汉中黑稻黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)的遗传变异分析

本实验通过PCR和测序拼接获得汉中地区8个黑稻品种黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)编码区序列,在NCBI中用BLAST分析首次发现该基因位于水稻4号染色体。发现8种黑稻和普通籼稻F3H序列完全相同,与粳稻相比较,则存在4个突变位点,导致2个氨基酸突变。基于F3H序列信息的进化树表明黑稻与籼稻、粳稻、小麦、玉米的亲缘关系较近;遗传距离和同源性分析表明F3H基因较为保守,是一个古老的基因,可用于种属的鉴定分析。F3H蛋白理化性质分析发现,黑稻与其它禾本科植物存在一定差异,蛋白三维结构及相关位点预测发现粳稻和黑稻无明显差异,初步认为黑稻F3H序列变异可能与花青素的合成无关,需要在其表当量与花青苷和成合成与沉积的关系方面开展进一步研究。     

汉中地区不同黑稻品种查尔酮合成酶基因的遗传变异分析

为汉中黑稻起源及其花青苷合成机制提供分子遗传依据,通过分析汉中地区8个黑稻品种和其他植物查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因序列,利用PCR扩增8个黑稻品种查尔酮合成酶基因并测序,使用DNAMAN和MEGA5.0软件分别对水稻的CHS基因外显子序列进行比对和不同物种间的聚类。结果表明:水稻种内存在4个多态位点,8种黑稻中存在3个多态位点,比对CHS氨基酸序列,仅黑宝品种存在1个氨基酸突变。经聚类分析,8种黑稻亲缘关系最近,与籼稻聚为一类,然后与粳稻聚在一起,禾本科植物CHS同源性很高。结论:CHS是一个古老的基因,可作为种属鉴定的参考基因,CHS虽是花青苷合成的限速酶基因,但其序列的变异可能与黑稻花青苷的合成无相关性。     

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为汉中黑稻起源及其花青苷合成机制提供分子遗传依据,通过分析汉中地区8个黑稻品种和其他植物查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因序列,利用PCR扩增8个黑稻品种查尔酮合成酶基因并测序,使用DNAMAN和MEGA5.0软件分别对水稻的CHS基因外显子序列进行比对和不同物种间的聚类.结果表明:水稻种内存在4个多态位点,8种黑稻中存在3个多态位点,比对CHS氨基酸序列,仅黑宝品种存在1个氨基酸突变.经聚类分析,8种黑稻亲缘关系最近,与籼稻聚为一类,然后与粳稻聚在一起,禾本科植物CHS同源性很高.结论:CHS是一个古老的基因,可作为种属鉴定的参考基因,CHS虽是花青苷合成的限速酶基因,但其序列的变异可能与黑稻花青苷的合成无相关性.     

不结球白菜花青苷合成负调控基因BrcLBD39的克隆和表达分析及其对外源6-BA的响应

[目的]本文旨在探究LBD39基因在不结球白菜紫色和绿色材料中的特性及其对外源6-BA的响应,为花青苷调控机制奠定理论基础。[方法]以不结球白菜紫色自交系NJZX1-3及其绿色突变体NJZX1-0为材料,同源克隆LBD39基因的全长,应用生物信息学方法分析其核酸和蛋白序列及其进化关系,并在线预测蛋白质二级和三级结构。采用外源6-BA处理后测定叶片中花青苷含量,并通过实时荧光定量PCR技术测定了LBD39基因在外源6-BA处理后的表达水平。[结果]在2个不同材料中克隆获得的LBD39基因完全相同,序列长为876 bp,包含编码区(长为699 bp)及非编码区(长为177 bp)。其编码区序列含有1个长为696 bp的开放阅读框(ORF),编码232个氨基酸,将该基因命名为Brc LBD39。亚细胞定位预测该蛋白分布在细胞核中,蛋白相对分子质量为25.30×103,等电点为8.85。进化树分析表明,Brc LBD39蛋白序列与大白菜Bra LBD39相似性为100%,其次与油菜和甘蓝关系最近,相似性分别为99%和93%。外源6-BA处理24 h以后紫色材料NJZX1-3叶片中花青苷含量均高于对照,而绿色突变体叶片基本不含花青苷;Brc LBD39基因在2个材料中具有相似的表达模式,即先下降后上升而后又下降,其中在处理后48 h时Brc LBD39基因表达量急剧增加,在紫色和绿色材料中增量分别为74.84%和49.87%。此外,Brc LBD39表达量在绿色材料中明显高于紫色材料。[结论]不结球白菜中花青苷负调控基因Brc LBD39既响应外源6-BA,又与叶片中花青苷的积累密切相关,在花青苷的生物合成过程中起着重要的调控作用。     

