柑橘胁迫响应基因WRKY47的克隆与表达分析

以柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]、芦柑(Citrus reticulata Blanco)、金柑[Fortunella japonica(Thunb.)Swingle]为试验材料,基于甜橙基因组数据库中的甜橙基因碱基序列,利用RT-PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47的cDNA全长碱基序列.序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长都是1567 bp,开放阅读框为1506 bp,编码501个氨基酸.氨基酸序列和结构分析结果显示,这4个基因编码的蛋白质属于Group IIa+IIb类WRKY蛋白.进化树分析结果显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与克莱门柚WRKY47蛋白的亲缘关系最近.对CsWRKY47启动子顺式作用元件预测分析,发现CsWRKY47启动子包含脱落酸响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motiF)、抗氧化响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等多个与胁迫相关的顺式作用元件.实时荧光定量表达分析结果表明,柠檬ClWRKY47和甜橙CsWRKY47能被高盐、干旱、低温胁迫诱导表达;芦柑CrWRKY47在干旱和低温胁迫下诱导表达,高盐胁迫下表达量下调;金柑FjWRKY47在高盐胁迫下诱导表达,干旱和低温胁迫下下调表达.为进一步开展柑橘胁迫相关基因WRKY47的功能鉴定奠定了基础.     

番茄Mi-1基因调控元件及同源基因进化分析

为阐明Mi-1基因转录调控元件及同源基因进化特点,从番茄品种京番308中克隆Mi-1基因起始密码子上游序列,选取转录起始位点上游1 432 bp的序列进行启动子顺式调控元件分析,分析结果表明,Mi-1启动子除了含有核心元件外,还含有光响应元件、脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件等。Mi-1同源基因进化分析结果表明,Mi-1同源基因既包括旁系同源基因,也包括直系同源基因。当同源指数为0.70时,番茄、马铃薯、辣椒中含有Mi-1同源基因,与辣椒相比,番茄与马铃薯的亲缘关系更近。结果可为进一步研究Mi-1基因的调控表达和进化规律奠定基础。     

玉米HD-Zip转录因子基因ZmHOX32的克隆及功能探究

同源异型域-亮氨酸拉链蛋白(HD-Zip)可通过与其他蛋白质互作参与激素信号传导途径,进而调控植物对逆境胁迫的应答和生长发育等过程。为验证及探究HD-Zip蛋白对干旱胁迫和ABA诱导的响应模式,从玉米抗旱自选系郑D58M中克隆了1个HD-Zip转录因子基因,暂时命名为ZmHOX32。ZmHOX32蛋白包含856个氨基酸,属于亲水性蛋白质,定位于细胞核内。进化树和保守基序分析发现,ZmHOX32蛋白序列与谷子、胡桃木的同源蛋白序列高度相似且保守基序完全一致。ZmHOX32基因启动子序列含有响应激素、非生物胁迫及光刺激的结合元件。qRT-PCR结果显示,ZmHOX32基因属于组成型表达基因,在营养分生组织中高表达,且受干旱胁迫和外源ABA的正向诱导,表明ZmHOX32基因参与干旱胁迫和ABA信号传导途径。     

