中国甜柿自然脱涩特点及其机理研究进展

中国原产完全甜柿（简称“中国甜柿”或“C-PCNA”）与日本原产完全甜柿（简称“日本甜柿”或“J-PCNA”）具有明显不同的自然脱涩特点。在综述中国甜柿单宁细胞发育特点、单宁成分和单宁含量变化规律的基础上,总结近年来通过转录组学、蛋白组学等手段筛选中国甜柿自然脱涩关键基因及其功能研究的最新进展,以期为中国甜柿自然脱涩机理研究及其遗传改良提供科学依据。     

完全甜柿遗传改良研究进展

在湖北罗田和麻城为中心的大别山区分布的系列中国原产完全甜柿(简称"中国甜柿"或CPCNA)是世界罕见的柿属植物种质资源,其与日本原产完全甜柿(简称"日本甜柿"或JPCNA)独立起源及其自然脱涩受显性单基因位点控制的特点,在完全甜柿遗传改良中具有重大的应用价值。在简要介绍日本甜柿遗传改良研究和育种成就的基础上,重点阐述中国甜柿自然脱涩性状遗传规律及其早期筛选,并主要基于最近的研究结果对中国甜柿快速遗传改良技术体系的研究近况进行了总结。     

中国甜柿遗传改良技术体系研究进展

在中国中部大别山区分布的中国原产完全甜柿(简称"中国甜柿"或CPCNA)及部分完全雄株是中国特有的柿属(Diospyros Linn.)资源,其与日本原产完全甜柿(简称"日本甜柿"或JPCNA)起源相对独立,且中国甜柿自然脱涩性状受显性单基因控制,因而在完全甜柿遗传改良中具有重大的利用价值。华中农业大学柿研究团队利用这两类种质与日本甜柿构成系列杂交组合,并将常规杂交与胚抢救培养、分子标记辅助自然脱涩性状和性别早期选择、嫩枝高位嫁接、圃地与产区同时评价等技术环节有机整合,建立了一套完全甜柿遗传改良技术体系。本文立足于该技术体系并参考国内外相关报道,对中国甜柿遗传改良工作的研究进展作一系统总结和综合评价,以期为中国的柿品种遗传改良提供科学依据。     

完全雄性柿种质‘雄株8号’作为中国甜柿育种亲本的可能性研究

‘雄株8号’是中国中部大别山区分布的完全雄性柿种质,可能源自中国原产完全甜柿(中国甜柿)的杂交后代或是其自然变异,其作为完全甜柿专用授粉品种的可能性已有研究报道,但其作为完全甜柿育种亲本的应用潜力尚不明确。以‘华柿1号’(不完全涩柿)ב雄株8号’的杂交后代单株为试材,以常见中国甜柿、日本甜柿和非完全甜柿为对照,对其果实进行可溶性和不溶性单宁含量、单宁细胞大小等指标测定,确认杂交后代单株H8-2为具中国甜柿自然脱涩特点的完全甜柿类型。现有完全甜柿自然脱涩性状遗传特点的研究结果认为,只有日本甜柿相互杂交,或者是亲本之一为中国甜柿时,F_1才可能出现完全甜柿单株。该研究结果首次证明中国原产完全雄性柿种质‘雄株8号’带有控制自然脱涩性状的显性基因,因此其在完全甜柿遗传改良中具有作为育种亲本的应用潜力。     

柿果脱涩机理研究新进展

从柿品种分类新体系出发,结合柿果发育特点,尤其是单宁细胞发育和原花青素代谢研究近况,重点从生理生化和分子生物学角度对柿果脱涩机理研究的新进展进行了系统评述;比较完全甜柿和非完全甜柿,以及中国甜柿和日本甜柿脱涩方式、特点及其分子机理的差异,旨在阐明完全甜柿的商品优越性以及中国甜柿在柿遗传改良中的特殊作用。     

阳丰甜柿砧木营养袋苗嫁接建园技术

根据果实成熟时能否自然脱涩及其性状遗传特点,柿分为完全甜柿(Pollination constant&non-astringent,PCNA;简称“甜柿”)和非完全甜柿(non-astringent,PVNA;简称“涩柿”)。甜柿不经处理即可脆食,是目前柿品种遗传改良的首要目标,也是产业发展的主要对象。     

部分中国原产甜柿种质的分子系统学研究

采用２５ 个随机引物对中日两国原产完全甜柿种质的ＲＡＰＤ 分析结果表明： （１）供试中国甜柿和日本甜柿是相对独立分化的两个居群, 中国甜柿的遗传多样性更为丰富; （２）在供试中国甜柿中, ‘罗田甜柿’的５ 个单株间的遗传组成的差异较小, 但与其它湖北甜柿和湘西甜柿间的差异较大; （３） ‘铜盆柿’与湖北甜柿间的相似指数较高, 说明二者有某种亲缘关系; （４） 湘西甜柿与供试日本甜柿间的亲缘关系较近, 说明其可能来自日本或是与日本甜柿的起源有关。     