‘红早酥’梨花青苷合成相关基因的克隆及表达分析

以‘早酥’梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)及其红色芽变‘红早酥’梨为试材,采用同源克隆方法,分别从这2种材料的果皮中,得到花青苷生物合成途径中3个关键结构基因PbCHS、PbDFR、PbUFGT和2个调控基因PbbHLH、PbMYB10的cDNA编码区序列。生物进化树分析表明,这5个花青苷合成相关基因序列与其他植物均具有较高的同源性。通过荧光定量PCR,研究花青苷合成基因在不同幼嫩组织器官中的表达情况。结果表明,大部分基因在‘红早酥’梨的幼叶、叶柄、花瓣、幼果、花梗中的表达量均高于‘早酥’梨,其中PbUFGT和PbMYB10在二者中的表达差异尤为显著。     

不结球白菜花青苷合成转录因子基因BcEGL3的克隆及沉默分析

[目的]本文旨在探究BcEGL3基因在不结球白菜紫色材料和其绿色突变体中的特性及其调控功能。[方法]以不结球白菜紫色自交系NJZX1-3和其绿色突变体NJZX1-0为材料,克隆BcEGL3基因;构建表达载体pRI101-BcEGL3,进行亚细胞定位;构建沉默载体pTY-BcEGL3,分析材料中花青苷含量变化,以及BcEGL3、BcDFR基因在NJZX1-3、NJZX1-0、pTY-S和pTY-BcEGL3植株的基因表达量;对NJZX1-3进行遮光处理,分析遮光后花青苷的积累以及BcEGL3基因的转录水平变化。[结果]从NJZX1-3和NJZX1-0中克隆所得EGL3基因序列完全相同,序列长1 821 bp,含1个1 818 bp的开放阅读框(ORF),编码606个氨基酸,将其命名为BcEGL3。蛋白结构分析表明,EGL3蛋白属于bHLH-MYC-N超家族,其蛋白结构较为简单。进化树结果表明,BcEGL3蛋白与大白菜BraEGL3关系最近,同源性高达99.9%。亚细胞定位结果显示,BcEGL3蛋白定位于细胞核中。基因沉默结果表明,与NJZX1-3相比,转pTY-BcEGL3或pTY-S植株叶片紫色变浅,且对应花青苷含量降低。RT-qPCR结果表明,BcEGL3和BcDFR基因在转pTY-BcEGL3植株中的相对表达量低于转pTY-S植株和NJZX1-3植株,同时植株叶片颜色由紫色转为绿色,花青苷含量明显降低,但总叶绿素含量及类胡萝卜素含量无明显变化。遮光处理5 d后不结球白菜叶片中花青苷的含量比对照下降68%,且11 d时叶片中花青苷含量降幅最大。另外,遮光后BcEGL3基因相对表达量呈下降趋势,与对照相比14 d时下降幅度最大。[结论]BcEGL3蛋白定位于细胞核,BcEGL3基因沉默可以抑制叶片中花青苷的合成,且与BcDFR基因的表达密切相关,因此在不结球白菜花青苷的合成过程中BcEGL3基因起重要作用。     

