类耐药基因strA-strB、aadA1,磺胺类耐药基因sul1、sul2、sul3进行PCR检测。结果显示,15株大肠埃希菌分离菌株对土霉素、多西环素、头孢拉定、新霉素、青霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的耐药率均为100%;对阿莫西林、庆大霉素、头孢曲松、阿米卡星、大观霉素、链霉素、复方新诺明、氨苄西林、环丙沙星耐药率分别为93.33%、53.33%、33.33%、73.33%、86.66%、86.66%、86.66%、66.67%和66.67%。9种耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、strA-strB、aadA1、sul1、sul2、sul3的检出率分别为0、46.67%、26.67%、13.33%、40%、100%、53.33%、46.67%和53.33%,其中四环素类耐药基因以tetB的检出率最高,氨基糖苷类耐药基因以aadA1的检出率最高,磺胺类耐药基因的检出率相差不大。说明15株狐和貉源大肠埃希菌耐药谱广,耐药性高,耐药基因流行普遍。     

新型饲草串叶松香草SOD提取条件优化及其抗氧化能力

本文旨在对不同生长期串叶松香草超氧化物歧化酶(SOD)提取条件进行优化,并对其提取液中类SOD活性物质及抗氧化能力进行考察。采用单因素和正交试验方法,以SOD活力为标准,优化提取条件,并测定串叶松香草不同生长阶段总黄酮、多酚类化合物和维生素C等类SOD活性物质含量,同时对不同生长阶段提取液中羟自由基、1,1-二苯代苦味酞基(DPPH)自由基及超氧阴离子的清除能力进行测定。结果表明:叶丛期与开花期的水提条件为料液比1∶25,37℃水浴浸提12h,其提取液SOD活性分别为4030.12、4445.31U/g。与叶丛期相比,开花期维生素C、总黄酮和总多酚含量分别提高34.51%(P<0.01)、56.59%(P<0.01)和23.15%(P<0.01),开花期提取液清除羟自由基和DPPH的能力分别提高205.65%(P<0.01)和12.20%(P<0.01)。综上,串叶松香草开花期比叶丛期抗氧化能力更强。     

肉牛溶血性大肠埃希菌分离鉴定和毒力与耐药基因检测及药敏试验

为了解肉牛溶血性大肠埃希菌毒力基因和耐药基因分布情况及药物敏感性,从河北省围场县采集的健康肉牛鼻腔棉拭子中分离鉴定溶血性大肠埃希菌,采用PCR检测大肠埃希菌的4个毒力基因和12个耐药基因,并采用K-B法进行药敏试验。结果表明,从116份健康的肉牛鼻腔中分离鉴定出23株溶血性大肠埃希菌,分离率为19.8%;毒力基因检测结果显示,6株菌同时携带LEE(Ler、eaeA)毒力基因,携带率26.1%,18株同时携带高致病性毒力基因HPIirp2、fyuA,携带率78.3%,6株同时携带LEE和HPI毒力基因,携带率为26.1%;耐药基因检测结果显示,blaTEM、aadA1耐药基因的携带率最高,为100%;药敏试验结果显示,23株溶血性大肠埃希菌对头孢氨苄、复方新诺明、磺胺间甲氧嘧啶耐药。结果表明,溶血性大肠埃希菌普遍存在于健康肉牛鼻腔中,HPI毒力基因和β-内酰胺类和耐链霉素类耐药基因携带率高。对河北省围场县肉牛溶血性大肠埃希菌毒力基因和耐药基因进行了研究,并进行药物敏感性分析,结果提示溶血性大肠埃希菌对肉牛养殖存在潜在威胁。     

细菌耐药质粒消除方法研究进展

常见的病原微生物多重耐药性的增加以及多重耐药菌株的出现,给动物养殖业造成了巨大的经济损失。细菌的耐药性与其自身携带的耐药质粒关系密切。论文从细菌耐药现状,细菌的耐药性和耐药质粒的关系,耐药质粒的物理、化学、中草药消除方法这几个方面进行综述,旨在寻求一种安全有效的消除方法消除耐药质粒,为今后相关的研究提供参考。     

毛皮动物源大肠埃希菌毒力基因二重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测毛皮动物源大肠埃希菌耶尔森菌强毒力岛(HPI)中irp2、FyuA毒力基因的二重PCR方法,根据GenBank中irp2、FyuA基因的序列,设计并合成两对引物,扩增得到irp2、FyuA基因片段,大小分别为300bp和951bp。据此建立双重PCR方法,并将反应条件进行了优化。结果表明,用所建立的二重PCR方法可同时特异性扩增出大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因片段,对沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌均无特异性扩增。菌液最低检出量为2.8×105CFU/mL。在78份临床样品检测中,二重PCR检测结果与常规PCR检测结果一致。所建立的大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因二重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能够提高临床样品检测的效率。