尖孢镰刀菌粘团专化型线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因敲除突变体的构建与表型分析

【目的】研究线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因在尖孢镰刀菌粘团专化型中的功能。【方法】利用同源重组原理,采用PEG介导原生质体的转化方法获得基因敲除突变体,并分析其表型和致病力。【结果】敲除Tom7基因导致尖孢镰刀菌的生长速率减慢,菌丝出现波浪状弯曲生长,产孢量增加,对氧胁迫和渗透胁迫敏感,但对其毒力无影响。【结论】由此推测线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因缺失后,影响线粒体蛋白转运功能,进一步对尖孢镰刀菌的生长发育和产孢造成影响。     

真菌诱导子调控紫草素合成的分子机制探究

为探讨真菌诱导子调控紫草素合成的分子机制，以新疆紫草无菌苗为试材，经尖孢镰刀菌、立枯丝核菌制备成的诱导子生物诱导后，对其根部进行RNA测序和分析。结果表明，与对照组比较，尖孢镰刀菌试验组差异表达基因1 735个；立枯丝核菌试验组差异表达基因1 043个。GO(gene ontology)分析发现，2个试验组差异表达基因主要富集在细胞过程、细胞组分中膜和分子功能中催化活性等生物学过程。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析发现，2个试验组在植物与病原菌互作、植物激素信号转导途径和苯丙素合成等通路均有大量差异表达基因富集。2个试验组差异表达情况相同的转录因子主要包括bHLH、AP2/ERF-ERF和LOB等，并发现参与紫草素合成及其正向调控的AeGHQH、AeDSH1、AeAP、AePAL、AeDI2、AePGT、AeHMGR、AeG10H基因在2个试验组均上调表达，其中尖孢镰刀菌试验组上调表达较显著。以上结果从分子水平探究了新疆紫草对真菌诱导子生物诱导的响应机制，为未来真菌诱导子应用于新疆紫草种植生产奠定了理论基础。     

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记

【目的】开展建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白标记研究,直观观察尖孢镰刀菌在建兰植株上的侵染为害,明确病原菌的致病过程,为开展建兰茎腐病原菌的相关研究提供良好技术手段。【方法】采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白(GFP)转化,并检测转化子的遗传稳定性。【结果】GFP基因可被成功导入到尖孢镰刀菌F-02中并获得表达,转化子在蓝色光源激发下,菌丝和分生孢子均能稳定散发绿色荧光;转化子10次继代培养后菌落生长良好,菌丝和分生孢子仍可稳定散发出绿色荧光,对寄主植物的致病力也未发生改变,【结论】GFP基因可在建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中稳定存在,并对其致病力没有影响。     

几丁质酶编码基因FolCTS3参与调控尖孢镰刀菌几丁质酶活性和致病力的研究

番茄枯萎病是一种由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici, Fol)引起的土传植物病害,严重影响番茄农业生产。几丁质酶(CTS)在丝状真菌中保守存在,在真菌细胞壁形成过程中起着关键作用,但是否参与尖孢镰刀菌的致病过程目前尚未见报道。在Fol中鉴定到2个几丁质酶编码基因FolCTS2和FolCTS3,利用基因敲除方法研究其在病原菌致病中的功能。结果表明:缺失FolCTS3不影响Fol菌丝生长及对非生物胁迫的耐受能力,但显著影响几丁质酶活性和致病力,其缺失突变体的几丁质酶活性和致病能力显著下降;而缺失FolCTS2对Fol生物学表型无显著影响。这一研究提示几丁质酶编码基因FolCTS3参与调控尖孢镰刀菌的几丁质酶活性和致病过程,为解析尖孢镰刀菌的致病分子机制及番茄枯萎病防治策略的制定提供了理论依据。     

香蕉枯萎病菌fgb2基因的克隆与序列分析

为了解fgb2基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型1号和4号生理小种之间的致病力差异关系,采用PCR和RT—PCR方法扩增了2个生理小种的fgb2基因,并对其扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,同时还对其基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析。结果表明,2个生理小种fgb2基因开放阅读框分别为1466bp和1452bp,基因同源性为96．33％;其编码的氨基酸数量分别为299个和316个;从．詹62基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列来看,2个生理小种的致病力差异与詹62基因并无明显对应关系。     

