鸭沙门氏菌鞭毛抗原的提取与抗原性鉴定初报

【研究目的】提取沙门氏菌鞭毛蛋白并鉴定其抗原性;【方法】选用鸭沙门氏菌经半固体培养基诱导鞭毛,经肉汤培养后,用酸裂解、经差速离心、硫酸铵沉淀,分离出粗制鞭毛蛋白。将粗制的鞭毛蛋白用SDS-PAGE和磷钨酸负染投射电镜观察,并包板做ELISA检测其抗原性;【结果】SDS-PAGE显示提取的鞭毛蛋白相对分子质量约为58.0 KD,且纯度较高,抗原性较好,每1000 ml培养液可获得32.8mg鞭毛蛋白;【结论】酸裂解法可获得高质量的鞭毛蛋白,抗原性较好,为禽副伤寒沙门氏菌病诊断方法的建立奠定了基础。     

EGF对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液（含FSH）中分别添加10,30,50ng/ml表皮生长因子（EGF）,24h检查成熟率,并进行孤雌激活。结果表明：添加10ng/ml、30ng/ml EGF组牛卵母细胞成熟率较对照组（未添加EGF）无显著差异（79.8% vs 71.5% vs 70.4%,p>0.05）,但EGF添加至50ng/ml时牛卵母细胞第一极体排出率显著提高,达85.4%（P<0.01）;在实验1的基础上,比较培养液中添加10ng/ml、30ng/ml 、50ng/ml EGF对牛孤雌激活胚胎体外发育的影响,结果发现在培养液中添加EGF并不能显著提高牛卵母细胞体外孤雌发育囊胚率（P>0.05）,但可显著提高其囊胚孵化率（P<0.01）。     

睾丸提取液、EGF、雌激素对小鼠精原干细胞 体外存活和增殖的效果

为探讨成年小鼠睾丸提取液（testicular abstract, TA）、表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）、雌二醇-17β(estradiol-17β, E2)对小鼠精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）体外存活及增殖的作用。用胶原酶-胰蛋白酶消化、差速贴壁法分离8 d小鼠的SSCs，培养于STO细胞饲养层上，培养液中分别添加不同浓度的TA、EGF和E2，观察SSCs的存活时间和增殖能力。结果显示，添加3种因子后，SSCs的平均存活时间与对照组相比虽无显著差异。但在20~40 ng/ml EGF和10~100 pg/ml E2组中SSCs的平均存活时间均明显延长，且在较长时间段内观察到了处于明显增殖期的细胞。提示20~40 ng/ml EGF和10~100 pg/ml E2对小鼠SSCs的体外存活和增殖具有一定良好作用。     

双腺藤组培快繁体系的建立

本研究针对双腺藤繁殖系数低、育苗周期长等问题,对双腺藤品种‘Sunparasol’组培快繁体系进行研究。结果表明:双腺藤幼嫩带芽茎段使用0.1%HgCl_2处理3 min,启动培养培养基为MS+6-BA 4 mg/L+NAA 0.1 mg/L时,萌动率高达93.33%;继代培养阶段在MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中增殖数量最多且生长健壮,增殖系数为4.31;蔗糖浓度为40 g/L时可以促进细弱组培苗生长;适量添加1～2 mg/L矮壮素后组培苗生长状态最好;生根培养基为1/2MS+NAA 0.1 mg/L生根率为83.33%,平均生根条数为4.3。本研究组培快繁体系的建立对双腺藤的规模化生产具有重要的指导意义。     

酸奶中保加利亚乳杆菌原生质体制备的初步研究

【研究目的】研究保加利亚乳杆菌原生质体制备的适宜条件;【研究方法】从酸奶中分离培养了保加利亚乳杆菌,观察生长动力学特性,在培养基中添加甘氨酸、变溶菌素进行了原生质体的制备;【结果】分离的保加利亚乳杆菌为革兰氏阳性杆菌,生长对数期为2-16h;在培养基中添加甘氨酸（1mg/ml）能够显著提高原生质体的形成率;原生质体的形成率随着酶浓度的增大而增大,随着酶解时间的延长而提高;【结论】原生质体制备的最适酶浓度为4ug/ml,作用时间为45min。     

