炭疽菌属几个重要种的分子系统学研究

 炭疽菌属(Colletotrichum Cda.)分布广泛,是一重要的植物病原真菌属,尤其在热带和亚热带地区。由于形态特征差异微小和不稳定,该属的分类一直较为混乱。本文应用RAPD和ITS-RFLP 2种分子生物学方法对炭疽菌属几个重要种的种间和种内亲缘关系进行研究,为该属的分类提供了有用的分子依据。     

油茶炭疽菌携带病毒种类鉴定及多样性分析

 炭疽菌是重要的植物病原真菌,能够引起多种植物炭疽病。真菌病毒广泛存在于植物病原菌中,侵染炭疽菌属真菌的病毒资源有待挖掘。本文利用宏病毒组测序技术,对分离自我国南部6个省份不同油茶园的40株油茶炭疽菌中的病毒进行了鉴定。经过同源比对分析,发现10种基因组类型均为正义单琏RNA的新病毒。它们分属于减毒病毒科(Hypoviridae)、裸露病毒科(Narnaviridae)、线粒体病毒科(Mitoviridae)和葡萄孢欧尔密病毒科(Botourmiaviridae)。本研究是我国南方油茶炭疽病菌携带病毒的首次报道。研究结果丰富了炭疽菌属所携带的病毒基因组信息,可为深入分析炭疽菌真菌病毒的多样性和分子特性奠定基础。     

希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26的功能分析

希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)是一种重要的植物病原真菌,可引起严重的十字花科蔬菜炭疽病,对蔬菜生产造成了很大的影响。为了探究希金斯炭疽菌自噬相关基因ChAtg26在致病过程中的作用,本研究以希金斯炭疽菌侵染拟南芥Col-0后的cDNA为模板,通过qRT-PCR技术测定了ChAtg26基因在侵染过程中的表达模式,并利用同源重组技术构建了ChAtg26基因的敲除与回补突变体,分析了敲除ChAtg26基因对希金斯炭疽菌生长发育与致病能力的影响。结果表明,ChAtg26基因在病菌侵染寄主后0～40 h中有较高的表达量,而敲除ChAtg26基因后,病菌在生长速率、孢子萌发、附着胞形成以及对氧化胁迫敏感性方面没有明显变化,但是会在菌落黑色素累积与对细胞壁胁迫的敏感性方面有所下降,同时其产孢量与致病力会明显降低,说明ChAtg26基因参与了希金斯炭疽菌的黑色素合成、细胞壁胁迫应答反应、产孢与致病过程,并在这些过程中起着重要作用。     

草莓应答炭疽菌侵染的转录组分析

本研究以栽培草莓为材料,用炭疽菌对植株进行侵染,对健康草莓和患病草莓进行转录组分析(RNA-seq),共得到86 988个序列以及2 127个差异表达基因。利用GO数据库对差异表达基因进行了聚类分析,结果发现差异表达基因主要聚类在光合作用、氧化还原过程、氧化还原酶活性、碳固定过程以及糖代谢过程等方面。同时,利用KEGG数据库对差异表达基因影响的通路进行注释后发现,炭疽菌侵染主要影响了光合作用、倍半萜和三萜生物途径、类黄酮生物合成、谷胱甘肽代谢和植物激素信号转导等途径中关键基因的表达水平。挑选了20个差异表达基因进行qRT-PCR,结果有19个基因的表达趋势与转录测序结果一致。本研究获得的草莓应答炭疽菌侵染转录组数据信息,将有助于丰富草莓抗炭疽病的调控机制。     

枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的拮抗作用及生防潜力

为了明确枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌的抑制作用,通过室内抑菌试验和离体试验测定了内生真菌对胶孢炭疽菌的抑制作用及对枸杞炭疽病的防治效果。结果表明,镰刀菌属Fusarium菌株NQ8GII4、NQ8GII7、NQ7GII4和篮状菌属Talaromyces菌株NQ6GIII11对胶孢炭疽菌有明显的拮抗作用。平板对峙试验显示,上述4株枸杞内生真菌具有较强的营养和空间竞争能力,菌株NQ8GII4对病原菌的抑制率高达93.43%。显微观察发现,枸杞内生真菌能缠绕并穿透胶孢炭疽菌菌丝,使胶孢炭疽菌菌丝膨胀崩解。菌株NQ7GII4的培养滤液在浓度为15%时对病原菌菌丝的抑制率达到70.75%,菌株NQ8GII7产生的挥发性物质对胶孢炭疽菌抑制率高达83.44%。离体生防试验结果表明,用拮抗性内生真菌预先占位接种枸杞嫩果及叶片,能有效抑制枸杞炭疽病菌的侵入和病斑的扩展,菌株NQ8GII4 10%培养滤液对枸杞炭疽病的防治效果最强,防效达到了92.54%和95.57%,说明枸杞内生真菌具有很好的生防潜力和应用前景。     

辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

由辣椒胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides导致的辣椒炭疽病是辣椒生产上最为严重的真菌病害之一。本文以辣椒胶孢炭疽菌CSLL11为供试菌株,采用PEG-CaCl_2介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B抗性基因和eGFP表达基因的DNA片段成功转入辣椒胶孢炭疽菌的原生质体中,获得了稳定表达绿色荧光的转化子,从而成功建立了辣椒胶孢炭疽菌的遗传转化体系。试验结果表明,可有效筛选阳性转化子的潮霉素B浓度为500 mg/L;PCR及Southern blot结果显示,eGFP表达基因已单拷贝整合至辣椒胶孢炭疽菌转化子的基因组中;使用荧光显微镜观察第一代及继代培养后的转化子,菌丝与分生孢子均表现出强烈的绿色荧光信号,说明GFP能在转化子中稳定遗传;将转化子与野生型菌株相比,菌落形态、生长速率及致病力水平无明显差异。本研究建立了辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系并获得了稳定表达绿色荧光蛋白的转化子,对辣椒炭疽菌与寄主互作的研究及病害防治具有重要意义。     

胶孢炭疽菌CgSho1基因的克隆与功能分析

HOG-MAPK(high osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase)信号途径是真菌MAPK途径中参与渗透压响应的一条重要通路,在植物病原菌生长发育及致病过程中发挥着重要的作用。Sho1(synthetic high osmolarity-sensitive protein1)是HOG-M APK信号途径上游的一个重要感受器,在不同真菌中常具有不同的功能。本研究从胶孢炭疽菌中克隆了Sho1的同源基因,命名为Cg Sho1,该基因编码一个291个氨基酸的蛋白,含有4个跨膜结构域和一个SH3功能域。利用同源重组的方法获得了该基因的敲除突变体,与野生型相比,敲除突变体表现为营养生长缓慢,菌丝稀疏且疏水性增强,产孢量下降,对氧化压力和渗透压更加敏感,致病力明显减弱。上述结果表明,Cg Sho1参与调控胶胞炭疽菌的营养生长、分生孢子产量、氧化应激反应、渗透压响应及致病性。     

苹果与炭疽菌互作研究进展

近年来,由炭疽菌引起的苹果炭疽病已成为阻碍苹果产业健康发展的重要病害之一。苹果与炭疽菌的互作研究有助于苹果炭疽病的科学防治和抗病育种。笔者从苹果炭疽病病菌的致病机制、苹果种质资源对炭疽菌的抗性表现和苹果对炭疽菌的抗病机制等方面对苹果与炭疽菌的互作研究进行系统综述,并对炭疽菌的致病机理和苹果抗病基因等研究前景进行了展望。     

生防放线菌CY-14的鉴定及其发酵液对香蕉炭疽病的防治效果

香蕉炭疽病是由香蕉炭疽菌Colletotrichum musae侵染引起的,是香蕉采后贮藏、运输和销售过程中发生的主要病害之一,严重影响中国香蕉的北运和出口。从土壤中分离到1株对香蕉炭疽菌具有拮抗作用的放线菌CY-14,通过形态特征、培养特性、生理生化特性和16S rDNA序列分析对该菌株进行了初步鉴定,并对其发酵液进行了活性评价。结果表明:经初步鉴定,该放线菌为链霉菌属Streptomyces sp.;其发酵液稀释10倍对香蕉炭疽菌的抑制率达92.5%,同时对其他8种植物病原真菌均具有较强的抑菌活性,抗菌谱较广;其发酵液热稳定性较好,经100 ℃处理2 h后,体积分数为10%的发酵液对香蕉炭疽菌的抑制率为55.7%,发酵液稀释1 000倍后仍可完全抑制香蕉炭疽菌的孢子萌发;CY-14纯发酵液对香蕉炭疽病具有一定的防效,与对照药剂1 000 mg/L百菌清的防效相当。菌株CY-14作为香蕉炭疽病的生防放线菌,具有发现新型抗生素或者活性化合物的潜能,可对其进行深入的研究。     