万寿菊杀菌素水乳剂对尖孢镰刀菌侵染活性的影响

用万寿菊杀菌素水乳剂对尖孢镰刀菌侵染活性进行研究。结果表明,万寿菊杀菌素水乳剂能够使尖孢镰刀菌的菌膜透性增大,导致病原菌活力降低,侵染活性也随之下降;同时能够通过降低尖孢镰刀菌的纤维素酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性,从而使尖孢镰刀菌的侵染力下降。万寿菊杀菌素水乳剂能够通过降低尖孢镰刀菌的侵染活性而起到抑菌和保护植物的作用。     

西瓜专化型尖孢镰刀菌FonSIX6缺失突变体的构建

病原菌和植物相互作用时分泌效应蛋白（effectors）抑制植物的防卫反应。枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的真菌病害,尖孢镰刀菌和寄主相互作用时分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白（15.8～29.9 kD）进入木质部启动致病力,称为SIX（secreted in xylem）蛋白,其中,SIX6蛋白是一个效应蛋白。西瓜枯萎病是由西瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp.Niveurn,Fon）引起的真菌病害。为了明确FonSIX6在侵染西瓜时的作用,克隆了该基因的上下游序列,以潮霉素为筛选标记构建了该基因的缺失突变体载体pDH\|SIX6;将构建好的基因缺失载体转入农杆菌AGL\|1中,通过农杆菌介导的遗传转化和转化子的筛选获得了FonSIX6基因的缺失突变体。     

红橘响应褐斑病菌侵染的转录组学分析

【目的】 明确红橘（Citrus reticulata Blanco, cv. Hongjv）接种褐斑病致病菌——链格孢菌橘致病型（Alternaria alternata tangerine pathotype）后基因种类和表达量在转录水平的变化规律,确定红橘响应该致病型侵染的关键基因。【方法】 采用链格孢菌橘致病型接种红橘离体叶片,28 h后选取感病叶片和未接种叶片提取RNA,进行转录组高通量测序,然后利用生物信息学分析,以甜橙基因组为参考,以|log₂ fold change|≥1,q-value≤0.01为阈值选取感病和健康红橘叶片转录组的差异表达基因,应用GO数据库对差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）进行功能分类,KEGG分析代谢途径,MapMan软件分析生物胁迫信号通路相关基因的表达变化。采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。【结果】 红橘接种链格孢菌橘致病型28 h后产生大量与胁迫相关的差异表达基因,获得上调差异基因5 173个,下调差异基因6 555个。GO功能分类显示差异基因主要与蛋白结合、膜、氧化还原过程等相关。通过KEGG富集和MapMan软件分析发现,红橘在受链格孢菌橘致病型胁迫的过程中基础代谢被严重破坏。乙烯、水杨酸和生长素等寄主防御相关的植物激素信号转导途径多个基因表达出现差异,其中乙烯起主导作用,乙烯受体ETR 3个成员被不同程度激活,下游激酶和乙烯响应因子均上调,生长素大部分关键信号基因、绝大部分生长素响应因子ARF和水杨酸合成途径的基因均下调表达。同时,黄酮醇、花青素、萜类化合物和生物碱合成相关基因受该菌诱导显著变化,萜类合成中大部分基因下调,而黄酮类合成相关上调基因数量和表达趋势均强于表达下调基因,有抗虫和抑菌作用的硫代葡萄糖苷基因呈上调趋势。进一步研究发现,大量参与抗逆过程的转录因子如WRKY、bZIP、ERF、MYB、NAC被诱导激活,其中大部分WRKY和bZIP转录因子受该菌正向调控,超过50%的ERF家族基因表达上调;在转录因子调控下,PTI及ETI响应基因如受体激酶、R蛋白、NBS抗病蛋白等大量表达,多个PR家族抗菌蛋白基因上调表达,22个抗氧化保护酶系统POD成员基因受到活性氧信号激发大量表达。以上结果表明链格孢菌橘致病型侵染对寄主内部生理状态产生显著影响。选取了19个与植物抗病相关基因进行qRT-PCR分析,其基因表达趋势与测序数据一致。【结论】 获得了红橘响应链格孢菌橘致病型侵染的差异表达基因及显著上调表达基因,其主要富集于代谢过程、应激反应及转录调控等条目中,这些基因的相互协同调控是红橘对该致病型产生防御反应的重要机制。     

尖孢镰刀菌致病菌营养体亲和群研究

在分离、鉴定侵染黄瓜的尖孢镰刀菌的基础上，测定30个尖孢镰刀菌菌株（包括6个专化型）对黄瓜的致病性和营养体亲和性。研究结果表明，侵染我国黄瓜的尖孢镰刀菌至少有5个以上的营养体亲和群（VCGs)，除来自黑龙江的9909－1菌株与膜的黄瓜根茎腐专化型（Fusarium axysporum f.sp.radicis-cucmeinun,FOCS)菌株属同一亲和群外，其它菌株均与希腊的尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F.o.f.sp.cucumerinum,FOC)和FORC不亲和，本文所测定的尖孢镰刀非致病菌株均与致闰 株不亲和，不同专化型的尖孢镰刀菌菌株归属于不同的营养体亲和群。研究结果初步显示了应用营养体亲和性区分菌的致病性及专化型的可能性。     