玉米ZmWRKY41基因克隆及转录激活验证

[目的]干旱是影响作物生长发育及产量的重要因素。植物WRKY转录因子超家族在植物的生长发育、响应逆境胁迫过程中发挥着重要作用。因此,克隆分析玉米WRKY转录因子的序列特征和功能,为研究玉米耐逆分子育种提供重要抗逆基因资源。[方法]本研究以玉米自交系B73为材料提取玉米总RNA反转录cDNA,克隆、分离获得ZmWRKY41基因编码区全长序列。DNAMAN比对发现,ZmWRKY41蛋白具有保守结构域WRKYGQK和锌指结构域(zinc-finger motif)C2HC,属于第三类WRKY转录因子家族。利用生物信息学方法研究该基因蛋白质理化性质,并对其进行结构分析预测。利用PlantCARE在线工具预测、鉴定ZmWRKY41基因启动子区是否含有响应非生物胁迫的顺式作用元件。将ZmWRKY41基因编码区全长序列构建pGBKT7诱饵载体上,与GAL4DNA结合域融合,转化酵母菌株AH109验证ZmWRKY41转录因子转录激活活性。[结果]玉米ZmWRKY41基因编码区全长774bp,含有长度分别为221bp、126bp、427bp 3个外显子,共编码257个氨基酸序列。蛋白质高级结构预测发现,ZmWRKY41蛋白包含2个α-螺旋结构和5个β-折叠结构,不含跨膜结构和信号肽。ZmWRKY41基因启动子元件预测发现,该启动子中含有干旱胁迫(CGGTCA)、热胁迫(AAAAAATTTC)、低温胁迫(CCGAAA)等非生物逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。酵母转录激活验证实验显示,将含有pGBKT7-ZmWRKY41融合表达载体转化酵母AH109菌株,能在单缺、三缺培养基正常生长且能使α-半乳糖苷酶底物分解显蓝色,表明ZmWRKY41基因具有转录激活活性。[结论]玉米ZmWRKY41基因是WRKY转录因子基因家族成员之一,在酵母体内具有转录激活活性,可能参与响应非生物逆境胁迫,为进一步研究该转录因子调控非生物逆境胁迫奠定基础。     

木薯MebZIP2基因克隆及其功能分析

【目的】bZIP转录因子在植物生长发育、淀粉合成和非生物胁迫等方面发挥重要作用。克隆木薯MebZIP2基因并进行亚细胞定位、表达分析和酵母单杂交分析,为进一步研究MebZIP2基因的功能提供参考。【方法】从木薯SC205中扩增MebZIP2基因编码区（CDS）序列,对其进行生物信息学分析,并构建pNC-GreenSubN融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定MebZIP2蛋白的亚细胞定位情况。在木薯不同组织和块根不同发育阶段分析MebZIP2基因表达特征,利用酵母单杂交研究其与淀粉合成基因启动子的互作情况。【结果】MebZIP2基因CDS序列长度为465 bp,编码154个氨基酸,蛋白分子量为17 891.35 Da,理论等电点为5.23,属于不稳定亲水性蛋白。MebZIP2含有bZIP保守结构域,其氨基酸序列与橡胶树bZIP蛋白的相似性最高,为74.22%。MebZIP2基因启动子区域含有光响应元件,赤霉素、水杨酸和茉莉酸等激素响应元件,以及胚乳表达和胁迫响应元件。MebZIP2蛋白亚细胞定位于细胞核和细胞膜。MebZIP2基因在根尖分生组织、须根、茎和块根...     

金银花FT基因的克隆及在不同花器官中的表达分析

在药用植物金银花中克隆了开花整合基因LjFT(Genbank登录号：OP700454)，并对其开展了生物信息学分析和不同花器官中的表达分析。结果表明：金银花LjFT基因包含4个外显子和3个内含子，编码框长度为525 bp，编码174个氨基酸残基，其所编码的蛋白质与其他植物FT序列高度保守；基于SWISS-MODEL和Alphafold 2这2种方法进行的蛋白结构预测表明金银花LjFT与拟南芥FT在蛋白质三级结构上高度保守；启动子分析表明LjFT启动子序列中含有大量激素响应元件、光响应元件和胁迫响应元件；系统进化分析表明LjFT与绣球HmFT亲缘关系最近；表达分析表明LjFT主要在花蕾期高量表达，尤其是花萼和花瓣中，开花后表达水平迅速降低。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