香蕉炭疽菌rDNA ITS区的分子鉴定与检测

 香蕉炭疽病菌(Colletordchum muscat)是一种引起香蕉采后病害的最重要病原,本研究用真菌18S~28S间的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)通用引物18SF和28SR扩增香蕉炭疽菌和其它外群真菌的基因组DNA,扩增出约510bp的片段;通过克隆测序香蕉炭疽菌的ITS全序列并与GenBank中炭疽菌属其它种的ITS序列比对,设计出香蕉炭疽菌的特异性引物ColM1和ColM2。用此特异引物可以从香蕉炭疽菌株中扩增出382bp的特异性片段,而其余20个参试菌株和香蕉组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度实验证明可以检测到目标DNA的浓度为0.1Pg。该方法可用于快速、准确和灵敏地检测香蕉炭疽菌,为快速监测组织中有无香蕉炭疽病菌潜伏侵染与及早采取防治措施提供积极的指导意义。     

基于DNA条形码技术对新疆罂粟科部分植物系统发生分析

以新疆地区4属5种罂粟科植物为研究对象,利用DNA测序技术测定植物叶绿体rbcL基因、核基因ITS,并研究将这两种特定基因联合作为DNA条形码在识别新疆地区罂粟科植物的可行性和有效性。对15条新疆罂粟科植物的ITS-rbcL序列进行信息分析,发现其基因片段多态性位点较多,种内平均遗传距离小于种间。另外,以4种毛茛属植物做外类群对31种罂粟科植物进行聚类分析。结果显示:同属植物基本聚在一起,说明这一联合片段用来鉴定罂粟科植物中属的分类阶元是可行的。所选择的ITS-rbcL片段对罂粟科植物的分类鉴定有一定的参考价值。通过研究还发现,新疆鳞果海罂粟与伊犁秃疮花的亲缘关系较该属其他植物更为接近;新疆重点保护植物红花疆罂粟与黑环罂粟为近缘种;rbcL基因由于其保守度较高,并不适合作罂粟科植物的进化标记基因。     

基于DNA条形码技术对新疆罂粟科部分植物系统发生

以新疆地区4属5种罂粟科植物为研究对象,利用DNA测序技术测定植物叶绿体rbcL基因、核基因ITS,并研究将这两种特定基因联合作为DNA条形码在识别新疆地区罂粟科植物的可行性和有效性。对15条新疆罂粟科植物的ITS-rbcL序列进行信息分析,发现其基因片段多态性位点较多,种内平均遗传距离小于种间。另外,以4种毛茛属植物做外类群对31种罂粟科植物进行聚类分析。结果显示：同属植物基本聚在一起,说明这一联合片段用来鉴定罂粟科植物中属的分类阶元是可行的。所选择的ITS-rbcL片段对罂粟科植物的分类鉴定有一定的参考价值。通过研究还发现,新疆鳞果海罂粟与伊犁秃疮花的亲缘关系较该属其他植物更为接近;新疆重点保护植物红花疆罂粟与黑环罂粟为近缘种;rbcL基因由于其保守度较高,并不适合作罂粟科植物的进化标记基因。     

明孢盘菌属分类进展及其重要的病原菌种类

明孢盘菌属(Neofabraea)中很多种类是重要的植物病原菌。该属真菌分类历史较为复杂,系统发育关系也长期存在较大的争议。本文对明孢盘菌属的分类学研究历史做了系统回顾,包括属的建立、物种组成及其命名更替和系统发育,概述了该属重要的植物病原菌种类地理分布和经济为害性,讨论了该属真菌物种的传统分类方法及分子研究方法,指出了存在的问题及今后的研究方向。     

