柿野生雄性资源调查及其遗传多样性研究

柿（Diospyros kaki Thunb.）雄性种质资源非常稀缺,系统收集和梳理国内外现有雄性资源,阐明其遗传多样性并揭示其与主栽甜、涩柿品种及近缘种的亲缘关系,对雄性种质资源的高效利用有重要意义。在全国范围内开展柿野生种质资源调查,在湖北、广西、江苏等地发现野生雄性种质资源共计90余份。利用15对SSR引物对47份柿完全雄性资源、2份雄全同株资源和11份中国雌雄同株资源进行遗传多样性分析,以67份完全雌性资源、38份日本资源（其中包括25份雌雄同株资源）以及28份近缘种为对照。结果表明：15对引物共获得144个等位基因和316个基因型,平均每个引物获得9.60个等位基因和21.07个基因型,其中位点ssrDK11/DQ097479 遗传变异程度最高。从地理分布来看,柿雄性资源在适生的野外山区普遍存在,其中湖北木兰山来源的雄性资源遗传多样性最高,陕西省来源的雄性资源遗传多样性最低。UPGMA和ME聚类方法分别将193份资源分为16组和12组,两种聚类结果反映的总体规律类似：（1）各来源地间的野生雄性资源存在着一定程度的遗传隔离;（2）湖北木兰山野生雄性资源被分为遗传关系较远的两类,一类与江西、江苏、湖南野柿及‘火晶’等主栽涩柿品种和‘耀县五花柿’等雌雄同株涩柿品种亲缘关系较近,另一类与云架山雄性资源和罗田甜柿（包括‘甜宝盖’）亲缘关系较近;（3）大部分日本来源的柿资源可被单独聚为一类。     

ISTR在部分柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析中的应用

 利用反向序列标签重复技术( inverse sequence-tagged repeat, ISTR) , 对柿属7个种, 包括柿(Diospyros kaki Thunb. ) 、君迁子(D. lotus L. ) 、浙江柿(D. glaucifolia Metc. ) 、油柿(D. oleifera Cheng. ) 、金枣柿(D. sp. ) 、老鸦柿(D. rhombifolia Hemsl. ) 和美洲柿(D. virginiana L. ) 共32个基因型进行了种质鉴定和亲缘关系研究。结果表明: ISTR可区分供试柿属植物中的30份; ISTR能够很好地适用于柿属植物亲缘关系分析; 供试的中国与日本原产柿种质分别聚类; 新发现的中国甜柿变异类型与日本甜柿的亲缘关系较远且存在较丰富的遗传变异, 可能是潜在的育种资源。ISTR标记可在柿属植物种质资源鉴定和亲缘关系分析中更广泛地应用。     

基于IRAP技术的磨盘柿变异单株鉴定

以已知亲子关系的柿品种、柿近缘种和磨盘柿标准品种为对照,对采自北京市房山区磨盘柿产区的部分变异单株进行了IRAP分析。结果表明,19条逆转座子引物中的4个(rtdk13-f5,rtdk16-r10,rtdk4-p3和rtdk2-p6)可将供试11份变异单株完全区分;供试变异单株间的相似系数在0.90～0.98(平均0.94),与磨盘柿标准品种的相似系数为0.91,大于种间和品种间相似系数,与芽变类型及其母株间的相似系数接近;聚类分析结果表明,变异单株与磨盘柿标准品种紧密相聚,分支模式与种间及品种间明显有别。因此,供试11份变异单株已发生部分遗传物质改变,且可能为磨盘柿芽变。IRAP可区分遗传背景高度相似的种质间的微小变异,可望在果树芽变鉴定中应用。     