水稻编码光系统Ⅱ相关捕光色素蛋白Lhcb2基因的克隆与表达分析

捕光复合物蛋白(LHCP)在植物光合作用过程中发挥重要的作用。基于水稻基因组信息,以亚洲栽培稻籼稻品种黄华占、长雄蕊野生稻及其杂种F_1为试验材料,克隆了水稻Lhcb2基因,并对其基因内含子信息、蛋白序列特征、进化树、蛋白结构、基因表达进行分析。结果表明:水稻Lhcb2基因全长880 bp,含有1个长98 bp的内含子。开放阅读框长度为792 bp,编码263个氨基酸;水稻LHCB2与13个其他植物的LHCB氨基酸序列一致性为68.78%。进化树分析显示,水稻LHCB2蛋白与同属禾本科的毛竹和麻竹亲缘关系最近,与低等植物团藻亲缘关系最远。水稻LHCB2蛋白属于亲水性蛋白,其理论分子量为28 495.40,理论等电点为5.62,具有2个无序化区域,无序化比例为30.04%;水稻LHCB2蛋白三级结构有2个β折叠和3个α螺旋组成。Lhcb2基因荧光定量分析结果显示,长雄蕊野生稻和杂交F_1代植株叶片中表达量分别为黄华占的1.22和1.96倍。长雄蕊野生稻中的叶绿素a和b、色素、类胡萝卜素等均高于黄华占及其杂交F_1代。长雄蕊野生稻叶绿素a的含量分别为另2份水稻材料的1.13和1.75倍,叶绿素b含量为1.10和1.60倍,色素含量则为1.13和1.72倍。     

苹果MdMYB32通过自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成

【目的】研究苹果MYB转录因子家族MdMYB32的生物学信息、表达水平及其在花青苷合成中的功能,旨在为进一步完善花青苷合成代谢机理提供参考。【方法】以新疆红肉苹果杂种一代优系为试材,克隆MdMYB32,分析其进化树和蛋白序列;测定其在不同果实及在不同胁迫处理下的表达水平,通过转基因验证其在花青苷合成中的功能,并通过酵母单杂交分析其互作关系。【结果】qRT-PCR分析表明MdMYB32在花青苷含量高的‘红脆9号’苹果中表达水平较低,而在花青苷含量低的‘红脆6号’苹果中表达水平较高,与花青苷含量呈负相关;且盐胁迫和冷胁迫均能抑制MdMYB32的表达;在进化上,MdMYB32与AtMYB32,MdMYB16和AtMYB4在同一个进化枝上,且MdMYB32蛋白序列在C端含有一个EAR抑制序列;在红肉愈伤中过表达MdMYB32能够抑制ANS的表达水平,降低花青苷含量,而过表达切除EAR抑制序列后的LESMdMYB32后,不能明显改变ANS的表达水平和花青苷含量;酵母单杂交和Chip-PCR分析表明MdMYB32和LESMdMYB32均能够结合ANS的启动子。【结论】MdMYB32能够结合ANS启动子,并通过自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成。     

长筒石蒜花青素合成酶基因LlANS的克隆与表达分析

以粉色系长筒石蒜(Lycoris longituba)花瓣为材料,基于前期获得的长筒石蒜转录组数据,通过序列分析结合聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法,成功克隆得到长筒石蒜Ll ANS基因的全长编码序列,并对其进行了生物信息学分析及亚细胞定位观察。结果表明,该基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)全长为1 068 bp,编码355个氨基酸,蛋白质相对分子质量约为40.08 k D,理论等电点为5.58,属于酸性不稳定的亲水性蛋白;Ll ANS蛋白属于α-酮戊二酸依赖性双加酶家族,具有典型的花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)蛋白功能结构域2OG-Fell-Oxy;系统进化树分析表明该基因与同属的石蒜和中国石蒜中ANS基因具有较高同源性,最高达97%;亚细胞定位观察显示Ll ANS蛋白定位于细胞核、细胞质及细胞膜中。此外,实时荧光定量分析证实Ll ANS基因在长筒石蒜粉色花花蕾期表达量较低,在盛花期的表达量最高。以上结论表明,Ll ANS作为长筒石蒜花色苷合成途径中的一个关键节点基因,对于长筒石蒜粉色花花色的形成起着极为重要的作用。     