鹿茸角软骨细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

【研究目的】建立梅花鹿鹿茸软骨细胞体外分离培养和扩增方法，观察鹿茸软骨细胞在体外培养的生物学特性，为鹿茸再生机理的研究奠定基础；【方法】体外分离培养鹿茸软骨细胞，采用组织学、MTT比色法、免疫组化等多种手段动态检测细胞生长增殖情况；【结果】核心部分，约150字鹿茸软骨细胞贴壁生长，原代细胞比传代生长速度快，原代及传代4代内的鹿茸软骨细胞均有活跃的增殖能力，软骨细胞呈三角形，多边形等多种形态，II型胶原免疫组化，甲苯胺蓝染色为阳性；【结论】体外分离培养鹿茸软骨细胞具有较强的增殖能力，传代培养4代内细胞生长旺盛并维持其生物学特性, 可满足后续实验研究要求。     

梅花鹿鹿茸间充质层与前成软骨层细胞的培养及SB-431542对其增殖的影响

分离培养梅花鹿鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞,通过研究TGF-β的特异性小分子拮抗剂SB-431542对这两种细胞增殖的影响,探讨TGF-β在鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞增殖与分化中的调节机制。从生长30天的梅花鹿鹿茸中分离间充质层细胞和前成软骨层细胞,进行体外培养,将传代培养第2代的间充质层细胞和前成软骨层细胞分别在含不同浓度SB-431542（0、1、3、5、8、10 μmol/L）的培养液中培养,48小时后用MTT法测定这两种细胞增殖活性的变化,用SPSS软件对其增殖的差异性进行分析。结果显示,体外培养的鹿茸间充质层细胞呈成纤维细胞样,前成软骨层细胞呈纺锤形或梭形,台盼兰染色显示细胞活性均在90%以上。经SB-431542处理的间充质层细胞的增殖活性低于对照组(P＜0.05),而前成软骨层细胞增殖活性高于对照组(P＜0.05),且3μmol/L和5μmol/L的SB-431542处理的前成软骨层细胞增殖活性明显高于对照组(P＜0.01)。试验表明,TGF-β可能在维持鹿茸间充质层细胞的快速增殖和诱导间充质细胞向软骨细胞分化等过程中起重要的作用。     

苹果原生质体培养再生愈伤组织

以苹果试管苗叶片为原生质体分离材料,对影响原生质体分离和培养的因素进行了研究。结果表明适合叶片酶解的酶液组成是Cellulase-Onzuka R-10 0.8% + Pectinase 0.5% + PVP 1% + 甘露醇 0.65 mol/L + MES0.1%;以改良MT + BA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L + 甘露醇0.65 mol/L + Vc 5.0 mg/L + Glu 500 mg/L + CH 100 mg/L + ME 500 mg/L + Arg 50 mg/L为培养基对原生质体进行培养,固液双层培养效果较好,最适培养密度为1×105 (个/ml),培养1-2 d原生质体变形,3-4 d第一次分裂,2 w分裂3-5次。平邑甜茶原生质体一个月后形成微细胞团,两个半月形成肉眼可见的微愈伤组织。鲁加5号和M7均只形成7-10个细胞的细胞团,嘎拉未见细胞分裂。     

梅花鹿鹿茸真皮层细胞的分离培养及冷冻保存

为了研究梅花鹿鹿茸真皮层细胞的生物学特性,取梅花鹿鹿茸生长顶端的真皮层组织,分离真皮层细胞进行体外培养及冷冻保存。结果表明,在含10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中,鹿茸真皮层细胞能进行短期体外培养,培养的细胞呈长梭形或菱形,细胞的生长状况良好,传代培养的细胞培养5d可长至汇合。传4代以前的细胞形态均一,边缘光滑,胞质均匀透明,细胞排列紧密;传5代后,细胞伸展变为扁平形,细胞突起增多,边缘不光滑,汇合后细胞排列疏松。以含5%二甲基亚砜(DMSO)和10%FBS的DMEM为冻存液,经梯度降温后冻存,真皮层细胞复苏后的存活率较高。     

IGF1对不同培养代数梅花鹿鹿茸间充质层细胞增殖的影响

【研究目的】通过细胞培养技术,探讨胰岛素样生长因子1（IGF1）对体外培养不同代数的梅花鹿鹿茸间充质层细胞增殖的影响。【方法】分离、培养生长90d的梅花鹿鹿茸间充质层细胞,将传代培养第2代、5代、8代细胞经含有不同浓度的IGF1（0,1,3,和10 nM）作用,培养24 h后用3H-胸腺嘧啶核苷掺入测定法检测蛋白合成放射性含量。【结果】不同浓度IGF1处理组的蛋白合成放射性含量的平均值和最高值都是离体培养2代的细胞最高（分别为32146和35973 DPM/mg）;培养5代的细胞（分别为2781和3206 DPM/mg）已明显下降;第8代时（分别为489和736 DPM/mg）又进一步下降,并且与对照组无显著的差异。【结论】不同培养时期的梅花鹿鹿茸间充质层细胞对IGF1刺激的敏感度不同,取材于生长90天鹿茸的间充质层细胞在离体培养8代后已失去了对IGF1刺激的敏感性。     