稻瘟菌P-ATPase基因MoCTA3的克隆及表达分析

为分析P-ATPase基因与稻瘟菌致病性的相关性,从稻瘟菌中克隆了一个P-ATPase基因MoCTA3,然后对其进行了序列分析和氨基酸序列比对,并利用qRT-PCR检测了该基因在稻瘟菌侵染水稻叶片不同时期以及菌丝阶段的表达情况。结果表明该基因全长3 747 bp,含有6个外显子和5个内含子,编码1 096个氨基酸,含有7个跨膜结构域,第24～98位有一个保守的钙离子转运结构域;其编码氨基酸与朱红丛赤壳、尖孢镰刀菌、蝗绿僵菌、炭疽菌等真菌的P-ATPase氨基酸相似性分别为77%、78%、83%和79%;基因表达结果显示该基因在菌丝阶段的表达量明显高于孢子阶段和侵染阶段,且在孢子侵染水稻过程中随侵染时间延长表达量逐渐升高,72 h时达到高峰,随后降低,说明MoCTA3可能参与了稻瘟菌的侵染过程,在稻瘟菌的致病性方面具有重要作用。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

芽孢杆菌拮抗镰孢菌机制的研究进展

镰孢菌（Fusarium）分泌多种真菌毒素引起的枯萎病、赤霉病、根腐病和穗腐病等植物病害,造成重大的作物生产损失。化学防治是防治镰孢菌的重要手段,但其带来的镰孢菌抗性和生态环境污染等问题,严重制约了农业可持续发展。在病害管理中使用生物防治剂为控制镰孢菌引起的植物病害提供了一种安全、有效和可持续的手段,因此生物防治具有比化学防治更深远的优势。在生物防治剂中使用最广泛的生防微生物是芽孢杆菌属（Bacillus）的成员,其可通过多种机制为植物提供有效控制镰孢菌入侵的方案。芽孢杆菌作为一种优良的生物防治剂已被广泛研究,其可通过生态位竞争、产生抗菌物质、诱导植物系统抗性和塑造根际健康微生物组来拮抗镰孢菌侵染,本文从以上4个方面对芽孢杆菌拮抗镰孢菌的机制进行综述,为农业生产中芽孢杆菌防治镰孢菌病害的研究提供参考。     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。     

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。     

深绿木霉对青蒿的促生作用

为了研究深绿木霉对青蒿的促生作用,用深绿木霉菌丝体和孢子分别施用于苗期和成株期的青蒿,统计比较各项生长发育指标和生理指标.结果表明:与清水对照相比,深绿木霉菌丝体和孢子均能显著促进青蒿幼苗生长,但对大田成株青蒿没有显著促生作用.深绿木霉适合作为青蒿苗肥,部分替代化肥.     

日本白鲫BMP15和GDF9基因片段的克隆及组织表达分析

根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

猪种、牛种、羊种、绵羊种布鲁菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立在临床样本能够同时检测猪种、牛种、羊种、绵羊种布鲁菌的多重PCR方法,根据NCBI已收录的布鲁菌全基因,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立能够同时检测4种布鲁菌的多重PCR诊断方法。特异性试验结果表明,可以从4种布鲁菌以及4种细菌混合物中扩增出大小分别为276、494、733和976bp的特异性条带,对照组的检测结果为阴性;敏感性试验结果表明,对4种病原菌基因组DNA的检出量为猪种32.2pg、牛种21.3pg、羊种27.5pg、绵羊种43.2pg;人工模拟感染样本检测结果表明,能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。应用该方法对200份临床奶山羊乳样进行检测,结果检出4份阳性。建立的多重PCR方法具有特异性强、敏感度高、稳定性好的特点,可以有效地检测4种布鲁菌的感染。     

火龙果HpGST基因克隆及表达分析

为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能,克隆了HpGST基因的cDNA序列,并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp,编码221个氨基酸,编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用;系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近,属谷胱甘肽转移酶Tau家族;实时荧光定量PCR分析结果显示,HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达,在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型,表达趋势均为先上升后下降,其表达量与甜菜素含量呈现正相关,且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致,推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。