云南特有火把梨UFGT基因片段的克隆与序列分析

为研究UFGT基因对红皮梨花色素苷合成的调控机制,以云南特有火把梨为试材,克隆得到UFGT的基因片段,运用生物信息学分析软件对该基因序列进行分析。结果表明:UFGT基因片段长1 440 bp,编码479个氨基酸的蛋白质;该氨基酸序列与沙梨、西洋梨、白梨、苹果和樱桃李的同源性分别为99%、96%、94%、91%和72%;蛋白无跨膜结构,不存在导肽和信号肽,属于非分泌蛋白,定位在胞液;结构功能域分析显示该片段含典型的GT1_Gtf_Like功能域和1个GTB型超家族蛋白的典型结构。     

越橘VcANS基因的克隆及表达分析

【目的】从越橘果实中克隆花色素合成酶（ANS）基因cDNA,为研究越橘花色素苷合成的分子机制奠定基础。【方法】以越橘（Vaccinium spp.）品种“北陆”（V.corymbosum L.）为试材,并以Illumina测序文库（NCBI登录号：SRA046311）中差异表达的Unigene 38125片段为基础,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得花色素合成酶基因全长cDNA,利用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和系统进化分析,探讨ANS基因在不同组织和器官中的相对表达量及其与对应花色素苷含量的关系。【结果】成功克隆了越橘花色素合成酶基因序列,命名为VcANS,GenBank登录号为JN654701。序列分析结果表明,VcANS全长1 424 bp,包含93 bp的5′非编码区、248 bp的3′非编码区和1个长度为1 083 bp编码360个氨基酸的开放阅读框,该基因编码的蛋白具有ANS家族普遍存在的2酮戊二酸和Fe²⁺依赖的氧化酶超家族的保守结构域。序列比对和系统进化分析表明,VcANS与杜鹃花科植物亲缘关系最近。在越橘果实发育的不同阶段,VcANS相对表达量的变化与花色素苷含量的变化趋势具有一致性。【结论】获得了越橘花色素合成酶基因全长,推测其对越橘花色素苷的形成起调控作用。     

山茶花翻译控制肿瘤蛋白CjTCTP基因的电子克隆及生物信息学分析

采用电子克隆方法从山茶花的EST数据库中获得了一条TCTP基因,并命名为CjTCTP,使用生物信息学方法对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、信号肽、亚细胞定位、高级结构及功能域和进化树等方面进行了预测和分析。结果表明:山茶花CjTCTP基因全长706bp,包含507bp的完整开放阅读框,编码168个氨基酸;编码蛋白含有TCTP1及TCTP2保守域,是TCTP superfamily家族;从信号肽的预测可知,该蛋白不存在信号肽,可能为可溶性蛋白;亚细胞定位显示其可能位于细胞质中;同源性分析表明,该蛋白序列与拟南芥、橡胶树、玉米等物种TCTP蛋白序列的相似度达80%以上。     

洋葱查尔酮合成酶基因的分子克隆和表达分析

查尔酮合成酶是类黄酮类物质合成的关键酶。本研究克隆了洋葱的查尔酮合成酶基因AcCHS1和AcCHS2。AcCHS1的ORF序列1182 bp,编码393个氨基酸残基;AcCHS2的ORF序列1 176 bp,编码391个氨基酸残基。在同等条件下,AcCHS2基因的表达明显高于AcCHS1。     

桑树查尔酮合成酶基因（CHS）的生物信息学分析（英文）

[目的]探讨桑椹色素代谢调控的分子机理。[方法]本研究以桑科植物的EST数据库为基础,采用生物信息学实验技术,通过电子克隆方法获得了桑树查尔酮合成酶基因（CHS）。采用生物信息学在线软件,进一步对该基因编码蛋白的氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构等方面进行了预测和分析。[结果]经DNAstar软件拼接后得到的cDNA序列为1 365 bp,其开放阅读框序列为1 170 bp,编码389个氨基酸残基。CHS蛋白含有查尔酮合酶家族的特征多肽序列RLMMYQQGCFAGGTVLR,不含信号肽序列,属于非分泌型蛋白,定位于细胞质内,分子进化也较为保守。[结论]该研究结果为深入研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。     