柠檬桉内生真菌的分离及其提取物的抗细菌活性

采用组织块分离法分离柠檬桉中的内生真菌,通过菌落观察和分子生物学相结合的方法对分离到的内生真菌进行鉴定;进一步采用薄层层析-生物自显影法测定了柠檬桉内生真菌次生代谢产物的抗细菌活性。从柠檬桉中共分离鉴定得到10株内生真菌,主要分布于附球菌属Epicoccum、镰刀菌属Fusarium、炭疽菌属Colletotrichum、Rhytidhysteron、半壳霉属Leptostroma、Campylocarpon、Neofusicoccum、白腐菌属Phlebia和Dinemasporium等9个属中。抗细菌活性的测定结果表明,内生真菌Ecf-4(Rhytidhysteron sp.,MK211261)和Ecf-1(Epicoccum sp.,MK211258)表现出最强的抑菌活性,两菌对桉树青枯病菌的抑菌斑最大直径均大于10 mm;依据其R_f值的范围和抑菌斑的最大直径,内生真菌Ecf-4的抗菌活性高于Ecf-1,表现出更强的抗细菌活性,可作为候选菌株,进一步分离和鉴定其中的活性成分。     

禾谷炭疽菌CFEM效应子的生物信息学鉴定与转录分析

植物病原真菌效应子是指可以改变寄主植物细胞结构或者细胞功能的分泌蛋白或其他小分子物质。效应子对病原真菌的侵入、扩展以及致病发挥着至关重要的作用,是植物病原真菌与寄主的互作不断演化的必然结果。真菌特有的CFEM(common in several fungal extracellular membrane protein)蛋白对于病原真菌的致病性起重要作用,一些能够被分泌到胞外的CFEM蛋白被证明是病原真菌效应子。由禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)引起的玉米炭疽病是玉米上的重要病害,常年造成严重损失。本研究运用生物信息学工具对禾谷炭疽菌中的CFEM蛋白进行信号肽分析和亚细胞定位分析,进而通过转录分析明确禾谷炭疽菌CFEM蛋白的表达时期。分析结果表明,该病原真菌编码32个CFEM蛋白,其中22个具有信号肽并可分泌至胞外,为分泌蛋白。转录分析表明,10个CFEM分泌蛋白于病菌侵染时附着胞形成期表达,2个CFEM分泌蛋白于侵染后的活体寄生阶段表达,1个于死体寄生阶段表达,其余9个CFEM分泌蛋白在病菌侵染时期的3个阶段均稳定表达。结合生物信息学和转录分析结果,我们预测这22个CFEM分泌蛋白为禾谷炭疽菌致病相关的效应子(简称CFEM效应子)。明确禾谷炭疽菌中CFEM蛋白数量,预测病菌致病相关的CFEM效应子组成,可为开展病原真菌CFEM蛋白介导的病菌—寄主互作研究奠定基础,并为玉米炭疽病的防治和抗性育种研究提供参考。     

山东省不同地区玉米内生真菌的群落组成和多样性分析

为探究山东省玉米内生真菌的资源分布、群落组成及多样性,采用叶片组织分离法对山东省52个市县的玉米内生真菌进行分离纯化,通过内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析技术进行内生真菌的种属鉴定,并分析内生真菌的群落组成和多样性。结果表明,共分离到857株内生真菌,隶属25个属,其中链格孢属Alternaria的菌株数量最多,为583株,占总菌株数的68.03%,其次为镰刀菌属Fusarium有71株,占总菌株数的8.28%;大部分地区的优势属为链格孢属,少数地区的优势属为镰刀菌属、炭疽菌属Colletotrichum和弯孢属Curvularia。不同地区的内生真菌定殖率变化很大,在12.50%～100.00%之间,平均定殖率为76.15%;陵城的多样性指数和均匀度指数最高,分别为1.74和0.97;莱芜的丰富度指数最高为2.22。山东省玉米内生真菌可以分为5个类群,其中黄河流域地区内生真菌定殖率相对较高。表明山东省玉米内生真菌种类丰富,不同地区间多样性水平存在差异。     