浙江部分柿属植物鉴定及亲缘关系的SSR分析

应用SSR对浙江省分布的部分柿属植物(包括柿、浙江柿和金枣柿在内的3种46个基因型)进行了种质鉴定和亲缘关系分析。从已公开序列的20对柿属植物SSR引物中筛选出扩增谱带清晰和多态性丰富的引物11对;应用建立的技术体系,可将同物异名和同名异物的试材得以系统整理,一般认为是同一品种的兰溪大红柿与永康方柿,玉环长柿与永嘉长柿指纹图谱各有不同,应为不同种质。聚类分析结果表明,金枣柿(Diospyros sp.)与其他供试试材间的亲缘关系较远,支持其可能为一新种的观点;浙江柿(D.glaucifolia Metc.)与金枣柿的亲缘关系较远但与柿(D.kaki Thunb.)较近;部分供试日本柿种质与浙江省柿种质的亲缘关系较近。研究结果可为浙江省柿属植物种质资源保护和利用提供一定的科学依据。     

基于SRAP的部分柿砧木遗传多样性分析

柿Diospyros kaki Thunb.常见的砧木有君迁子D.lotus L.、浙江柿D.glaucifolia Met.、油柿D.oleifera Cheng及本砧,其遗传关系尚不完全清楚。以21份柿属砧木资源和5份栽培柿品种为试材,利用SRAP分子标记技术分析供试材料之间的亲缘关系。SRAP扩增结果表明,(1)筛选出9对多态性较好的引物,共扩增出113条清晰、可重复谱带,其中多态性带111条,多态性比例分别为98.23%;(2)UPGMA聚类分析结果显示两份本砧种质"小果甜柿"和"牛眼柿"与5份柿栽培品种聚类较近,台湾乌柿与浙江柿、油柿及浙江光叶柿聚类成组,而与其他君迁子类型的遗传关系相对较远。以上结果表明,柿砧木遗传多样性丰富,有望进一步从中挖掘新的种质类型。     

应用RAPD技术研究柿品种间的亲缘关系

采用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对原产中国、日本和韩国的部分柿品种间的亲缘关系进行了初步探讨。结果表明：（1）15个供试品种经OPA－06、OPA－08、OPA－19三个引物扩增后,品种间和引物间的谱带类型各不相同;（2）经6个随机引物扩增出的15个供试品种的谱带类型和相似指数的分析结果显示,‘富有’和‘次郎’,‘平核无’和‘仓光’,‘磨盘柿’和‘杵头柿’间可能具有较近的亲缘关系。     

应用RAPD技术研究柿品种间的亲缘关系

采用随机扩增多态性ＤＮＡ技术对原产中国,日本和韩斩部分柿品种间的亲缘关系进行了初步探讨。结果表明：（１）１５个供试品种ＯＰＡ－０６,ＯＰＡ－０８,ＯＰＡ－１９三个引物扩增后,品种间和引物间的谱带类型各不相同;（２）经６个随机引物扩增出的１５供试品种的谱带类型和相似指数的分析结果显示,“富有”和“次郎”,“平核无”和”仓光“,”磨盘柿“和”杵头柿“ 可具有较近的亲缘关系。     

广西西北部高原地区柿种质资源调查及遗传多样性分析

 调查和研究了广西西北部云贵高原地区柿种质资源状况,并对收集到的柿种质进行表型系统聚类和SCoT遗传多样性分析。结果表明,广西西北部云贵高原地区柿种质资源较丰富,至少拥有柿、油柿和野柿3个种31个不同品种和类型,部分地方仍保存有原始的野生种。不同柿种质在形态和DNA水平上都表现出很大的变异,具有丰富的多样性。35个相对独立的表型性状被用于柿种质的Q型系统聚类分析,在欧氏距离D = 9.8处,31份种质被分为5组,与果形及种质类型在一定程度上相吻合。13条SCoT多态性引物可从31份柿种质中扩增出161个DNA位点,多态性带比例为95.65%;UPGMA聚类分析显示,SCoT标记能将31份柿种质完全区分开,在相似系数0.686的水平将其分为5大类,与表型分析结果基本一致。     