家鸽消化道生长抑素免疫活性内分泌细胞的研究

摘要: 应用卵白素-生物素-过氧化物酶复合物( avidin-biotin-peroxidase complex,ABC)免疫组织化学方法对家鸽（columbae livia domesticus）消化道生长抑素细胞的分布密度和形态学特点进行了观察。结果表明: 生长抑素(somatostatin , 简称SS)细胞主要分布于胃体及其以下部位, 其中胃体部的分布密度最高,小肠各段的分布密度较低,且小肠各部位间差异不显著。而在食管和嗉囊中均未发现ss细胞 。SS细胞的形态多样,主要有圆形﹑椭圆形和锥体形等。主要分布在上皮细胞基部、上皮细胞之间和腺泡上皮细胞之间。通过形态学观察认为：家鸽消化道生长抑素细胞的分布与其消化道各部位的功能有关。     

外源钙对杏果实裂果的影响研究

从盛花后10 d开始,对大丰杏和硕光杏喷施糖醇螯合钙肥,每隔7 d喷一次,连喷3次.结果表明:幼果期喷钙处理后延缓和减轻了杏果实裂果发生的时期和程度;与对照相比增加了果实内维生素C的含量,大丰杏和硕光杏喷钙后分别提高了1.27 mg/100 g和2.34 mg/100 g;增加了果实内钙含量,大丰杏和硕光杏喷钙后分别上升了12.9%和11.6%,减少了钾含量,降低了钾/钙;提高了果实内SOD的活性,大丰杏和硕光杏分别提高了5.58,2.50 U/(g·h).     

狼毒根提取物的杀虫活性测定

利用瑞香狼毒根乙醇提取物(SCEE)对榆白长翅卷蛾5龄幼虫和麦二叉蚜进行触杀作用测定。结果表明,SCEE对榆白长翅卷蛾5龄幼虫有很强的触杀活性,当浓度为20mg/ml、10mg/ml、6.67mg/ml、5mg/ml、4mg/ml时,其校正死亡率分别为100％、100%、98.2%,95.4％、83.18%。SCEE对麦二叉蚜的触杀活性较差,最高浓度20mg/ml时,其校正死亡率仅为22.54%。     

荔枝胚性悬浮细胞系的快速建立及其体胚植株的再生

荔枝幼胚诱导的胚性培养物在低糖条件下连续继代4~6次左右,可筛选到颗粒细小、不含原胚的松散型胚性愈伤组织;以这种松散的胚性愈伤组织作为起始材料,在附加2,4-D 2mg/L或2,4-D 2mg/L、KT1 mg/L、AgNO3 5mg/L的MS液体启动培养基上振荡培养（100~120 r/min）10~14 d,即可建立起分散性良好的胚性悬浮细胞系。采用激素减半的2种启动培养基交替继代培养或周期性固体－液体轮回培养,可以长期保持胚性悬浮细胞系。荔枝胚性悬浮细胞在附加NAA 0.1 mg/L、KT 或Ze 5 mg/L、肌醇100 mg/L、蔗糖50g/L、琼脂10g/L的MS固体培养基上诱导体胚,25~40d后可形成大量胚状体,诱导体胚数量达10,000个/g FW以上。经过成熟培养后,正常的体胚75%以上萌发再生完整植株。     

‘三白’石榴再生体系的构建

为建立适用于遗传转化和育种研究的‘三白’石榴再生体系,以带芽茎段为外植体进行组织培养研究。结果表明,最佳初代培养基为MS+BA 2.0 mg/L+ IBA 0.2 mg/L+ PVP 2 g/L,成芽率达83.1%,成芽个数为4.9;最佳增殖培养基为B5+ BA 0.8 mg/L+ IBA 0.5 mg/L+ AgNO3 0.2 mg/L+ GA3 0.2 mg/L+椰汁100 ml/L+PVP 2 g/L,增殖系数达5.6;最佳生根培养基为B5+ IBA 1.0 mg/L+椰汁100 ml/L,生根率达95.6%,移栽成活率达87.3%,由此建立了‘三白’石榴的再生体系。     