小豆 AUX/IAA 基因家族全基因组 鉴定及表达分析

【目的】生长素是一种必需的植物激素,而 AUX/IAA 是生长素原初响应因子在环境胁迫中植物 生长和发育中起着至关重要的作用。为了解 VaIAAs 在小豆生长发育过程中的生物学功能,对 VaIAAs 基因家族 进行全基因组鉴定和分析。【方法】利用生物信息学对小豆的 AUX/IAA 进行全基因组鉴定和分析,基于 RNAseq 分析 VaAUX/IAA 基因家族在各组织的表达模式。【结果】在小豆全基因组共鉴定到 41 个 VaIAAs 基因,亚 细胞定位显示均为定位为细胞核。系统发育分析显示来自小豆、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）的 AUX/IAA 蛋白聚集成 6 组。基因结构分析表明,所有基因均含有内含子数目 1~8 个,VaIAAs 基因包 含 1~21 个外显子。顺式作用元件分析发现参与响应生物 / 非生物胁迫顺式作用元件最多,包括最常识别到的 ATTATA.bos、G-box 和 sp1 基序,还发现富集在厌氧诱导响应元件 ARE 和植物抗逆相关的 MYB 元件。蛋白 - 蛋白互作网络分析发现,所有 VaIAAs 均与 ARF 相连,此外还有部分基因与 AXR3（生长素诱导阻遏因子）、MP （转录因子 B3 家族蛋白）等基因互作。VaIAAs 具有组织特异性,在不同组织的基因表达水平差异较大。 【结论】小豆 AUX/IAA 基因家族的基因结构、系统进化、蛋白质 - 蛋白质网络互作等生物信息学分析结果,将 为揭示小豆 AUX/IAA 基因家族在小豆生长发育过程中的功能提供重要的线索。     

木薯MeCWINV4启动子的克隆及其活性分析

根据木薯细胞壁转化酶基因MeCWINV4已知编码区序列与木薯基因组数据库中预测的MeCWINV4基因序列信息设计引物,从木薯基因组DNA中对该基因的潜在启动子区进行PCR扩增,经测序比对成功获得1 639 bp序列,其中包含74 bp编码区序列和1 565 bp潜在启动子区序列。用Plant CARE和PLACE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子包含CAAT box和TATA box保守元件、大量光反应相关元件与应对高低温胁迫和激素响应相关元件。将MeCWINV4启动子片段取代pVKH表达载体中的CaMV 35S启动子与GUS连接,构建成融合表达载体pVKH-CW4-GUS,通过农杆菌真空渗透法在烟草叶片中进行瞬时表达。结果表明,该启动子驱动了GUS基因在烟草叶片中的表达。说明MeCWINV4启动子具有启动子活性,可以启动目的基因的转录,为进一步研究该基因的调控机制奠定了基础。     

马铃薯 HSP90基因家族的全基因组鉴定及高温干旱胁迫下的表达分析

热激蛋白HSP90是植物中一类高度保守的分子伴侣,参与细胞内蛋白质稳态调控、底物蛋白的激活和热激因子的调控,在高温干旱等逆境胁迫中发挥重要作用。从12个茄科植物基因组中共鉴定出130个 HSP90基因,包含马铃薯的11个 HSP90基因,马铃薯 HSP90基因与番茄属植物的亲缘关系最近。马铃薯HSP90蛋白质基序较为保守;马铃薯 HSP90基因启动子分析发现其包含植物激素、高温胁迫、干旱胁迫响应等顺式作用元件。通过对高温、干旱胁迫条件下的马铃薯 HSP90基因进行qRT-PCR分析,热激后大多数 HSP90基因显著上调,4个 HSP90基因表达量极高;干旱胁迫下多数 HSP90基因也呈上调趋势,其中1个 HSP90基因表达量极高。STRING数据库预测出HSP90蛋白的22个伙伴蛋白,其功能涉及逆境胁迫应答、生长发育、信号转导等生物学过程;蛋白质互作网络分析发现5个高表达量 HSP90基因参与调控内质网未折叠蛋白反应（UPR,unfolded protein response）、细胞内蛋白质降解与活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成,在抵抗极端逆境胁迫中发挥重要作用。