基于SCoT与IRAP标记的金枣柿实生后代遗传变异分析及其生殖特性

【目的】金枣柿是浙江重要经济果树之一,其果实有无核与有核之分,在雄花未见的情况下,其后代遗传变异情况及生殖特性有待探讨。【方法】以金枣柿母本一的15个子代及母本二的16个子代为研究群体,以来自浙江不同地区的12个金枣柿单株及柿(Diospyros kaki)、君迁子(D.lotus)、山柿(D.japonica)为对照;采用SCo T和IRAP分子标记技术,分析金枣柿实生后代的遗传变异情况,并以此推测其种子来源。【结果】利用筛选出的21条SCoT引物及20条IRAP引物对供试材料基因组DNA的扩增结果表明,2种标记共扩增出473条清晰、可重复谱带,其中多态性谱带454条;2种标记的多态性比例分别为93.56%和97.50%。2个子代群体均产生了遗传分离。群体1通过SCo T和IRAP标记得到的DICE相似系数变异分别为0.637~1.000和0.927~1.000,群体2利用这2种标记得到的DICE相似系数变异分别为0.987~1.000和0.981~1.000。【结论】金枣柿的实生群体中均存在一定程度的遗传变异,其中群体1的DICE变异系数虽低于群体2,但其变异主要集中于个别单株,群体2单株的变异类型比群体1更丰富。金枣柿的种子主要由有性杂交产生,其花粉供体很可能为同种的雄花,不排除其具有兼性无融合生殖的能力。     

基于SCoT与IRAP标记的金枣柿实生后代遗传变异分析及其生殖特性北大核心CSCD

【目的】金枣柿是浙江重要经济果树之一,其果实有无核与有核之分,在雄花未见的情况下,其后代遗传变异情况及生殖特性有待探讨。【方法】以金枣柿母本一的15个子代及母本二的16个子代为研究群体,以来自浙江不同地区的12个金枣柿单株及柿(Diospyros kaki)、君迁子(D.lotus)、山柿(D.japonica)为对照;采用SCo T和IRAP分子标记技术,分析金枣柿实生后代的遗传变异情况,并以此推测其种子来源。【结果】利用筛选出的21条SCoT引物及20条IRAP引物对供试材料基因组DNA的扩增结果表明,2种标记共扩增出473条清晰、可重复谱带,其中多态性谱带454条;2种标记的多态性比例分别为93.56%和97.50%。2个子代群体均产生了遗传分离。群体1通过SCo T和IRAP标记得到的DICE相似系数变异分别为0.637~1.000和0.927~1.000,群体2利用这2种标记得到的DICE相似系数变异分别为0.987~1.000和0.981~1.000。【结论】金枣柿的实生群体中均存在一定程度的遗传变异,其中群体1的DICE变异系数虽低于群体2,但其变异主要集中于个别单株,群体2单株的变异类型比群体1更丰富。金枣柿的种子主要由有性杂交产生,其花粉供体很可能为同种的雄花,不排除其具有兼性无融合生殖的能力。     

柿属部分品种杂交亲和性以及结实性的研究

 以柿属中柿种的5个品种和美洲柿种的1个品种为母本,柿种的4个雄株为父本进行杂交,研究结实特性。通过离体培养法比较雄株的花粉活力,利用荧光显微镜观察不同杂交组合花粉与柱头的亲和性,统计其亲和指数和坐果率。4个雄株花粉活力大小依次为‘杂3-2’>‘禅寺丸’>‘杂4-2’>‘正月’;在24个杂交组合中亲和性最高的是‘新昌牛心柿’ב杂3-2’组合,亲和指数为1.30,坐果率为73.88%,亲和性最低的是‘美洲柿’ב正月’组合,亲和指数为0.03,坐果率为17.22%。‘磨盘柿’、‘新昌牛心柿’存在真单性结实和刺激性单性结实现象,‘花县大红柿’为真单性结实,‘美洲柿’、‘若杉次郎’和‘帽盔柿’为假单性结实。柿种间杂交亲和性小于种内杂交亲和性,同种内不同品种间杂交亲和性与坐果率也存在着差异,且亲和指数与坐果率密切相关。     