Tryptophan synthesis block-associated sugar response, a physiological marker for rapid selection of Arabidopsis thaliana transformants, marked with feedback-inhibition-insensitive anthranilate synthase gene

The feedback-insensitive anthranilate synthase (AS) gene was used as a selection marker for transformants of Arabidopsis thaliana . The mutant gene ( mAS1-2 ) was constructed by substituting nucleotide at the effector-binding site of the intrinsic AS gene via PCR-mediated site-directed mutagenesis and flanked with the myrosinase promoter pyk10 to drive its expression during initial root elongation. This inducible gene cassette was first introduced into Agrobacterium tumefaciens and then delivered into A. thaliana by floral-dip inoculation. 5-methyltryptophan (5-MT) inhibited AS and suppressed seedling growth of wild type plants as a result of tryptophan starvation. With the addition of sucrose (10 mg/ml), 5-MT inhibited cotyledon opening and caused anthocyanin to accumulate in juvenile seedlings. The present mutant reversed the tryptophan starvation caused by 5-MT and blocked subsequent sugar responses. The sugar responses were detected in non-transformed plants grown on a selection medium containing 10 mg/ml of sucrose and 10 μg/ml of 5-MT after 3 days of incubation. Thus, true transformants could be selected after a short incubation, compared to the conventional kanamycin-selection method that did not eliminate all non-transformed plants.     

水杨酸对白蜡属种间杂交子代悬浮细胞中香豆素类含量的影响

为了研究不同浓度水杨酸(SA)对白蜡属种间杂交子代悬浮细胞生长量及香豆素类物质产量的影响,从而建立以生产香豆素类物质为目的的白蜡属细胞悬浮培养技术。以白蜡种间杂交子代悬浮培养96 h的细胞为材料,分别添加不同质量浓度(25、50、100 mg/L)的SA处理8、24、48、72、96 h,进行细胞生长量、香豆素类化合物类含量测定。结果表明,施加信号分子SA能不同程度地促进香豆素及白蜡树精的含量和产量增加,其中以浓度100 mg/L的SA效果最明显,处理72 h后白蜡树精的含量及产量均达到最高,分别为0.5704 mg/g和0.2595 mg,相较于对照分别提高了114.59%和35.03%,香豆素的含量和产量的变化也有相同的趋势,均在处理72 h后达到最高,分别为0.2470 mg/g和0.1124 mg,相较于对照分别提高了112.39%和56.56%。适宜浓度的SA可促进白蜡属种间杂交子代悬浮细胞中香豆素类物质的积累。     

金黄色葡萄球菌对小尾寒羊乳腺组织TLR2表达的影响

Toll样受体能够识别细菌等病原微生物及介导炎症反应信号通路,在先天免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。为了解Toll样受体2(TLR2)在小尾寒羊正常乳腺组织及由金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎乳腺组织中的表达情况,探讨TLR2在金黄色葡萄球菌乳腺炎致病过程中的作用机制及乳腺上皮细胞在乳腺免疫防御中所起的作用,采用qRT-PCR技术和免疫组织化学染色(IHC)法检测了正常小尾寒羊及金黄色葡萄球菌乳腺炎病理模型小尾寒羊乳腺组织中TLR2基因mRNA及其蛋白的表达情况。结果显示,小尾寒羊正常乳腺组织、金黄色葡萄球菌感染乳腺组织均有TLR2 mRNA及其蛋白表达;但金黄色葡萄球菌感染后乳腺组织中TLR2基因及TLR2蛋白显著高于正常乳腺组织,且感染后48 h TLR2 mRNA和TLR2蛋白相对表达量最高(P0.05),96 h TLR2 mRNA和蛋白相对表达量较48 h显著降低(P0.05),正常对照组TLR2的相对表达量最低。通过免疫组织化学染色发现,正常乳腺组织中TLR2蛋白主要定位于乳腺腺泡上皮,而感染金黄色葡萄球菌后乳腺组织中TLR2蛋白主要表达在乳腺腺泡腔中脱落的乳腺上皮细胞和以淋巴细胞为主的炎性细胞上。结果表明,乳腺感染金黄色葡萄球菌后,乳腺上皮细胞是病原菌作用的靶标,通过上调表达TLR2识别病原菌,激发先天免疫。     

羊乳腺上皮细胞的形态观察

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物,并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现：纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;部分细胞呈长形。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体。