甜柿果实单宁和糖类物质变化规律研究

甜柿果实生长及可溶性糖分和淀粉积累均呈双峰形，果实产量和品质的形成均以第二个高峰为主。完全甜柿和不完全甜柿自然脱涩的规律有明显差异，完全甜柿的脱涩时间远早于不完全甜柿。果实中糖的组分对甜柿品质有着重要影响。     

阳丰甜柿在天津市蓟县引种表现

<正>我县20世纪90年代末从山东引进次郎、富有等日本甜柿品种,经多点试栽观察,发现这些品种易受冻害、坐果率低、货架期短(7¹0 d变软),经济效益低,不宜大面积推广。为选出适应我县栽培的甜柿品种,满足消费者需求,2007年蓟县林业局从陕西省眉县引进了甜柿新品种阳丰接穗,进行多点高接试验,经过几年来的栽培观察,阳丰品种在我县表现较好,适宜在蓟县北部山区背风阳坡丘陵梯田推广栽培。     

‘阳丰’甜柿在天津蓟州北部山区的试栽表现

‘阳丰’甜柿适宜栽培区的年平均气温应在13℃以上,8—10月果实成熟期平均气温18~19℃。在年均气温较低的地区,甜柿虽能结果,但果实不能在树上脱涩,显示不出甜柿的特性。根据‘阳丰’甜柿的适宜栽植条件,2012年,我们在天津蓟州北部山区(年平均气温略低于南部平原地区)选择不同方位、不同地形、不同地势、不同土质的区域,进行‘阳丰’甜柿引种嫁接、栽培试验,现总结如下。     

部分中国原产甜柿种质果实脱涩类型的鉴定

 以部分中国原产甜柿为试材, 通过对可溶性单宁含量测定和单宁细胞切片观察发现, 在果实接近成熟时, ‘罗田甜柿’、‘宝盖甜柿’、‘秋焰甜柿’ (鄂柿1号) 果肉中单宁细胞较小, 所占比例较低,可溶性单宁含量低于0.2%。因此确认供试中国甜柿种质属于完全甜柿。     

柿野生雄性资源调查及其遗传多样性研究

柿（Diospyros kaki Thunb.）雄性种质资源非常稀缺,系统收集和梳理国内外现有雄性资源,阐明其遗传多样性并揭示其与主栽甜、涩柿品种及近缘种的亲缘关系,对雄性种质资源的高效利用有重要意义。在全国范围内开展柿野生种质资源调查,在湖北、广西、江苏等地发现野生雄性种质资源共计90余份。利用15对SSR引物对47份柿完全雄性资源、2份雄全同株资源和11份中国雌雄同株资源进行遗传多样性分析,以67份完全雌性资源、38份日本资源（其中包括25份雌雄同株资源）以及28份近缘种为对照。结果表明：15对引物共获得144个等位基因和316个基因型,平均每个引物获得9.60个等位基因和21.07个基因型,其中位点ssrDK11/DQ097479 遗传变异程度最高。从地理分布来看,柿雄性资源在适生的野外山区普遍存在,其中湖北木兰山来源的雄性资源遗传多样性最高,陕西省来源的雄性资源遗传多样性最低。UPGMA和ME聚类方法分别将193份资源分为16组和12组,两种聚类结果反映的总体规律类似：（1）各来源地间的野生雄性资源存在着一定程度的遗传隔离;（2）湖北木兰山野生雄性资源被分为遗传关系较远的两类,一类与江西、江苏、湖南野柿及‘火晶’等主栽涩柿品种和‘耀县五花柿’等雌雄同株涩柿品种亲缘关系较近,另一类与云架山雄性资源和罗田甜柿（包括‘甜宝盖’）亲缘关系较近;（3）大部分日本来源的柿资源可被单独聚为一类。     

柿果实扩张蛋白基因cDNA克隆及原核表达

以‘富平尖柿’（Diospyros kaki L.‘Fuping Jianshi’）果实不同发育时期提取的总RNA为模板,利用RT-PCR结合RACE技术扩增得到5个扩张蛋白基因：成熟期CDK-Exp3（1 168 bp）,转色期CDK-Exp4（1 120 bp）和CDK-Exp5（1 018 bp）,膨大期CDK-Exp6（1 129 bp）和CDK-Exp7（1 121 bp）;5个基因的开放阅读框（ORF）均为765 bp,编码254个氨基酸;构建了CDK-Exp3原核表达载体pET-CDK-Exp3,并转化于E.coli BL21（DE3）,SDS-PAGE检测结果显示表达了一个约43 kD的蛋白。     