香蕉柠檬酸合酶基因MaGCS的克隆及生物信息学分析

采用RACE-PCR的方法首次在香蕉中获得一个柠檬酸合酶基因的cDNA序列。经序列测定和Blastx比对分析表明,该eDNA全长1885bp,编码513个氨基酸残基,具有植物柠檬酸合酶基因的特征结构域,并与其他植物来源的乙醛酸循环体的柠檬酸合酶具有很高的序列相似性,将其命名为MaGCS（Musa glyoxysomal citrate synthase）,并对其进行生物信息学分析,初步预测其理化性质及功能等。     

藤茶查尔酮合成酶基因AgCHS1的克隆及功能鉴定

【目的】查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）是植物类黄酮生物合成的第一个关键酶,从藤茶中克隆AgCHS1,分析其序列特征及其在藤茶中的组织表达特异性,通过体外酶活性检测和烟草遗传转化对其功能进行鉴定,为进一步研究藤茶类黄酮累积的调控机理提供理论基础。【方法】根据藤茶转录组测序结果设计引物,以藤茶叶片cDNA和基因组DNA为模板,PCR扩增得到AgCHS1。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA6和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建系统进化树。通过原核表达系统获得AgCHS1的重组蛋白,分析该重组蛋白对底物的催化活性,并通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）对酶促反应产物进行鉴定。利用qRT-PCR技术对AgCHS1在藤茶不同器官的表达水平进行分析,并采用硝酸铝比色法测定相应的总黄酮含量变化。构建植物过量表达载体,通过叶盘法转化烟草,筛选阳性转基因后代,对T₂代株系花瓣中的花青素和黄酮醇含量进行检测。【结果】AgCHS1的ORF长1 182 bp,编码393个氨基酸,基因组序列长1 315 bp,含2个外显子和1个内含子。生物信息学分析表明,AgCHS1为稳定的亲水蛋白。通过与其他物种的CHS蛋白多序列比对发现,AgCHS1含有查尔酮合成酶家族的特征序列和活性位点残基,包括丙二酰CoA结合位点和三联活性中心位点,与其他物种的CHS序列一致性较高。系统进化分析显示,AgCHS1与葡萄、山葡萄的CHS处于同一进化分支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,AgCHS1在成熟叶和花中的表达量最高,在老叶中的表达量最低。藤茶不同器官的总黄酮含量与AgCHS1表达水平呈显著正相关。体外酶活性分析显示,重组的AgCHS1蛋白可以催化底物对-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成柚皮素,说明该蛋白具有查尔酮合成酶活性。获得5株烟草转基因阳性株系,其中2株的花瓣颜色明显加深;与对照相比,转基因株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分别提高56.6%和25.3%,OE3的黄酮醇含量没有显著差异,OE4的黄酮醇含量提高39.1%。【结论】AgCHS1是藤茶中催化合成查尔酮的关键酶,过量表达AgCHS1可以提高转基因植物中花青素和黄酮醇的含量。     

烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1.NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近.这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础     

‘凤丹’牡丹花色变化过程中花瓣色素及相关基因表达

针对‘凤丹’牡丹在开放过程中花色由紫红色变白的现象,以‘凤丹’5个不同开放时期的花瓣为试验材料,分别运用色差仪、高效液相色谱仪和荧光定量PCR测定花色表型、花色素成分及质量分数和花青苷合成途径中相关基因的表达,进而分析花瓣色素与花青苷合成相关基因表达之间的关系。结果表明:随着花的开放,红色大幅减退,明度变大,彩度降低;‘凤丹’花中检测出2种花青苷(芍药花素-3,5-二葡糖苷和矢车菊素-3,5-二葡糖苷)和8种单体酚。花开放过程中,总花青苷和总黄酮质量分数逐渐减少,总花青苷质量分数降低幅度更大。花青苷合成相关结构基因PAL、DFR、ANS和转录因子MYB22、bHLH1的表达模式与总花青苷质量分数的变化趋势一致,而且这些基因的表达量与总花青苷质量分数均具有极显著正相关性。研究发现,‘凤丹’花色变化的主要原因是总花青苷质量分数大量减少。PAL、DFR、ANS是参与‘凤丹’花青苷合成的关键结构基因,转录因子MYB22及bHLH1可能对结构基因DFR和ANS的表达起着重要的调控作用。     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白（CSL）作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区。利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增技术（RACE）成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列。应用美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因。多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71%以上。利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础。图5参10     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.