部分柿属雄性种质巨大花粉、花粉离体及其在罗田甜柿柱头上的萌发率

甜柿品种一般仅着生雌花,少数雌雄同株,具有雄花的优良甜柿亲本很少,限制了完全甜柿杂交育种进程。2n花粉在植物多倍体育种中具有重要价值。本研究以12份柿属雄性种质为试材,进行花粉离体和活体萌发率以及巨大花粉比例检测。结果表明:供试雄性种质花粉萌芽率为20.1%-38.5%;除台湾正柿及油柿外,其余试材的花粉均能在罗田甜柿的柱头上萌发;雄株2号、雄株3号、雄株8号不含巨大花粉,其余试材均有不同比例的巨大花粉存在。     

DlSx-AF4S标记在柿及其杂交后代性别鉴定中的有效性研究

柿（Diospyros kaki Thunb.）优良品种一般仅开雌花且单性结实能力强,早期剔除雄性后代是提高育种效率的重要措施。在柿的近缘种君迁子（D. lotus L.）中已经筛选出一个与雄性性状紧密连锁的DlSx-AF4S标记,但其在包括栽培柿及其杂交后代性别鉴定中的有效性尚不完全明确。利用该标记对268份相关试材进行性别鉴定,并与其花性观察结果相比较。结果表明：（1）116份柿（D. kaki）种质中除‘罗田甜柿’、‘兴义水柿’、‘甘百目’、‘商城冬柿’外,其余112份试材的DlSx-AF4S标记鉴定结果与其田间性别表现一致,鉴别率96.6%;（2）11个柿（D. kaki）杂交组合共118份F1代中有51份进入成花状态,DlSx-AF4S标记检测与已知花性的46份试材一致,鉴别率90.2%;（3）DlSx-AF4S标记在‘华柿1号’ב罗田甜柿’F1代中呈现近1︰1分离;（4）DlSx-AF4S标记在柿和君迁子之外的其他供试柿属植物中也表现出良好的通用性。以上结果表明,DlSx-AF4S标记可用于柿及其杂交后代雄性性别的早期鉴定。     

Phylogenetic analysis in some Diospyros spp. (Ebenaceae) and Japanese persimmon using chloroplast DNA PCR-RFLP markers

Ten universal primer pairs of chloroplast genome were used to amplify non-coding regions of chloroplast DNA (cpDNA) in 7 Diospyros L. species including 29 genotypes and approximately 20.4 kb, 12.6% of the chloroplast genome were analyzed. The amplified products were digested by seven restriction enzymes. The results showed that there were abundant polymorphisms in inter-specific cpDNA within the genus Diospyros. However, it was not observed intra-species variations in 22 tested genotypes of Diospyros kaki (Japanese persimmon), except for ‘Male strain No. 9’. Persimmon had close relationship with Diospyros lotus and Diospyros glaucifolia, but distantly with Diospyros virginiana and Diospyros rhombifolia in diagram based on principal coordinates analysis and Wagner parsimony method. The discrepancy of digesting pattern in cpDNA suggested that the genotype Jinzaoshi was distinct with the remaining Diospyros spp., which revealed that Jinzaoshi may be a new species of the genus Diospyros.     

中国甜柿及其在世界甜柿基因库中的地位

 柿（Diospyros kaki Thunb.）原产中国,但绝大多数为完全涩柿,中国原产完全甜柿（简称中国甜柿）仅在湖北、河南和安徽三省交界的大别山区有分布。主要介绍中国甜柿的栽培历史、地理分布及其变异类型,并重点对其生物学特性、自然脱涩特点及遗传规律等进行总结;此外,还对中国甜柿在世界甜柿的起源与进化、自然脱涩机理和遗传改良研究中的价值进行了阐述。