韭菜不同品种休眠特性及在生产中的应用

对7个韭菜品种休眠特性进行比较，结果表明，平韭5号、平韭6号、791为冬季不休眠品种，在冬季露地候（5 d）均气温2.5 ℃时，心叶虽不枯萎，但生长停止。平科2号、平韭3号、平科薹韭、春早红根为休眠品种，冬季露地候均气温0.7～10.5 ℃时，地上部叶片枯萎，休眠期分别为62、77、51、86 d。在冬季小弓棚内候均气温6.0～15.5 ℃时，4个休眠品种休眠期缩短，分别为31、25、23、32 d。不休眠品种在冬季小弓棚内，至2月28日可收割两茬，休眠品种仅收割一茬，前者较后者增产77.61 %～164.22 %。休眠品种冬季保护地栽培，必须在休眠期即将结束时覆盖生产才能发挥其生产能力。早春露地生产休眠品种优于不休眠品种。     

罗田甜柿原生质体分离、培养及植株再生

 以‘罗田甜柿’休眠芽茎尖诱导的愈伤组织为试材, 对原生质体分离培养技术进行了研究。结果表明: ( 1) 继代10 d 的愈伤组织最适于分离原生质体; ( 2) 优化的酶解体系为CPW+ 0. 5% Cellulase Onoruka R-10+ 0. 03% Pectinase from Aspergillus Niger+ 0. 7 mol/ L Mannitol+ 1% PVP-10; ( 3) 原生质纯化方式以上浮法为好, 100×g 离心6 min; ( 4) 琼脂糖念珠培养5~ 6 d 观测到第1 次分裂, 多为不均等分裂, 60~70 d 形成肉眼可见的小愈伤组织, 愈伤组织增殖到5 mm 以上, 分化成苗, 转至生根培养基生根。     

丙烯和1–甲基环丙烯处理对采后柿果实XTH基因表达的影响

 为了进一步探索木葡聚糖内糖基转移/水解酶（XTH）在柿（Diospyros kaki L.）采后软化中的分子调控机制,应用实时荧光定量PCR 技术检测常温下丙烯和1–甲基环丙烯（1-MCP）处理的‘富平尖柿’果实中XTH 基因表达量的变化。结果显示,丙烯处理能够促进柿果实成熟软化,增加乙烯释放并使高峰提前到来,而1-MCP 处理能够延缓果实软化,抑制乙烯释放。随着柿果实成熟软化推进,4 个XTH 基因呈现不同的表达方式,且丙烯处理促进了4 个XTH 基因的表达,而1-MCP 处理则抑制它们的表达。其中,DkXTH1 和DkXTH2 在柿果实成熟软化过程中表达量较高,且二者表达高峰分别在果实成熟的初期和中期,说明DkXTH1 和DkXTH2 分别与采后柿果实初期和中后期的软化关系密切。结合乙烯释放量结果分析显示,柿果实XTH 基因的表达受乙烯调控,对柿果实的成熟软化中具有一定的促进作用。     

行间生草对甜柿果园土壤微生物和酶活性的影响

以甜柿品种"阳丰"为试材,采用自然生草和人工生草的方法,研究了不同生草处理对土壤微生物数量和酶活性的影响,以期为甜柿果园栽培管理中果园生草提供理论依据。结果表明:人工行间生草可以提高甜柿果园0～20、20～40、40～60 cm土壤细菌、真菌和放线菌数量,但不同草种对各个菌类数量的影响不相同。与自然生草相比,人工生草处理对甜柿果园0～20、20～40、40～60 cm土层土壤过氧化氢酶活性、土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性和土壤磷酸酶活性有促进作用,但其效果因生草种类而存在明显差异。该研究表明生草可以改变甜柿果园土壤微生物数量和酶活性,建议甜柿果园栽培生产中应合理配置草种,优先推荐以林间组合为主,以保证土壤微生物和酶活性的同步均衡增加。     

柿采后丙烯和1–甲基环丙烯处理对两个扩展蛋白基因表达的影响

为进一步了解扩展蛋白（Expansin,EXP）在柿果实采后软化过程中的作用,以丙烯和1–甲基环丙烯（1-methylcyclopropene,1-MCP）处理‘富平尖柿’采后果实,采用实时荧光定量PCR技术检测果实中EXP基因表达量的变化。结果显示,丙烯促进柿果实成熟软化,使乙烯释放高峰升高并提前到来,提高ACC合成酶（ACS）、ACC氧化酶（ACO）活性;1-MCP减缓柿果实的成熟软化,推迟并降低乙烯释放高峰,抑制ACS和ACO活性。随着贮藏时间的延长,柿果实逐渐软化,对照果实DkEXP3和DkEXP4的相对表达量均表现为先上升后下降的趋势。丙烯处理促进了DkEXP3和DkEXP4的表达,使表达高峰升高且提早到来;1-MCP处理抑制了DkEXP3和DkEXP4的表达,推迟且降低了表达高峰。对照和1-MCP处理的果实的DkEXP3和DkEXP4的相对表达量高峰均较乙烯释放高峰早。DkEXP3和DkEXP4在果皮、果肉、果心中表达水平不同。本结果说明EXP可能在采后柿果实成熟软化前期起作用,其表达有组织特异性,且受到乙烯的调控。