草莓果生炭疽菌LysM效应子CfLysM2的致病功能分析

果生炭疽菌Colletotrichum fructicola侵染引起的草莓炭疽病是草莓生产中的重要病害。前期研究发现一个在果生炭疽菌侵染阶段高表达的含LysM结构域的候选效应子CfLysM2。为进一步研究CfLysM2的致病功能,运用同源重组方法构建CfLysM2缺失突变株ΔCfLysM2和回补菌株CfLysM2c。致病力测定结果表明,接种后15 d,ΔCfLysM2接种的草莓叶片病情指数显著下降。荧光定量PCR分析表明CfLysM2基因在果生炭疽菌接种草莓叶片后24 h相对表达量最高。利用转录组技术对野生型菌株(wild-type strain, WT)和ΔCfLysM2接种后24 h的草莓叶片样品进行比较分析,获得差异表达基因109个。CfLysM2的缺失导致宿主代谢途径尤其是次生代谢物生物合成通路的激活,说明CfLysM2可能在果生炭疽菌侵染草莓过程中通过靶向黄酮醇合成酶等代谢相关基因,抑制植物次生代谢产物合成及其介导的抗真菌免疫,保证其顺利侵染。该研究为揭示CfLysM2机理及对果生炭疽菌和草莓互作研究奠定了理论基础。     

草莓胶孢炭疽菌CFEM候选效应子的生物信息学鉴定及其侵染过程中的转录分析

病原真菌通常分泌效应子到寄主组织中调控寄主的生理过程,从而有利于其侵染。CFEM(common in several fungal extracellular membrane)蛋白是真菌所独有的,且与致病性密切相关。本研究利用Pfam数据库对草莓胶孢炭疽菌全基因组进行搜索,鉴定获得22个CFEM蛋白。对CFEM蛋白的信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位进行分析,结果表明仅有8个CFEM蛋白为分泌蛋白。对CFEM分泌蛋白在不同侵染阶段的转录情况进行转录组学及RT-PCR分析,结果显示8个CFEM蛋白在侵染后不同时期均有表达。其中,1个CFEM分泌蛋白于附着胞形成期特异表达,2个于活体寄生阶段特异表达,2个于死体寄生阶段特异表达。综合上述分析结果,预测这8个分泌蛋白可能为草莓胶孢炭疽菌的效应子。本研究为深入解析植物病原真菌CFEM效应子提供了理论依据。     

东省不同地区玉米内生真菌的群落组成和多样性分析

为探究山东省玉米内生真菌的资源分布、群落组成及多样性,采用叶片组织分离法对山东省52个市县的玉米内生真菌进行分离纯化,通过内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列分析技术进行内生真菌的种属鉴定,并分析内生真菌的群落组成和多样性。结果表明,共分离到857株内生真菌,隶属25个属,其中链格孢属Alternaria的菌株数量最多,为583株,占总菌株数的68.03%,其次为镰刀菌属Fusarium有71株,占总菌株数的8.28%;大部分地区的优势属为链格孢属,少数地区的优势属为镰刀菌属、炭疽菌属Colletotrichum和弯孢属Curvularia。不同地区的内生真菌定殖率变化很大,在12.50%~100.00%之间,平均定殖率为76.15%;陵城的多样性指数和均匀度指数最高,分别为1.74和0.97;莱芜的丰富度指数最高为2.22。山东省玉米内生真菌可以分为5个类群,其中黄河流域地区内生真菌定殖率相对较高。表明山东省玉米内生真菌种类丰富,不同地区间多样性水平存在差异。     

13种萜类化合物对胶孢炭疽菌和链格孢的抑制活性

炭疽菌Colletotrichum和链格孢Alternaria是引起植物病害的重要真菌,给农业生产造成巨大的损失。本研究选取13种萜类化合物,采用菌丝生长速率法对胶孢炭疽菌、链格孢进行抑菌活性分析。研究结果表明:香芹酚、丁香酚、异丁香酚、枯茗醛、百里香酚对两种病原菌有较好的抑菌活性,其中香芹酚对胶孢炭疽菌和链格孢的抑菌活性最强,IC50分别为40.89μg/mL和18.19μg/mL。本试验为植物精油和天然杀菌剂的开发利用提供理论依据。